韓雨璇,張亞萍,李檸杏,張嘉華,李能秀,焦 健,才學鵬, 喬 軍,孟慶玲

(1.石河子大學動物科技學院,新疆 石河子 843002; 2.中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所,蘭州 730046)

【研究意義】幾丁質(Chitin)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-Acetyl-D-glucosamine, GlcNAc)以β-1, 4糖苷鍵連接而成的高分子聚合物[1],該聚合物是大部分真菌細胞壁、昆蟲外骨骼、無脊椎動物角質層的重要結構成分[2]。幾丁質酶(Chitinase, EC 3.2.1.14)是一種通過切割β-1,4糖苷鍵將幾丁質水解成幾丁寡糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖的糖苷水解酶,廣泛存在于生物界中[3]。幾丁質酶在絲狀真菌菌絲的結構形成、線蟲卵殼的降解等生理活動中發(fā)揮十分重要的作用[4-6],在生物防治中具有潛在的應用價值。【前人研究進展】捕食線蟲性真菌(Nematophagous fungi,NTF)作為家畜消化道寄生蟲的天敵,是最有潛力的化學藥物的替代品。近年來,由于捕食線蟲性真菌不存在化學防治的弊端,即使線蟲產生耐藥性,符合生態(tài)可持續(xù)性的需求,該菌已成為寄生蟲線蟲防控的重要研究方向。捕食線蟲性真菌分為5個類型：捕食性真菌(Predatory fungi)、殺卵型真菌(Ovicidal fungi)、內寄生型真菌(Endoparasitic fungi)、產毒素型真菌(Toxin-producing fungi)和帶有特殊攻擊裝置的真菌(Producers of special attack devices )[7]。研究證實,NTF經動物消化道后,也不會喪失掠食能力,并能有效控制未成熟階段線蟲(包括蟲卵和幼蟲)[8],且孢子在糞便中的萌發(fā)能力較強。掠食型真菌可以產生誘捕器,是殺死線蟲的關鍵工具。誘捕器由特化菌絲形成,分為黏性誘捕器(黏性菌網、黏性菌絲、黏性菌分枝、黏性菌結)和非黏性誘捕器(非收縮和收縮環(huán))[9],均通過機械力或酶促反應侵染線蟲的成蟲和幼蟲[10-11]。研究表明,胞外水解酶尤其是幾丁質酶在捕食性真菌侵染線蟲的過程中具有重要作用[12]。研究發(fā)現(xiàn),捕食線蟲性真菌產生的幾丁質酶可直接用于殺線蟲幼蟲和蟲卵[7,13]。然而,從自然界中分離的幾丁質酶酶活性較低,目前對捕食線蟲性真菌幾丁質酶的結構及功能也了解甚少。【本研究切入點】Duddingtoniaflagrans是一種最具有應用前景的捕食線蟲性真菌[14],其產生的厚垣孢子經家畜消化道和其它不良環(huán)境仍可萌發(fā)形成誘捕器,捕獲家畜糞便中的線蟲幼蟲[15-16]。體外實驗研究表明,D.flagrans具有高達96.4%的殺消化道線蟲率,殺蟲效果優(yōu)于Monacrosporiumthaumasium和Arthrobotrysrobusta[17]。對D.flagrans基因組分析表明,該菌比其它真菌含有更多與線蟲致病性相關的幾丁質酶編碼基因[18],其生產的粗酶提取物對消化道線蟲具有較強的殺滅活性[19-20]。但目前對于D.flagrans幾丁質酶的分子特征、功能及其親緣關系的研究較少。因此,開展D.flagrans幾丁質酶的結構、功能及其親緣關系研究具有重要的現(xiàn)實意義?！緮M解決的關鍵問題】近年來,D.flagrans全基因組的測序成功為研究幾丁質酶在捕食線蟲性真菌中的作用奠定基礎。本研究以D.flagrans為研究對象,克隆CTS3和CTS4幾丁質酶基因,利用生物信息學分析其編碼蛋白的性質和功能等,并對其與不同真菌來源的幾丁質酶氨基酸序列進行進化分析,為D.flagrans幾丁質酶在生物防控中的進一步研發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基及試劑

捕食線蟲性真菌D.flagrans和EscherichiacoliDH5α菌株由石河子大學動物科技學院寄生蟲實驗室保存,2×TaqPCR Master Mix、2000 bp DNA Marker均購自廣州東盛生物科技有限公司,質粒DNA小量制備試劑盒和瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自諾維森(北京)生物科技有限公司, pMD 19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。YPSSA (Yeast-phosphate-sulfate-solublestarch-agar)培養(yǎng)基：4 g 酵母提取物,1 g K2HPO4·3H2O, 0.5 g MgSO4,20 g可溶性淀粉,20 g 瓊脂,加蒸餾水至1000 mL,經121 ℃、30 min條件下高壓滅菌后傾注于滅菌玻璃培養(yǎng)皿,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設計與合成

