樊麗霞

福州市第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福州 350004

癲癇是一種腦部慢性疾病，全球約超過5000 萬人受其困擾，嚴重影響了患者及其家庭的生活質量?？拱d癇發(fā)作藥物主要是緩解患者的癥狀，但約30%的癲癇患者對抗癲癇藥物有耐藥性[1-2]。癲癇的發(fā)生是一個復雜的多因素過程，其發(fā)病機制仍不十分清楚，對癲癇發(fā)生機制的深入探討對開發(fā)新的癲癇治療策略具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200nt、缺乏編碼蛋白能力的非編碼RNA。膀胱癌相關1（UCA1）的長非編碼RNA（lncRNA）是與炎癥相關的lncRNA 之一，以往的研究表明UCA1 對癲癇大鼠存在動態(tài)調節(jié)效應[3]。有發(fā)現(xiàn)在體外抑制miR-145 可防止突觸收縮并降低體內(nèi)癲癇發(fā)作的嚴重程度[4]。生物信息學預測發(fā)現(xiàn)UCA1 和miR-145 可能存在靶向關系，但UCA1 和miR-145 在癲癇細胞炎癥反應中是否存在靶向調控關系尚未見報道。因此，本研究將探究沉默和過表達UCA1 對癲癇細胞炎癥調控及其與miR-145 的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 CTX-TNA 星形膠質細胞購自LMAI Bio 公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基購自Hyclone、OPTI-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自GIBCO 公司；Lipo2000 購自Invitrogen 公司；miR-145 模擬物、miR-145 抑制劑、cDNA 反轉錄試劑盒、pcDNA3.1 質粒、psiCHECK質粒、Trizol 試劑購自賽默飛科技有限公司；Dual-Luciferase 報告基因檢測系統(tǒng)檢測試劑盒Promega 公司、熒光定量試劑盒購自百歐泰；shUCA1、CCK8試劑盒購自abcam 公司；UCA1 全序列合成及引物合成由上海生工完成；青霉素鏈霉素（雙抗）、胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CTX-TNA2 星形膠質細胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液（含D-葡萄糖4.5 g/L、碳酸氫鈉3.4 g/L、L-谷氨酰胺584 mg/L、青霉素75 mg/L、鏈霉素50 mg/L），于含有5% CO2的CO2孵育箱中，在37℃、95%濕度條件下培養(yǎng)，并用10 ng IL-1β 持續(xù)處理24 h。顯微鏡下觀察細胞為貼壁細胞。

1.2.2 細胞轉染 取對數(shù)生長期細胞接種于6 孔板，培養(yǎng)24 h 后按照操作手冊采用lipo2000 將shUCA1、pcDNA3.1-UCA1 重組質粒、pcDNA3.1 空質粒轉染入CTX-TNA 星形膠質細胞，并根據(jù)實驗需要采用lipo2000 分別或同時轉染shUCA1、miR-145 inhibitor，轉染48h 后進行實驗。

1.2.3 CCK8 檢測細胞活性 將CTX-TNA 細胞（4×103個細胞/孔）鋪在96 孔板中生長24 h。除去培養(yǎng)基，并將CCK-8 溶液加入培養(yǎng)基中，使用酶標儀在490 nm 處測量光密度（OD）值，OD 值越大，細胞活力越強。

1.2.4 熒光素酶報告實驗 通過starBase 數(shù)據(jù)庫的miRNA-lncRNA interactions 模塊預測分析UCA1與miR-145 的結合位點?；蚝铣蒛CA1 中含有miR-145 結合位點的片段，并將該片段插入pmirGLO載體。將CTX-TNA 細胞用上述構建體轉染，并與模擬NC 或miR-145 模擬物共轉染。在37℃下溫育48 h 后，收獲細胞，根據(jù)Dual-Luciferase 報告基因檢測系統(tǒng)檢測試劑盒測定熒光強度。

1.2.5 RT-qPCR RT-qPCR 反應在7900HT 快速實時PCR 系統(tǒng)上操作，實時PCR 系統(tǒng)測量各組miR-145的表達水平，以GAPDH 內(nèi)參，引物序列見表1。各組mRNA 的相對表達量通過2-ΔΔCt 進行分析。

表1 RT-qPCR引物列表

1.2.6 ELISA 實驗 收集各組細胞上清液，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測細胞上清液中炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α 的水平。繪制標準曲線，計算樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS19.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用One-Way ANONA 分析，數(shù)據(jù)以表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UCA1 對CTX-TNA2 星形膠質細胞炎癥因子的影響 與對照組、過表達空載體組、干擾空載體組、sh-UCA1 干擾組相比，pcDNA3.1-UCA1 過表達組IL-2、IL-6、TNF-α 均顯著降低（均P＜0.01）；與對照組、過表達空載體組、pcDNA3.1-UCA1 過表達組、干擾空載體組相比，sh-UCA1 干擾組IL-2、IL-6、TNF-α 均顯著增高（均P＜0.01）。見表2。

