曾朝珍，慕鈺文，袁 晶，宋 娟，張海燕，康三江*

（甘肅省農業(yè)科學院 農產品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

蘋果酒是一種由蘋果汁發(fā)酵而成的酒精飲料，以其低酒精度和適口性廣受歡迎，已成為世界第二大消費量的果酒[1]。蘋果酒發(fā)酵是微生物代謝的生化過程，酵母把糖轉化為酒精、酯、酸和其他次級代謝產物，這些代謝產物對蘋果酒的感官和品質特性有重要影響[2]。蘋果酒發(fā)酵代謝產物的產生受多種因素的影響，如發(fā)酵菌株[3-5]、蘋果果汁成分[6-7]以及可同化的氮[8]等。除了以上幾個因素以外，發(fā)酵溫度也可以影響微生物的代謝，進而影響果酒風味。近年來，采用低于釀酒酵母適宜溫度（25～32 ℃）的低溫發(fā)酵（10～15 ℃）成了果酒發(fā)酵的一種新趨勢[9]。低溫可使釀酒酵母能夠通過除Ehrlich途徑之外的其他補償途徑，使氧化還原平衡多樣化，從而產生更多樣化的風味活性酯[10]。馬懿等[11]研究認為，較低溫度發(fā)酵的梨果酒酸度更低，褐變度和色澤飽和度低，澄清度更高；鄧開野等[12]研究發(fā)現(xiàn)，低溫既能有效保留荔枝酒的香氣成分，還能控制高級醇的生成；肖作兵等[13]的研究結果表明，櫻桃酒的香氣物質和有機酸在不同的發(fā)酵溫度下的種類和含量各不同。另外，一些學者也對臍橙果酒[14]、枸杞果酒[15]和香蕉酒[16]的低溫發(fā)酵工藝及揮發(fā)性香氣成分的變化也進行了研究。由此可見，發(fā)酵溫度對果酒的質量影響顯著，但目前關于發(fā)酵溫度對蘋果酒的理化成分和揮發(fā)性香氣成分的影響研究相對較少。

本研究以富士蘋果為原料，以15 ℃和25 ℃兩種不同溫度進行發(fā)酵試驗，研究發(fā)酵溫度對蘋果酒的發(fā)酵性能、理化成分和揮發(fā)性香氣成分的影響，探究不同溫度發(fā)酵蘋果酒品質特性的差異，旨在為低溫發(fā)酵蘋果酒的研發(fā)與品質提升提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母1023：由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供；富士蘋果：采自甘肅天水市；丁酸、丙酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、富馬酸、檸檬酸、蘋果酸（純度均＞98%）：上海麥克林生化科技有限公司；17種氨基酸混合標準品：日本W(wǎng)ako公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TRACE ISQ型三重四級桿氣質聯(lián)用儀（gas chromatography-triple four-stage mass spectrometry，GC-MS）：美國賽默飛世爾科技公司；Waters 2695型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國沃特斯公司；ATAGO PAL-3 型糖度計：日本愛拓公司；PB-10型精密pH計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；S433D型全自動氨基酸分析儀：德國賽卡姆Sykam公司；LRH-70型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；ZHJH-C11128型超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果酒生產工藝流程及操作要點

富士蘋果→清洗→破碎→蘋果汁→酵母接種→酒精發(fā)酵→蘋果酒

操作要點：將富士蘋果分選、洗滌、去核后進行破碎、壓榨，在壓榨好的果汁中加入偏重亞硫酸鉀（以SO2計，終質量濃度為75 mg/L），將釀酒酵母從保存的斜面培養(yǎng)基中用接種環(huán)挑取6環(huán)菌苔接種于裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h；然后將活化好的釀酒酵母接種于裝有500 mL蘋果汁的三角瓶中，接種量為6%，接種濃度為106CFU/mL，然后分別在15 ℃和25 ℃條件下厭氧靜置發(fā)酵至質量恒定。