根據GenBank發(fā)布的D.flagrans全基因組序列(GenBank登錄號： SAEB01000001.1),采用Primer 5.0 引物設計軟件設計D.flagrans幾丁質酶CTS3/CTS4編碼序列的特異性引物分別為CTS3-F(5′-TATCGGATCCATGCGGCTGTCTAGTGC-3′)和CTS3-R(5′-GACGGAGCTCTTAACGACGCGGCCTGTA-3′)、CTS4-F(5′-TATCGGATCCATGTTGTTCAAATACATC GC-3′)和CTS4-R(5′-GACGGAGCTCCTAGTTGGACAACAAGCC-3′)。引物由北京六合華大基因有限公司合成。

1.3 D.flagrans 幾丁質酶CTS3/CTS4基因的PCR擴增和克隆

將石河子大學動物科技學院寄生蟲實驗室保存的D.flagrans菌株接種于YPSSA培養(yǎng)基,在28 ℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周。取適量菌絲按照真菌基因組DNA提取試劑盒(Solabio)的操作步驟提取D.flagrans全基因組DNA,再以此為模版進行幾丁質酶CTS3/CTS4基因擴增。采用20 μL PCR 擴增反應體系：加樣量為超純水9 μL,PCR Mixture 8 μL,上下游引物各0.5 μL, cDNA 模板2 μL,進行 PCR 擴增。反應條件：97 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s,54 ℃ 40 s,72 ℃ 120 s,共35個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離,切膠回收。將回收的目的基因片段與pMD 19-T 載體4 ℃過夜連接后轉入E.coliDH5α感受態(tài)細胞,經氨芐平板篩選后挑取單菌落擴增培養(yǎng),提取質粒,經瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。將正確的質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定。

1.4 D.flagrans 幾丁質酶CTS3/CTS4基因及其編碼蛋白分子特征分析

據NCBI數據庫中其他真菌編碼CTS3/CTS4的基因序列推測相應氨基酸序列,在Expasy生物軟件利用 Protparam工具預測分析蛋白質的親水性/疏水性、分子質量、理論等電點等;通過SignalP 5.1服務器預測分析蛋白質信號肽;利用NCBI數據庫的CDD功能及SMART數據庫聯(lián)合分析幾丁質酶基因編碼蛋白催化結構域、氨基酸殘基活性位點;使用GOR4分析幾丁質酶二級結構,經SWISS-MODEL模擬幾丁質酶的空間結構。

1.5 D.flagrans 幾丁質酶CTS3/CTS4系統(tǒng)發(fā)育樹分析

使用MEGA 5.0 軟件,對D.flagrans幾丁質酶 CTS3/CTS4和其他已報道的真菌幾丁質酶序列進行多重比較(ClustalW,默認參數),并采用NJ法(Neighbor-joining, boot-strap 1000)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 D.flagrans 幾丁質酶CTS3/CTS4序列同源性分析

采用DNAMAN 生物學軟件及在線工具(https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)進行真菌幾丁質酶氨基酸序列比對,獲得序列同源性矩陣,比較各序列間的同源性。

1.7 D.flagrans 幾丁質酶CTS3/CTS4基于序列比對的保守區(qū)和特征位點分析

依據系統(tǒng)發(fā)育樹和序列相似性分析結果,從已報道的真菌幾丁質酶序列中選出適量序列,與D.flagrans幾丁質酶CTS3/CTS4進行多重序列比對,并使用GeneDoc軟件將比對結果進行展示。結合比對結果,分析D.flagrans幾丁質酶CTS3/CTS4的保守區(qū)和特征位點。

2 結果與分析

2.1 D.flagrans 幾丁質酶CTS3/CTS4基因的克隆

PCR擴增顯示,D.flagrans幾丁質酶CTS3、CTS4基因擴增目的PCR產物的分子量分別為2896和1469 bp,與預期大小完全相符(圖1)。PCR產物成功克隆后,得到陽性克隆。測序結果表明,擴增得到的DNA片段為CTS3和CTS4基因。

