魏思東 陳凱歌 張繼翔 軒娟娟 王耀權(quán) 苗舜 趙開心 王維偉 陳國勇

河南省人民醫(yī)院，河南大學(xué)人民醫(yī)院，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 （鄭州 450003）

器官移植術(shù)后需長期使用抗排斥藥物來防止排斥反應(yīng)發(fā)生，如何降低和減少排斥反應(yīng)是移植后患者長期生存的重要任務(wù)［1-2］。其關(guān)鍵在于肝移植排斥反應(yīng)機制的深入研究，在排斥反應(yīng)中單核細胞釋放炎癥因子，活化淋巴細胞分泌細胞因子導(dǎo)致肝損傷，但巨噬細胞具有廣泛的異質(zhì)性［3］，每個細胞亞群的功能分類及作用尚不完全清楚。本研究通過建立大鼠肝移植排斥模型，首次發(fā)現(xiàn)移植肝巨噬細胞分為9 個功能亞群，白細胞分化抗原74（cluster of differentiation 74，CD74）陽性的巨噬細胞亞群和CXC 趨化因子配體9（C-X-C motif chemokine ligand 9，CXCL9）陽性的巨噬細胞亞群排斥反應(yīng)中明顯升高，提示巨噬細胞的抗原呈遞亞群和趨化亞群是肝移植排斥反應(yīng)防治的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組處理 健康雄性Lewis 大鼠和棕色挪威（brown norway，BN）大鼠，來源于北京維通利華生物有限公司［SCXK（京）2016?0006］，體質(zhì)量260 ～ 300 g，處置符合鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標準（倫理許可號：U2004124）。分組：免疫耐受組（B?B），將BN 大鼠供體的肝臟移植至BN 大鼠受體［4］，供體6 只，受體6 只；免疫排斥組（L?B），將Lewis 大鼠供體的肝臟移植至BN 大鼠受體［5-6］，供體6 只，受體6 只。

1.2 肝移植模型建立 采用單人裸眼操作的門脈優(yōu)先二袖套法建立大鼠肝移植模型，供體肝臟采用0 ～ 4 ℃的冷生理鹽水灌注后獲取。受體肝臟先阻斷并離斷門靜脈，受體門靜脈和供體門靜脈套管吻合，套管完成后阻斷肝下下腔靜脈和肝上下腔靜脈，移除受體肝臟，吻合肝上下腔靜脈后開放肝上下腔靜脈和門靜脈，肝下下腔靜脈套管完成后開放，動脈不吻合，膽管采用支架管插入法吻合，見文獻［7-8］。

1.3 標本獲取 移植術(shù)后1 周獲取肝臟及血液標本，血液標本進行肝功能檢測，新鮮冷藏肝臟標本行單細胞測序和新鮮肝臟標本?80 ℃冷凍行高通量檢測，部分標本于室溫下使用4%多聚甲醛固定并嵌入石蠟，用于組織學(xué)及免疫組化檢測。

1.4 高通量測序 新鮮肝臟組織獲取后?80 ℃保存，高通量RNA 測序時統(tǒng)一處理為勻漿液后室溫提取RNA 溶液，使用StringTie 將Mapping 到基因組上的序列進行組裝，使用GffCompare 與已知基因模型進行比較，StringTie 與已知的基因模型評估基因的表達量，進行基因表達差異分析，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.5 單細胞測序 新鮮肝臟組織進行單細胞RNA測序（Single?Cell RNA Sequencing）。于核酸保存液中低溫運輸，化學(xué)法分離得到單細胞懸液，分別使用Qubit2.0 Fluorometer 和qRT?PCR 對文庫有效濃度進行定量。Illumina 測序，對單個細胞基因表達進行定量分析，首先使用官方提供初步分析軟件進行基因表達定量和細胞數(shù)目鑒定分析，然后使用通元分析流程進行后續(xù)分析，由新格元（南京）生物科技有限公司完成。