1.3.2 理化指標分析方法

有機酸含量測定：參考胡陸軍等[17]的方法并加以改進。取2 mL樣品，10 000 r/min離心5 min后取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后通過高效液相色譜檢測有機酸的含量。Waters Atlantis C18色譜柱（250 mm×4.5 mm，5 μm），柱溫30 ℃；流動相：0.05 mmol/L H3PO4∶甲醇=95∶5（V/V）混合；流速：0.8 mL/min，檢測波長：210 nm。進樣量：10 μL。

氨基酸含量測定：參考唐柯等[18]的方法并加以改進。取1 mL樣品，用100 g/L的三氯乙酸等體積稀釋后靜置1 h，雙層濾紙過濾后10 000 r/min離心10 min，取400 μL上清液于液相樣品瓶內，通過HPLC檢測氨基酸的含量。檢測條件為流動相A（pH=7.2）：27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃（500∶0.11∶2.5，V/V）；流動相B（pH=7.2）：80.9 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈（1∶2∶2，V/V）。Agilent Hypersil ODS色譜柱（4.0 mm×250 mm，5 μm），采用梯度洗脫，洗脫程序：0 min，8% B；17 min，50% B；20.1 min，100% B；24.0 min，0% B；流動相流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長338 nm（脯氨酸檢測波長262nm）。

可溶性固形物、可滴定酸及pH：可溶性固形物采用糖度計進行測定；可滴定酸：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]測定；pH值：采用pH計測定。

酵母酒精發(fā)酵力測定[20]：采用失重法，以二氧化碳揮發(fā)產生的質量損失來衡量酵母發(fā)酵力的大小，每隔24 h稱質量一次，直至發(fā)酵結束。

1.3.3 蘋果酒揮發(fā)性香氣成分分析

蘋果酒揮發(fā)性香氣成分的測定采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用法：參考曾朝珍等[21]的方法進行測定并采用內標法進行定量。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

通過Excel 2016對試驗數(shù)據(jù)進行整理，采用IBM SPSS Statistics 24.0和Origin 2021等軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵溫度條件下酵母發(fā)酵力及蘋果酒基本理化成分變化

不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵過程中酵母發(fā)酵力及蘋果酒可溶性固形物、可滴定酸、pH等基本理化成分含量的變化影響情況見圖1。

圖1 不同發(fā)酵溫度條件下酵母發(fā)酵力（A）及蘋果酒可溶性固形物（B）、可滴定酸（C）和pH值（D）的變化Fig.1 Changes of yeast fermentation capacity (A), soluble solids (B),titratable acid (C) and pH (D) in cider under different fermentation temperature

由圖1A可知，不同發(fā)酵溫度條件下的發(fā)酵均已完成，15 ℃發(fā)酵蘋果酒的結束時間由25 ℃發(fā)酵的8 d延長至12 d。另外，酵母發(fā)酵力第4天達到最大值，且15 ℃發(fā)酵條件下的二氧化碳質量損失（30.87 g）低于25 ℃發(fā)酵（39.32 g），表明低溫對酵母的發(fā)酵動力學有影響，酵母發(fā)酵力因溫度的升高而變強，這與GAMERO A等[22]的研究結果一致。由圖1B可知，15 ℃發(fā)酵條件下的可溶性固形物消耗量比25 ℃發(fā)酵條件下的低，在25 ℃發(fā)酵條件下，蘋果酒的可溶性固形物含量0～6 d時迅速下降，而15 ℃發(fā)酵條件下，蘋果酒的可溶性固形物含量2～8 d時迅速下降，然后下降緩慢。發(fā)酵結束后，不同發(fā)酵溫度條件的下蘋果酒中可溶性固形物含量變化趨勢趨于一致，但從前期發(fā)酵過程變化趨勢可以看出，可溶性固形物消耗量隨著發(fā)酵溫度的升高而變大。由圖1C可知，在不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒的可滴定酸含量均呈先升高后降低的趨勢，最高含量均達到了4.57 g/L，發(fā)酵結束后可滴定酸含量較未發(fā)酵時略有增加，15 ℃發(fā)酵蘋果酒的最終可滴定酸含量為4.41 g/L，而25 ℃發(fā)酵蘋果酒的最終可滴定酸含量為4.53 g/L，最終可滴定酸含量因溫度的升高其含量也增加。由圖1D可知，蘋果酒發(fā)酵過程中pH值在3.97～4.19之間變化，15 ℃發(fā)酵蘋果酒的最終pH值為4.09，而25 ℃發(fā)酵蘋果酒的最終pH值為4.04，最終pH因溫度的升高其含量降低。以上結果表明，酵母發(fā)酵力、可溶性固形物消耗量及可滴定酸與發(fā)酵溫度呈正相關，而pH與發(fā)酵溫度呈負相關。