2.2 D.flagrans幾丁質酶CTS3/CTS4理化特征

CTS3基因CDS全長2565 bp,編碼的蛋白質由854個氨基酸殘基組成。經預測,該蛋白質分子式為C3883H6008N1022O1386S26,相對分子量為90.02 kDa,理論等電點為4.59。CTS4基因CDS全長1218 bp,編碼的蛋白質由405個氨基酸殘基組成,預測蛋白分子式為C2009H3100N532O590S13,相對分子量為44.56 kDa,理論等電點為8.69(表1)。

2.3 D.flagrans幾丁質酶CTS3/CTS4信號肽分析

SignalIP軟件預測分析顯示,2個幾丁質酶均屬于分泌型蛋白,CTS3幾丁質酶N端含有信號肽序列,位于1～25氨基酸(MRLSSAFNLLATGLLTLLSSWAVEA);CTS4幾丁質酶N端也存在信號肽,位于1～18氨基酸(MLFKYIASLAVLASSAVA)。表明其在蛋白合成后,轉運至細胞外參與代謝活動。

2.4 D.flagrans幾丁質酶CTS3/CTS4高級結構預測分析

幾丁質酶CTS3和CTS4均以無規(guī)則卷曲(Random coil)、α-螺旋(α-helix)和 β-折疊 (β-turn)為主要結構單元,分別占55.09%、15.09%、6.90%和46.91%、30.62%、6.91%。SWISS-MODEL軟件預測結果(圖2)顯示,幾丁質酶CTS3和CTS4與煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的相應幾丁質酶三級結構(2a3c.1.A)和 (2y8v.1.A)相似,具有(α/β)8的TIM桶形結構, 中心部分是平行的β-折疊組成的內桶,依次為β1～β8,由α-螺旋將其逐個連接起來,外桶由α1～α8組成,內外桶緊貼。在糖苷水解酶18家族中,底物結合區(qū)域位于保守序列β3和β4鏈形成的環(huán)狀裂隙。

M： DNA分子量標準(DNAmarker DL5000) ; 1～2： CTS3基因PCR擴增產物; 3～4： CTS4基因PCR擴增產物。M： DNA marker; 1-2：PCR products of CTS3 gene; 3-4： PCR products of CTS4 gene.圖1 D.flagrans幾丁質酶 CTS3和CTS4基因的PCR擴增結果Fig.1 Amplification products of chitinases CTS3 and CTS4 genes of D.flagrans by plasmid PCR

表1 CTS3和CTS4幾丁質酶的理化性質

圖2 D.flagrans幾丁質酶CTS3(A) 和CTS4(B)三級結構預測Fig.2 The predicted tertiary structure of chitinases CTS3 and CTS4 of D.flagrans

圖3 CTS3、CTS4與其他幾丁質酶的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree between CTS3, CTS4 and other chitinases

圖4 D.flagrans CTS3和CTS4與其他幾種捕食線蟲性真菌的幾丁質酶同源性分析Fig.4 The analysis of chitinases homology between CTS3,CTS4 of D.flagrans and other nematode predating fungi

2.5 D.flagrans幾丁質酶CTS3/CTS4的系統(tǒng)發(fā)育樹分析及序列同源性分析

將D.flagrans幾丁質酶CTS3和CTS4與18個分別來源于真菌的幾丁質酶進行多重序列比對,構建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析其同源性。從圖3可看出,CTS3、CTS4均與來源于Arthrobotrysflagrans的幾丁質酶親緣關系更近。從序列同源性分析結果可知,CTS3和CTS4分別與來源于A.flagrans(RVD90058)、A.flagrans(RVD86427)的幾丁質酶同源性最高,達到83.8%(圖4)。次之是來源于Thermomyceslanuginosus的幾丁質酶,同源性為83.2%。

2.6 D.flagrans幾丁質酶CTS3/CTS4功能結構域分析

利用SMART軟件對CTS3/CTS4幾丁質酶序列分析發(fā)現(xiàn),2個幾丁質酶均含糖苷水解酶18家族結構域(Glyco-hydro-18),屬于糖苷水解酶18家族蛋白。幾丁質酶CTS3氨基酸序列的第32～311位為糖苷水解酶18家族結構域;幾丁質酶 CTS4氨基酸序列的第34～342位為糖苷水解酶18家族結構域。使用NCBI數據庫的CDD功能進行保守功能域分析,幾丁質酶CTS3存在1個 LysM受體結合域(圖5)。此外,CTS3 第 248～251位的SIGG為底物結合位點,第163～170位的DGFDLDLE為水解酶催化活性位點;CTS4第212～215 位 的SIGG為底物結合位點,第162～169位的 DGFDLDFE為水解酶催化活性位點(圖6)。