表2 各組炎癥因子的表達

2.2 UCA1 對CTX-TNA2 星形膠質細胞miR-145 表達的影響 UCA1 過表達可顯著降低CTX-TNA2 星形膠質細胞miR-145 表達水平（P＜0.01）。下調UCA1 表達可顯著增加CTX-TNA2 星形膠質細胞miR-145 表達（P＜0.01），表明UCA1 可影響CTXTNA2 星形膠質細胞miR-145 表達。見圖1。

圖1 UCA1對CTX-TNA星形膠質細胞miR-145表達的影響

2.3 UCA1 靶向結合miR-145 UCA1 基因序列上存在miR-145 的結合位點，為研究miR-145 是否是lncRNA UCA1 的功能性直接靶標，進行了雙熒光素酶報告分析。數(shù)據(jù)分析結果表明，同時轉染miR-145和野生型UCA1 質粒（UCA1WT）可顯著減弱熒光素酶活性（P＜0.01），UCA1 結合位點突變后，同時轉染miR-145 和突變型UCA1 質粒（UCA1 MUT）熒光素酶活性升高。表明UCA1 和miR-145 間存在靶向調控關系，見圖2。

圖2 UCA1靶向結合miR-145

2.4 沉默UCA1 對CTX-TNA2 星形膠質細胞炎癥因子的影響 與對照組相比，shUCA1 組CTX-TNA2 星形膠質細胞炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α 均顯著升高（P＜0.01）；與對照組相比，sh-UCA1+miR-145 抑制劑組TNF-α 無明顯統(tǒng)計學改變（P＞0.05），sh-UCA1+miR-145 抑制劑組IL-6、IL-2 顯著降低（P＜ 0.01）；與sh-UCA1 組相比，sh-UCA1+miR-145 抑制劑組IL-2、IL-6、TNF-α 明顯降低（P＜ 0.01）。見表3。

表3 各組炎癥因子的表達

3 討論

癲癇一直位列世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）重點防治的五大神經(jīng)精神疾病之一。據(jù)WHO2018 年發(fā)布的實況報道，估計我國有高達1000 萬以上的人群受累。盡管有大量抗癲癇發(fā)作藥物，但約30%的癲癇患者對抗癲癇藥物有耐藥性[1-2]。同時，許多抗癲癇藥物都有副作用，如頭暈、嗜睡和思維遲鈍。此外，現(xiàn)有藥物可以預防癲癇發(fā)作，但不能預防癲癇發(fā)生[5]。因此，尋找新的有效療法也是當前癲癇領域研究關注的熱點。

盡管近年來在癲癇發(fā)病機制方面取得了一些進展，但由于癲癇的復雜性，其發(fā)病機制仍不十分清楚，也是癲癇極難治愈的主要原因[6]。因此，對癲癇發(fā)生機制的深入認識，對開發(fā)新的癲癇治療方法具有重要意義。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，炎癥在癲癇發(fā)病機制中起著重要作用[7]。炎癥反應失調可能導致神經(jīng)連接異常和神經(jīng)網(wǎng)絡興奮過度，促進癲癇的發(fā)生和發(fā)展[8]。目前研究認為IL-1、IL-6 及腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細胞因子與癲癇有關。然而，癲癇的炎癥調控機制尚不完全清楚。

許多研究報告提示星形膠質細胞功能障礙促進癲癇的發(fā)展和進展，星形膠質細胞在癲癇的發(fā)病機制中起著關鍵作用[9]。基于文獻報道及本研究團隊既往的研究，用IL-1β 處理的CTX-TNA2 細胞可以作為研究癲癇的體外模型。本研究證明了lncRNAUCA1 通過調節(jié)miR-145 調控癲癇細胞炎癥反應，這為制定癲癇策略治療提供了新的靶點。

據(jù)報道lncRNA 的異常表達與癲癇有關，lncRNAUCA1 可抑制癲癇[10]。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNAUCA1可抑制癲癇細胞模型的炎癥反應。由于炎癥可能促進癲癇發(fā)生[11]，lncRNAUCA1 可以通過抑制炎癥抑制癲癇，但其抑制機制尚不十分清楚，有待進一步研究。

眾所周知，miRNA 作為lncRNA 的介導物，調節(jié)基因表達，已成為癲癇病因和發(fā)展的關鍵因素[12]。有學者發(fā)現(xiàn)在體外抑制miR-145 可防止突觸收縮并降低體內(nèi)癲癇發(fā)作的嚴重程度[13]。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-145 能夠調節(jié)多種疾病的信號通路[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在癲癇細胞模型中，過表達UCA1 可明顯抑制miR-145 表達（P＜0.001），沉默UCA1 可顯著促進miR-145 表達（P＜0.001），過表達UCA1 可抑制癲癇細胞炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α 的表達；證明過表達UCA1 可靶向miR-145 調節(jié)癲癇細胞的炎癥反應，miR-145 為lncRNAUCA1 的直接靶點，進而影響炎癥。

總之，對lncRNA 及其下游分子機制的研究有助于闡明癲癇的發(fā)病機制。本研究證明了lncRNAUCA1通過調控miR-145 來抑制癲癇的炎癥反應。本研究中的所有數(shù)據(jù)均來自體外試驗，但未來研究計劃將在體內(nèi)進行進一步的研究，以驗證癲癇的調節(jié)機制，為癲癇患者的治療策略提供新的靶點。