2.2 不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵的蘋果酒中有機酸含量分析

不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵的蘋果酒中蘋果酸、檸檬酸、丁酸、乳酸、富馬酸、琥珀酸、乙酸及丙酸含量見圖2。

圖2 不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒有機酸含量分析結果Fig.2 Analysis results of organic acid contents in cider under different fermentation temperature

由圖2可知，不同溫度發(fā)酵蘋果酒中有機酸的種類和含量都不同。15 ℃發(fā)酵的蘋果酒中蘋果酸、檸檬酸、丁酸和富馬酸含量較高，分別為3.61 g/L、0.15 g/L、0.07 g/L和0.02 g/L；而25 ℃發(fā)酵的蘋果酒含有較高的乳酸、琥珀酸、乙酸及丙酸，其含量分別為3.02 g/L、1.36 g/L、0.30 g/L和0.07 g/L。由以上結果可知，酵母菌會因發(fā)酵溫度的影響而使其代謝發(fā)生變化。蘋果酸在蘋果汁中始終站主導地位[23-24]，在蘋果汁發(fā)酵蘋果酒時，發(fā)酵溫度越低，蘋果酸的含量降低不顯著，而發(fā)酵溫度越高，其含量降低越顯著。在發(fā)酵過程中，蘋果酸作為一種碳源可被酵母菌分解利用并轉化為其他有機酸[25]。在不同種類的有機酸中，乳酸對蘋果酒的柔軟感有積極的影響，而琥珀酸則有咸味和苦味[26]。檸檬酸雖然不是有機酸中最酸的，但是一些研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸對水果酸性的貢獻率高于蘋果酸[27]。琥珀酸可以由蘋果酸在厭氧條件下轉化和一些氨基酸的分解而形成，是酵母菌在發(fā)酵過程中形成的一種常見代謝物[27]。乙酸是酒類中的主要揮發(fā)酸，其特有的味道會對人的舌后部產生較強的刺激；丙酸、丁酸及富馬酸在果酒中的含量極低，對果酒的酸味影響很小。另外，由于這些酸類化合物均具有極高的閾值，它們不會給蘋果酒帶來不良影響[28]。

2.3 不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒中氨基酸含量的變化

不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵的蘋果酒中氨基酸含量見圖3。

圖3 不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒中氨基酸含量分析結果Fig.3 Analysis results of amino acid contents in cider under different fermentation temperature

由圖3可知，蘋果酒中含17種氨基酸15 ℃發(fā)酵蘋果酒中半胱氨酸（Cys-s）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、異亮氨酸（Ile）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、天冬氨酸（Asp）、蛋氨酸（Met）和脯氨酸（Pro）含量相對較高，其中甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）含量相對較高，分別為7.37 mg/L、6.48 mg/L和5.11 mg/L；25 ℃發(fā)酵蘋果酒中絡氨酸（Tyr）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）和組氨酸（His）含量相對較高，其中纈氨酸（Val）、組氨酸（His）和蘇氨酸（Thr）含量相對較高，分別為10.99 mg/L、4.82 mg/L和2.84 mg/L。

一些研究認為游離態(tài)氨基酸是具有味覺活性的物質，谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸呈現(xiàn)鮮味，蘇氨酸、組氨酸、絲氨酸、丙氨酸和脯氨酸呈現(xiàn)甜味，蛋氨酸、精氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸呈現(xiàn)苦味，苯丙氨酸和酪氨酸呈現(xiàn)芳香味[29]。氨基酸作為蘋果酒中風味成分之一，其含量高低將會對蘋果酒口感及風味的縱深度與復雜性產生直接的影響。氨基酸本身除了呈現(xiàn)出鮮、甜、苦、鮮等多種味感，給蘋果酒提供豐富飽滿的味覺層外，還與酒中的醇類、酯類、有機酸、羰基化合物和萜烯化合物等協(xié)同構成了蘋果酒的特有風味，賦予了蘋果酒較高的營養(yǎng)價值。綜上，不同品種發(fā)酵蘋果酒之間氨基酸存在差異，可以用氨基酸的種類和含量作為判別蘋果酒產品的指標。