3 討 論

D.flagrans被譽為最有前途的捕食線蟲性真菌,其在捕食線蟲過程中分泌的侵蝕性胞外水解酶,尤其是幾丁質酶在殺死線蟲幼蟲及阻止其卵的孵化方面發(fā)揮重要作用,并且該菌產生的厚垣孢子經家畜消化道仍可存活[23],其特性在生防控制家畜胃腸道線蟲病害方面具有很大潛力。幾丁質是線蟲表皮及其卵殼的主要成分,捕食線蟲性真菌侵襲線蟲要先降解線蟲表皮。自1994年從少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)中純化絲氨酸蛋白酶PII并證明其具有降解線蟲角質層作用[24]以來,已經陸續(xù)從包括D.flagrans在內的其他捕食線蟲性真菌中成功純化、鑒定出同樣具有殺線蟲活性的胞外水解酶[25-28]。目前尚未對D.flagrans中發(fā)現(xiàn)的幾丁質酶進行深入研究。本研究對D.flagrans中2個重要的幾丁質酶基因進行分子特征與親緣關系分析,將為研發(fā)新型家畜消化道線蟲病生防制劑提供理論依據。

圖5 D.flagrans 幾丁質酶CTS3(A)和CTS4(B)的功能結構域分析Fig.5 Analysis of the conserved domains in chitinases CTS3(A) and CTS4(B) of D.flagrans

黑色部分為高度同源(100%)的區(qū)域,中間空白部分為幾丁質酶間的可變區(qū)域,***表示糖苷水解酶18家族保守的催化結構區(qū)域和幾丁質結合結構域。Areas shaded in black are high degree homology (100%) and unshaded areas are regions of variability between the chitinases.*** indicates the conserved catalytic domains of glycosyl hydrolase, family 18 and chitin-binding domains.圖6 D.flagrans與其他不同真菌來源幾丁質酶氨基酸序列比對Fig.6 Alignment of amino acid sequences of D.flagrans and other chitinases from different fungal sources

本研究對D.flagrans幾丁質酶CTS3和CTS4基因序列分析顯示,D.flagrans幾丁質酶CTS3/CTS4基因CDS分別編碼由854、405個氨基酸殘基組成的蛋白質。D.flagrans幾丁質酶CTS3和CTS4的氨基酸序列從N端起始依次含有信號肽(Signal peptide)、底物結合位點(CBD)和幾丁質結合域(ChBD)[29]。2個幾丁質酶均為含有信號肽的分泌型蛋白,信號肽氨基酸序列分別在其N端的第1～25和第1～18位。分子特征分析顯示,幾丁質酶CTS3和CTS4含有幾丁質酶催化結構域的2個高度保守序列SIGG和DGFDLDXE及1個典型的(α/β)8桶狀結構域,屬于糖苷水解酶18家族(GH18)。分子結構分析表明,幾丁質酶CTS3和CTS4三級結構具有(α/β)8的TIM桶形結構, 中心部分為平行的β-折疊組成的內桶,外桶由α1～α8組成;底物結合區(qū)域位于保守序列β3和β4鏈形成的環(huán)狀裂隙。系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示,D.flagrans幾丁質酶CTS3和CTS4與昆蟲致病菌幾丁質酶的遺傳距離較近,說明它們的進化關系更接近,推測它們在殖入宿主的過程中發(fā)揮著類似功能[30-31]。D.flagrans產生的幾丁質酶CTS3則與親緣關系較近的來源于Arthrobotrysflagrans(RVD90058)的幾丁質酶單獨形成一個小分支,提示CTS3幾丁質酶與CTS4在遺傳進化上存在一定的差異。

4 結 論

Duddingtoniaflagrans幾丁質酶CTS3和CTS4均含有信號肽,均含有催化域保守基序 SIGG和DGXDXDWE。分子結構分析表明,幾丁質酶CTS3和CTS4三級結構具有(α/β)8的TIM桶形結構, 中心部分為平行的β-折疊組成的內桶,外桶由α1～α8組成;底物結合區(qū)域位于保守序列β3和β4鏈形成的環(huán)狀裂隙。

作為一種在家畜寄生蟲病生物防治方面具有廣闊應用前景的捕食線蟲性真菌,D.flagrans幾丁質酶在侵染線蟲過程中發(fā)揮了重要作用,是一種極具應用潛力的生物防控制劑研發(fā)對象,然而有關捕食線蟲性真菌幾丁質酶的進化及生物學功能研究相對較少。因此開展捕食線蟲性真菌幾丁質酶基因的克隆、表達及生物學功能等相關基礎研究,對于開發(fā)新型、高效的家畜消化道線蟲病生物防控制劑具有重要的意義。