1.6 組織病理學(xué)生化檢測和免疫組化 標本固定后封蠟，切5 μm 厚蠟片，HE 染色分析病理改變，排斥反應(yīng)采用banff 分級法統(tǒng)計分析［9］。采用雷杜/長春匯力試劑盒全自動分析檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶。切片進行水合和抗原提取后，使用脫脂奶粉阻斷非特異抗原，分別加一抗：抗CD68（K200071M；1∶500；北京萊寶生物）、抗CD?74（K004121P；1∶200；北京萊寶生物）、抗CXCL9（bs?2551R；1∶200；北京博奧森生物）和抗CD14（bs?1192R；1∶500；北京博奧森生物），在4 ℃下孵育過夜，加二抗山羊抗兔 IgG?HRP 抗體（ab6721；abcam）顯色。圖像采用數(shù)字切片掃描儀（寧波江豐KFPBL12000107009）采集，每高倍視野陽性細胞進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 單細胞測序和高通量測序采用DESeq2進行基因表達差異分析，版本號：1.22.1，余下所有統(tǒng)計采用使用SPSS 22.0 進行分析，計量結(jié)果均數(shù)±標準差表示，組間差異分析采用獨立樣本t檢驗，雙邊檢驗，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細胞在大鼠肝移植排斥反應(yīng)中增加 大鼠肝移植術(shù)后1 周，發(fā)現(xiàn)免疫耐受組僅匯管區(qū)有少量的炎性細胞浸潤，肝細胞無形態(tài)學(xué)改變；而排斥組匯管區(qū)有大量炎性細胞浸潤、膽管損傷和內(nèi)皮炎性改變，肝細胞有不同程度的水腫及壞死（圖1A）。進行排斥反應(yīng)分級對比分析顯示，排斥組的Banff 分級明顯升高（圖1B）（P< 0.05）。同時肝功能檢測發(fā)現(xiàn)，排斥組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶明顯高于耐受組（圖1C）（P< 0.05）。以上結(jié)果說明模型建立符合排斥反應(yīng)研究的需要。通過CD68 陽性來鑒定巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)耐受組中僅有少量巨噬細胞存在，排斥組則有大量的巨噬細胞浸潤，匯管區(qū)更為顯著（圖1D）；進行巨噬細胞統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，排斥組陽性細胞數(shù)明顯多于耐受組（圖1E）（P< 0.05）。

圖1 CD68 陽性巨噬細胞在肝移植排斥反應(yīng)中浸潤增加Fig.1 Increased infiltration of CD68 positive macrophages in rejection of liver transplantation

2.2 巨噬細胞在大鼠移植肝內(nèi)的功能異質(zhì)性 單細胞測序?qū)Υ笫笠浦哺畏菍嵸|(zhì)細胞進行分類，發(fā)現(xiàn)單核巨噬細胞（Mononuclear phagocyte system，MPs）為最大的群體（圖2A），通過CD68 基因標記巨噬細胞（圖2B），根據(jù)功能差異UMAP 做圖，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞分為9 群（圖2C），根據(jù)基因表達量、特異性及文獻報道命名，分別為第1 群（Clec4f）、第2 群（Fggy）、第3群（G0s2）、第4群（Fcnb）、第5群（Cst3，Cd74）、第6 群（Trem2）、第7 群（Hspb1）、第8 群（Cxcl9，Cd14）及第9 群（Cxcl3）（圖2D）。CD163 為肝臟耐受性巨噬細胞，第1 群和第7 群主要為CD163 陽性巨噬細胞，其余為非CD163 陽性細胞（圖2E）。

2.3 CD74 和CXCL9 基因標記的巨噬細胞亞群在大鼠肝移植排斥反應(yīng)中升高 為了發(fā)現(xiàn)肝移植排斥反應(yīng)中升高的巨噬細胞亞群，將每個亞群中表達量前十的基因共90 個與移植肝高通量分析差異基因進行對比，發(fā)現(xiàn)這90 個基因中在排斥反應(yīng)中有64 個基因存在差異，與耐受組比較，排斥組中表達量升高的基因有53 個，表達量前十的基因分別為Acod1、Ccl7、Clec10a、Ms4a7、Cxcl9、Cxcl10、Cd74、Slpi、Cst7和Mmp9，歸屬亞群為：第8群Acod1、Cxcl9、Cxcl10 和Cst7 共4 個，第5 群Clec10a、Ms4a7和Cd74 共3 個，第7 群Ccl7，第9 群Slpi 和Mmp9。從基因表達量（圖2D）、差異倍數(shù)和統(tǒng)計學(xué)意義（圖3A）上綜合分析，排斥反應(yīng)中巨噬細胞差異基因排名第1 位是第5 群的CD74，第2 位是第8 群的CXCL9，說明CD74 和CXCL9 基因功能及其所屬的亞群可能在肝移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CD14 是炎癥反應(yīng)巨噬細胞的經(jīng)典亞群，將CD14和CD74、CXCL9 基因綜合分析發(fā)現(xiàn)，這3 個基因在MPs 中的表達明顯高于其他細胞類型（P< 0.05），進一步分析顯示CD74 在巨噬細胞第5 群以及CXCL9 和CD14 在巨噬細胞第8 群的表達明顯高于其他巨噬細胞亞群（P< 0.05）（圖3B），初步說明在移植肝內(nèi)CD74 可以標記第5 群，暫定第5群巨噬細胞為CD74 巨噬細胞，CXCL9 可以標記第8 群巨噬細胞，暫定第8 群為CXCL9 巨噬細胞，因為CD14 的表達低于CXCL9，CD14 可以輔助性標記第8 群巨噬細胞。CD74、CXCL9 和CD14 基因表達量進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，3 個基因在排斥反應(yīng)中的表達量升高具有較好的聚類現(xiàn)象（圖3C）。進一步分析CD74 和CXCL9 基因所屬的巨噬細胞亞群中表達量前十的基因聚類情況，發(fā)現(xiàn)這些基因在肝移植排斥反應(yīng)中表達量的升高情況能夠按照兩個亞群聚類（圖3D）。

