林俊彬,嚴(yán)俊杰,韓 星,趙 金,甘 穎,苗人云,馮仁才,李 斐,賴學(xué)飛,仝宗軍,甘炳成

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所,成都 610213;2.成都農(nóng)業(yè)科技中心,成都 610213;3.金堂縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備產(chǎn)業(yè)園管理委員會(huì),成都 610407;4.四川田嶺澗生物科技發(fā)展有限公司,成都 610400)

【研究意義】杏鮑菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹側(cè)耳,分類學(xué)屬于真菌界擔(dān)子菌門傘菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬[1],是我國(guó)工廠化栽培的主要食用菌。2020年全國(guó)杏鮑菇工廠化栽培產(chǎn)量2.13×106t,占食用菌總產(chǎn)量的5.26%,略低于金針菇的產(chǎn)量2.28×106t,工廠化生產(chǎn)的食用菌產(chǎn)量排名第二[2]。實(shí)際生產(chǎn)中,杏鮑菇從栽培到采收需要大約2個(gè)月,菌種類型、菌種質(zhì)量、培養(yǎng)料配方以及出菇過程中溫度、光照、氣體組成、空氣濕度等環(huán)境因子均會(huì)影響子實(shí)體的性狀[3],其中菌種本身的性質(zhì)是最重要的影響因素之一[4]。通過建立菌株的分子標(biāo)記與子實(shí)體性狀之間的聯(lián)系,可以方便快捷地在菌絲時(shí)期對(duì)杏鮑菇的性狀進(jìn)行預(yù)測(cè),對(duì)遺傳多樣性的分析可為雜交育種的親本選擇提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】以往對(duì)食用菌菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析多采用RAPD、ISSR等第二代分子標(biāo)記技術(shù)[5]。杏鮑菇在全國(guó)范圍內(nèi)栽培廣泛,但不同地方的杏鮑菇存在差異,包括子實(shí)體的形狀、產(chǎn)量、最適環(huán)境等,相同的品種在不同環(huán)境也會(huì)有一定差異,加之菌種沒有統(tǒng)一的命名、保藏、管理,所以“同種異名、同名異種”現(xiàn)象較為嚴(yán)重,使杏鮑菇的遺傳育種工作進(jìn)展緩慢[6]。近年來,分子標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展,被廣泛應(yīng)用于食用菌種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。宿紅艷等[7]利用RF-RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì)5份杏鮑菇菌株進(jìn)行遺傳學(xué)差異分析,并將菌株分為2組,是國(guó)內(nèi)采用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)杏鮑菇進(jìn)行遺傳多樣性分析最早的報(bào)道。楊和川等[6]利用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)27份杏鮑菇菌株進(jìn)行分析,將菌株分為4類。隨后楊和川等[8]利用RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì)10份杏鮑菇菌株進(jìn)行分析,將菌株分為3個(gè)類群。劉曉紅等[9]、尚曉冬等[10]、王波等[11]、許峰等[12]、李瑩等[13]、陸娜等[14]、李小艷等[15]采用第二代標(biāo)記技術(shù)也對(duì)杏鮑菇進(jìn)行遺傳多樣性分析。通過PCR和凝膠電泳進(jìn)行分析的第二代分子標(biāo)記技術(shù),存在工作量大、標(biāo)記數(shù)量少等缺點(diǎn),難以實(shí)現(xiàn)精度更高的遺傳多樣性分析。沈穎越等[16]利用SNP標(biāo)記對(duì)20份金針菇菌株進(jìn)行分析,將菌株分為5個(gè)亞群,并將自然栽培和工廠化栽培的菌株分為不同的亞支,證明以SNP為代表的第三代分子標(biāo)記技術(shù)在食用菌資源遺傳多樣性鑒定上潛力巨大?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于測(cè)序技術(shù)的第三代分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于杏鮑菇種質(zhì)資源分析的研究還未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究篩選出適宜工廠化栽培的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)杏鮑菇菌株,為后期的雜交育種尋找合適的親本。基于重測(cè)序技術(shù)對(duì)20份從全國(guó)收集到的杏鮑菇菌株進(jìn)行全基因組重測(cè)序,通過SNP位點(diǎn)進(jìn)行遺傳距離分析、菌絲生長(zhǎng)速度以及子實(shí)體性狀的比較研究,為杏鮑菇種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)利用、品種鑒定以及雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基制備

20份杏鮑菇菌株基本信息見表1。母種培養(yǎng)基(1 L)：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂。栽培料配方：木屑38%、玉米芯30%、麩皮20%、豆粕5%、玉米粉5%、碳酸鈣1%、石灰1%,含水量65%,pH 6～7。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及全基因組測(cè)序 收集20份杏鮑菇菌株的菌絲,采用CTAB法進(jìn)行DNA提取,然后送武漢希望組生物科技有限公司進(jìn)行文庫(kù)制備與高通量測(cè)序。采用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,對(duì)下機(jī)得到的二代 Raw data 使用fastq軟件進(jìn)行質(zhì)控得到 Clean data[17]。

1.2.2 參考基因組序列比對(duì) 利用BWA軟件將測(cè)序獲得的過濾后數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上[18],比對(duì)結(jié)果采用經(jīng) GATK MarkDuplicates去除重復(fù)[19]。

表1 供試杏鮑菇菌株編號(hào)及來源

1.2.3 SNP/InDel檢測(cè)及遺傳多樣性分析 采用 GATK HaplotypeCaller 進(jìn)行SNP檢測(cè),過濾標(biāo)準(zhǔn)為測(cè)序深度過濾(--min-meanDP>5),MAF (Minor allele frequency)>0.05,Call rate>80%,并對(duì)檢測(cè)到的SNP/InDel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用MEGA 11軟件對(duì)SNP數(shù)據(jù)采用鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Bootstrap method 1000次,其他參數(shù)默認(rèn)),同時(shí)計(jì)算菌株之間的遺傳距離[20]。

1.2.4 供試菌株生長(zhǎng)速度及聚落形態(tài)試驗(yàn) 將活化好的菌種用5 mm打孔器取接種塊接種到新的培養(yǎng)皿,待所有培養(yǎng)皿中接種塊新萌發(fā)菌絲生長(zhǎng)至培養(yǎng)基表面時(shí)畫起始線,每隔24 h用記號(hào)筆在菌絲生長(zhǎng)前端劃線,連續(xù)劃線5 d,測(cè)量每天的生長(zhǎng)距離,計(jì)算平均生長(zhǎng)速度(mm/d)。

1.2.5 栽培方法 栽培方法參照黃岳磊等[21]、王路朋等[22]的方法,出菇試驗(yàn)采用墻式袋栽的方式在成都匯菇源生物科技有限公司進(jìn)行,疏蕾后每袋保留1個(gè)杏鮑菇子實(shí)體。

1.2.6 子實(shí)體數(shù)量性狀測(cè)定 數(shù)量性狀測(cè)試方法參照于海龍等[23]的方法,子實(shí)體不同部位名稱及數(shù)量性狀測(cè)定方法見圖1和表2。

1.2.7 子實(shí)體質(zhì)構(gòu)分析 子實(shí)體成熟后,取菌柄中間位置進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。質(zhì)構(gòu)測(cè)試參數(shù)設(shè)定：測(cè)試前速度2.00 mm/s,測(cè)試速度1.00 mm/s,形變模式,目標(biāo)30.0%,5.0 s,觸發(fā)值5 gf。采用p2探頭,在上述測(cè)定條件下對(duì)20份杏鮑菇菌株的子實(shí)體硬度、脆度、咀嚼性和膠著性進(jìn)行測(cè)定分析,每個(gè)項(xiàng)目5個(gè)重復(fù)。