2.4 CD74 陽性和CXCL9 陽性的巨噬細胞在肝移植排斥反應(yīng)中的升高 免疫組化驗證CD74 陽性和CXCL9 陽性的巨噬細胞在肝內(nèi)的變化，發(fā)現(xiàn)耐受組移植肝匯管區(qū)僅有少量CD74陽性巨噬細胞浸潤，但在排斥組匯管區(qū)可見大量CD74 陽性巨噬細胞浸潤，并且在肝血竇的CD74 陽性巨噬細胞浸潤也明顯增加（圖4A、D）（P< 0.05）。在耐受組移植肝匯管區(qū)有少量CXCL9陽性巨噬細胞浸潤，但在排斥組匯管區(qū)和肝血竇可見大量CXCL9 陽性巨噬細胞浸潤，且以匯管區(qū)更為顯著（圖4B、D）（P< 0.05）。同時發(fā)現(xiàn)CD14 在耐受組偶有表達，在排斥組匯管區(qū)表達明顯增加（圖4C-D）（P< 0.05），但其數(shù)量明顯低于CD74陽性或CXCL9陽性細胞數(shù)。

圖4 CD74 陽性巨噬細胞和CXCL9 陽性巨噬細胞亞群在肝移植排斥反應(yīng)中浸潤增加Fig.4 Increased infiltration of macrophages CD74 positive and CXCL9 positive macrophage subsets in rejection of liver transplantation

3 討論

巨噬細胞在肝臟損傷中發(fā)揮多種功能，包括細胞因子和趨化因子的分泌、白細胞粘附和吞噬作用等，巨噬細胞的抗原呈遞和細胞因子釋放能夠抑制或者促進移植物的排斥反應(yīng)［10］。本研究通過CD68 標記巨噬細胞發(fā)現(xiàn)發(fā)生排斥反應(yīng)的肝臟匯管區(qū)及肝血竇中有大量巨噬細胞浸潤。文獻報道大鼠肝移植排斥反應(yīng)中巨噬細胞浸潤明顯增加［11］，臨床肝移植排斥反應(yīng)中，肝臟內(nèi)門靜脈系統(tǒng)及肝小葉中均存在CD68 巨噬細胞浸潤，其浸潤細胞的數(shù)量與排斥反應(yīng)的嚴重程度相關(guān)［12］，且浸潤細胞的數(shù)量越多，排斥反應(yīng)越嚴重［13］，同時排斥反應(yīng)中的CD68 巨噬細胞浸潤程度超過單純炎癥引起的細胞浸潤［14］。本研究結(jié)果和以往的文獻報道的結(jié)果較為一致，說明本研究的方向具有科學(xué)性。巨噬細胞功能通常分為兩類：具有促炎功能的經(jīng)典1 型巨噬細胞（M1）和具有抗炎功能的替代性2型巨噬細胞（M2），M1 型巨噬細胞可產(chǎn)生促炎因子，M2 型巨噬細胞可產(chǎn)生抑炎因子［15］，本研究用CD163 基因來鑒別M2 型巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)CD163 表達的巨噬細胞功能并不完全一致。文獻報道抑制M1 極化能夠抑制排斥反應(yīng)［16］，過繼移植M2 能夠改善大鼠肝移植模型的急性排斥反應(yīng)［17］。但另一項研究［18］顯示表達CD163 的庫普弗細胞浸潤能抑制鈉鉀ATP 酶的活性而導(dǎo)致膽汁淤積，所以僅用M1 和M2 分型來分析巨噬細胞的功能尚不能滿足臨床需要。

本研究通過單細胞測序CD68 基因標記巨噬細胞，根據(jù)功能將其分為9個亞群，結(jié)合肝臟高通量檢測的差異基因分析，發(fā)現(xiàn)肝移植排斥反應(yīng)中巨噬細胞上調(diào)的基因前兩位為CD74 和CXCL9，其所在的巨噬細胞亞群分別是CD74為第5群和CXCL9為第8 群，說明CD74 代表的第5 群和CXCL9 代表的第8 群在肝移植排斥反應(yīng)中具有關(guān)鍵的作用。研究［19］表明在肝移植排斥反應(yīng)中，F(xiàn)OLR3 巨噬細胞升高，而CD163巨噬細胞減少，LDLR表達的髓源性抑制細胞能夠?qū)古懦夥磻?yīng)。本研究進一步細化了巨噬細胞亞群，首次發(fā)現(xiàn)CD74 巨噬細胞亞群和CXCL9 巨噬細胞亞群在肝移植排斥反應(yīng)中升高。