表2 子實(shí)體數(shù)量性狀測(cè)定方法

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Execl進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理,使用GraphPad Prism 8、TBtools[24]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 20份杏鮑菇資源的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量及與參考基因組比對(duì)結(jié)果

由表3可知,原始數(shù)據(jù)Raw reads數(shù)量為26 583 674～36 314 168,過濾后的Clean reads數(shù)量為26 428 896～36 108 006,質(zhì)量值大于30的范圍是91.51%～94.04%,說明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量比較高。將20份材料的重測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組(PleurotuseryngiiJKXB130DA,NCBI Accession： QCWS0000 0000)后,比對(duì)率范圍是83.27%～89.84%,覆蓋度范圍是92.43%～99.40%,覆蓋深度范圍為66.47～89.77,說明20份菌株的測(cè)序數(shù)據(jù)基本可以覆蓋參考基因組,比對(duì)文件用于后續(xù)分析較為可靠。經(jīng)過GATK檢測(cè),20份材料檢測(cè)到InDel數(shù)量范圍為98 544～112 652,SNP數(shù)量為182 952～492 504,具有較好的多態(tài)性。

2.2 遺傳多樣性分析

如圖2～3所示,當(dāng)遺傳距離大于0.08時(shí),20株杏鮑菇菌株被聚為6類,類群Ⅰ包括菌株P(guān)e01,類群Ⅱ包括菌株P(guān)e15、Pe22、Pe19,類群Ⅲ包括菌株P(guān)e16,類群Ⅳ包括菌株P(guān)e02,類群Ⅴ包括菌株P(guān)e03、Pe05、Pe09、Pe10、Pe11、Pe13、Pe20、Pe23、Pe06、Pe08、Pe07、Pe24、Pe14,類群Ⅵ包括菌株P(guān)e25。其中,類群Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的相似度比較高,結(jié)合20份菌株的來源,說明我國(guó)大部分地區(qū)和工廠栽培的杏鮑菇遺傳背景比較接近,僅有少數(shù)遺傳距離稍遠(yuǎn)的菌株分布在不同地區(qū)。

圖2 20份杏鮑菇菌株的N-J進(jìn)化樹Fig.2 The neighbor-joining phylogenetic tree for the strains of 20 P.eryngii

表3 20份杏鮑菇菌株測(cè)序數(shù)據(jù)、比對(duì)結(jié)果及SNP和InDel統(tǒng)計(jì)

圖3 20份杏鮑菇菌株的遺傳距離熱圖Fig.3 The heatmap of genetic distance for the strains of 20 P.eryngii

2.3 菌絲生長(zhǎng)速度比較

由圖4可知,杏鮑菇菌株P(guān)e01單獨(dú)作為1個(gè)類群,菌絲生長(zhǎng)速度明顯慢于其他類群;類群Ⅱ3個(gè)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度最快,也相對(duì)接近;其他類群菌株的菌絲生長(zhǎng)速度雖有差別但不大,與類群分布的關(guān)系不是特別密切。

圖4 不同杏鮑菇菌株菌絲生長(zhǎng)速度比較Fig.4 Comparison of mycelium growth rate among different strains of P.eryngii

2.4 杏鮑菇產(chǎn)量分析

由圖5可知,菌株P(guān)e16單獨(dú)作為1個(gè)類群,產(chǎn)量顯著低于其他類群;類群Ⅴ是包含菌株最多的類群,其包含的菌株整體產(chǎn)量普遍高于其他類群;其他幾個(gè)類群包含的菌株產(chǎn)量比類群Ⅴ低,但高于類群Ⅲ。

2.5 不同子實(shí)體數(shù)量性狀比較

由圖6可知,結(jié)合子實(shí)體長(zhǎng)度、菌蓋直徑、菌柄長(zhǎng)度、菌柄直徑4個(gè)指標(biāo)對(duì)6個(gè)類群進(jìn)行綜合分析,類群Ⅴ的4個(gè)指標(biāo)均比較突出且菌株間差異較小,只有菌株P(guān)e14的子實(shí)體長(zhǎng)度稍低;類群Ⅰ、Ⅳ最顯著的特征為菌柄長(zhǎng)度小、直徑大,表現(xiàn)為子實(shí)體粗短;類群Ⅱ子實(shí)體長(zhǎng)度較大,但菌蓋大小、菌柄長(zhǎng)度和直徑均比較小;類群Ⅲ子實(shí)體長(zhǎng)度較長(zhǎng),但菌柄直徑最小,表現(xiàn)為子實(shí)體細(xì)長(zhǎng);類群Ⅵ幾個(gè)指標(biāo)均不突出。

圖5 不同杏鮑菇菌株產(chǎn)量比較Fig.5 Comparison of yield among different strains of P.eryngii

圖6 不同杏鮑菇子實(shí)體數(shù)量性狀比較Fig.6 The quantitative characteristics of different strains of P.eryngii

2.6 不同菌株子實(shí)體質(zhì)構(gòu)特性分析

由圖7可知,結(jié)合杏鮑菇子實(shí)體硬度、脆度、咀嚼性、膠著性4個(gè)質(zhì)構(gòu)指標(biāo)對(duì)6個(gè)類群進(jìn)行綜合分析,類群Ⅴ整體的質(zhì)構(gòu)特性雖有差異,但整體表現(xiàn)最為突出;類群Ⅰ的4個(gè)指標(biāo)表現(xiàn)也比較均衡;除此之外,其他幾個(gè)類群的菌株僅有個(gè)別指標(biāo)表現(xiàn)稍好,大部分指標(biāo)均較差。

2.7 主成分分析

由圖8可知,不同類群的菌株距離均較近,其中,含有菌株最多的類群Ⅴ基本都聚集在一起,只有Pe14相隔較遠(yuǎn),但也沒有和其他類群聚到一起;類群Ⅱ的3個(gè)菌株距離也相對(duì)較近;其他幾個(gè)只含有1個(gè)菌株的類群分布在不同位置,其中類群Ⅰ的菌株P(guān)e01與其他所有菌株相隔最遠(yuǎn),說明Pe01的性狀表現(xiàn)與其他菌株相差較大。

3 討 論

3.1 遺傳多樣性分析

相比傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù),全基因組重測(cè)序技術(shù)可以準(zhǔn)確、方便地產(chǎn)生大量的SNP和InDel標(biāo)記,已經(jīng)在許多動(dòng)植物上被應(yīng)用于進(jìn)化、生物學(xué)性狀的關(guān)聯(lián)分析。沈穎越等[16]使用重測(cè)序技術(shù)對(duì)22份金針菇菌株進(jìn)行遺傳距離分析,不同類群的SNP和InDel標(biāo)記的數(shù)量均比較接近。施肖堃等[25]對(duì)18個(gè)雙孢蘑菇核心種質(zhì)進(jìn)行重測(cè)序以及SNP、SV檢測(cè),證明國(guó)內(nèi)的As2796系列菌種與國(guó)外的U1系列菌種是兩類區(qū)別明顯的品系。沈秀芬等[26]利用InDel標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)44份香菇菌株進(jìn)行分析,結(jié)果顯示栽培菌株和野生菌株會(huì)聚為不同分支,并且將香菇劃分為3個(gè)類群?；谥販y(cè)序以及SNP位點(diǎn)對(duì)杏鮑菇進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究尚未見報(bào)道,而本研究對(duì)20份杏鮑菇菌株進(jìn)行了全基因組重測(cè)序,平均數(shù)據(jù)高達(dá)3.1 Gb,Q30≥91.51%,GC含量正常,基因組覆蓋率達(dá)92.43%以上,20份杏鮑菇菌株共獲得182 952以上的SNP位點(diǎn),具有豐富的多態(tài)性,說明重測(cè)序技術(shù)結(jié)合SNP位點(diǎn)的檢測(cè)適用于杏鮑菇的遺傳多樣性分析。在遺傳距離大于0.08的條件下,20份杏鮑菇菌株被劃分為6個(gè)類群,綜合其SNP數(shù)量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)不同類群菌株的SNP存在著較大差異,且同一類群內(nèi)SNP數(shù)量比較接近,說明SNP的多態(tài)性水平與遺傳多樣性緊密相關(guān)。本研究證明了采用SNP多樣性分析進(jìn)行菌株間遺傳多樣性分析的可行性,如果能對(duì)更多的菌株進(jìn)行重測(cè)序并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行更加深入的分析,可以對(duì)不同菌株的最初來源以及分化途徑有更清晰的認(rèn)識(shí)。