本研究通過免疫組化分析驗證了CD74 蛋白陽性的巨噬細胞在排斥反應(yīng)中明顯增加，同時發(fā)現(xiàn)CD74 陽性巨噬細胞主要分布于匯管區(qū)。CD74（Ⅱ類MHC 不變鏈，Ii）（MHC class Ⅱ invariant chain，Ii）是非多態(tài)性的Ⅱ型跨膜糖蛋白，CD74 參與其他非MHCⅡ類蛋白的運輸，作為巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）、D-多巴色素互變異構(gòu)酶（D-DT/MIF-2）和細菌蛋白的細胞膜高親和力受體，能夠調(diào)節(jié)T 細胞發(fā)育。CD74 激活后能夠通過絲裂原活化蛋白中的激酶1 和2 途徑和PI3K/Akt/SRC 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)導(dǎo)致細胞增殖和細胞遷移，促進炎細胞因子的分泌［20-21］。研究［22］表明CD74 是非酒精性脂肪肝的關(guān)鍵基因，但在肝移植中的表達并不清楚，發(fā)現(xiàn)CD74 陽性巨噬細胞在肝移植排斥反應(yīng)中的增加，提示CD74 陽性巨噬細胞亞群是抗原呈遞的主要巨噬細胞亞群，是阻斷排斥反應(yīng)啟動的主要細胞亞群，為抗原呈遞的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)。同時通過免疫組化發(fā)現(xiàn)CXCL9 陽性的巨噬細胞在肝移植排斥反應(yīng)的匯管區(qū)明顯增加，CXCL9 是趨化因子配體，可以通過CXCR9 招募CD8+T 細胞，同時能夠促進CD8+T 細胞的功能［23］，文獻報道表明，在肝癌中血清CXCL9 能夠作為新的標記物［24］，在肝移植排斥反應(yīng)中肝內(nèi)CXCL9 mRNA 的表達升高［25］。說明CXCL9 陽性巨噬細胞亞群的招募和促炎作用可能是肝移植排斥反應(yīng)中的重要機制，這一結(jié)果為肝移植排斥反應(yīng)中細胞招募的防治提供了理論依據(jù)。CD14 巨噬細胞表達TLR-4 和TLR-2，在肝移植排斥反應(yīng)中，肝移植受者循環(huán)單核細胞的TLR-2 和TLR-4 表達顯著升高［26］。據(jù)此分析了CD14 基因在肝移植排斥反應(yīng)和巨噬細胞亞群中的表達，發(fā)現(xiàn)CD14 基因主要表達在CXCL9 巨噬細胞上，通過基因表達分析和免疫組化發(fā)現(xiàn)，CD14 陽性的巨噬細胞在肝移植排斥反應(yīng)中增加，但數(shù)量明顯少于CXCL9 陽性巨噬細胞，說明CD14 陽性巨噬細胞的促炎作用在肝移植排斥反應(yīng)中起到一定的作用。

但該研究僅分析了排斥反應(yīng)中CD74 陽性和CXCL9 陽性的巨噬細胞亞群的基因及蛋白的表達，并沒有進行多蛋白定位的免疫熒光分析和基因干擾，同時該研究為初步研究，標本數(shù)量僅達到統(tǒng)計學(xué)差異，需進一步擴大樣本例數(shù)探索其科學(xué)價值的重要性，深入的研究將為該理論的完善和發(fā)展提供更充分的科學(xué)證據(jù)。

綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)肝臟內(nèi)巨噬細胞為9 個亞群，確定了在肝移植排斥反應(yīng)中，CD74 陽性巨噬細胞亞群和CXCL9 巨噬細胞亞群是促進肝移植排斥反應(yīng)中的關(guān)鍵亞群，為肝移植排斥反應(yīng)中巨噬細胞抗原呈遞和細胞趨化方面的防治提供了堅實理論依據(jù)，為排斥反應(yīng)中細胞的相互作用的進一步研究提供了細胞亞群及關(guān)鍵的基因線索。

【Author contributions】WEI Sidong and CHEN Kaige designed the project，established the rat model of liver transplantation，and wrote the manuscript.ZHANG Jixiang and XUAN Juanjuan established the rat model of liver transplantation and carried out ALT，AST，and pathological detection.WANG Yaoquan，MIAO Shun，and ZHAO Kai?xin carried out sample collection，single cell and high-throughput data statistical analysis.WANG Weiwei，CHEN Guoyong contributed to the work on designing the project，immunohistochemistry，and manuscript revision.