圖7 不同杏鮑菇子實(shí)體質(zhì)構(gòu)分析Fig.7 Texture analysis of the fruiting bodies of different strains of P.eryngii

圖8 20份杏鮑菇菌株性狀的主成分分析Fig.8 Principal component analysis of characteristics of fruiting bodies of different strains of 20 P.eryngii

3.2 子實(shí)體性狀分析

進(jìn)行遺傳多樣性的研究過程中,除了采用SSR、RAPD、SNP等分子標(biāo)記技術(shù),表型性狀也是非常重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。物種的表型性狀是進(jìn)行資源收集、評(píng)價(jià)、利用的基礎(chǔ),其對(duì)資源的綜合評(píng)價(jià)以及雜交育種親本的選擇具有重要的參考意義[27]。目前,表型性狀研究在植物中的應(yīng)用較為成熟,在食用菌中也有一定應(yīng)用[28],在金針菇[29]、大球蓋菇[30]、豬肚菇[31]等許多品種上均有報(bào)道。但在杏鮑菇中將表型性狀、子實(shí)體質(zhì)構(gòu)指標(biāo)聯(lián)合共同作為參考指標(biāo)對(duì)杏鮑菇菌株進(jìn)行多樣性分析的研究尚未見報(bào)道。本研究對(duì)20份杏鮑菇菌株的菌絲生長(zhǎng)速度、產(chǎn)量、子實(shí)體長(zhǎng)度、菌蓋直徑、菌柄長(zhǎng)度、菌柄直徑、硬度、脆度、咀嚼性、膠著性10個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析,不同類群在同一性狀下的表現(xiàn)均有差異,且表現(xiàn)為同一類群內(nèi)菌株性狀接近。將所有指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析后,同一類群的菌株比較明顯的聚集在一起,且不會(huì)與其他類群混在一起,說明研究所選取的性狀指標(biāo)能很好地代表杏鮑菇子實(shí)體性狀。如果能夠借助表型分析設(shè)備采集到更多的性狀指標(biāo),與分子標(biāo)記聯(lián)合進(jìn)行分析,可以對(duì)品種鑒定、性狀預(yù)測(cè)、雜交育種等提供基礎(chǔ)的技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

通過全基因組重測(cè)序得到的SNP標(biāo)記對(duì)20份杏鮑菇資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,并對(duì)菌絲、產(chǎn)量、子實(shí)體性狀進(jìn)行綜合考量,發(fā)現(xiàn)通過SNP標(biāo)記可以將20份杏鮑菇菌株劃分為6個(gè)類群,并與產(chǎn)量、子實(shí)體數(shù)量性狀、質(zhì)構(gòu)等方面有較好的一致性,對(duì)所有性狀數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果和SNP標(biāo)記結(jié)果也有較好的一致性。在后續(xù)的工作中,可以在類群Ⅴ中選擇1份菌株作為1個(gè)親本,同時(shí)根據(jù)育種目的在其他類群中選擇菌株進(jìn)行雜交,以獲得不同類群菌株的優(yōu)良性狀,適應(yīng)不同的栽培條件或其他情況。