2.4 不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒揮發(fā)性香氣成分的變化

不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒揮發(fā)性香氣成分含量見表1。

由表1可知，在15 ℃和25 ℃條件下發(fā)酵的蘋果酒在每種香氣類別（酯類＞醇類＞酸類）的揮發(fā)性化合物總含量上表現(xiàn)出基本相同的行為，但各組之間的香氣特征有所不同。蘋果酒所有類別的揮發(fā)性化合物中，酯類物質的含量占主導地位，15 ℃、25 ℃條件下發(fā)酵蘋果酒的總酯含量分別為4 576.62 μg/L、2 664.06 μg/L。總酯根據(jù)其化學結構可分為脂肪酸乙酯（癸酸乙酯、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、己酸乙酯和月桂酸乙酯）、乙酸酯（乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯、乙酸丁酯和乙酸己酯）和高級醇酯（辛酸異戊酯）。具體而言，在15 ℃發(fā)酵的蘋果酒中脂肪酸乙酯比25 ℃發(fā)酵的蘋果酒中脂肪酸乙酯更豐富，其中含量相對較高的是癸酸乙酯和辛酸乙酯。癸酸乙酯和辛酸乙酯屬于中鏈脂肪酸乙酯，是最豐富的揮發(fā)性香氣物質，占蘋果酒總芳香族化合物含量的50%以上，這與XU J N等[30]的研究結果一致。另外，醇是蘋果酒中含量豐富的另一類主要揮發(fā)性物質。高級醇被認為是酯的最重要的前體之一，但過量的高級醇可能會對最終產品的質量產生不利影響[9]。本試驗中發(fā)酵蘋果酒中總的高級醇含量隨著發(fā)酵溫度的降低而降低，由25 ℃發(fā)酵蘋果酒的3 428.95 μg/L降低為15 ℃發(fā)酵蘋果酒3 297.05 μg/L，其中3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、1-己醇在發(fā)酵后的蘋果酒中含量相對較高。大多數(shù)高級醇是在酵母發(fā)酵過程中由氨基酸降解而來的[31]，高級醇根據(jù)其濃度的不同會對果酒的感官特性有正面或負面的影響。已有學者研究證明，低溫發(fā)酵會在果酒中產生低濃度的高級醇[32]。在本研究中，該酵母在蘋果酒發(fā)酵中也表現(xiàn)出了相同的行為。羧酸是蘋果酒發(fā)酵中形成的一類揮發(fā)性化合物。15 ℃條件下發(fā)酵蘋果酒的脂肪酸總含量（703.53 μg/L）高于在25 ℃條件下發(fā)酵蘋果酒的脂肪酸總含量（226.15 μg/L）。其中，己酸、辛酸和癸酸是蘋果酒中檢測到的主要脂肪酸，它們是脂質氧化的產物，對此可能的解釋來自于釀酒酵母的脂質代謝。中鏈脂肪酸是酒精發(fā)酵過程中脂質合成的副產物，與其他弱酸一起影響酵母質膜的組織和穩(wěn)定性。這種現(xiàn)象會使釀酒酵母將親脂性酸排泄到外部介質中。事實上，在某些脅迫條件下，如發(fā)酵溫度低，釀酒酵母可以產生更高含量的中鏈脂肪酸[33]。

3 結論

本試驗研究了釀酒酵母在不同發(fā)酵溫度下對蘋果酒品質的影響，理化成分和揮發(fā)性香氣成分檢測結果表明，15 ℃發(fā)酵對酵母發(fā)酵動力學有顯著影響，發(fā)酵周期較25 ℃發(fā)酵延長了4 d；可滴定酸與pH的變化呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，可滴定酸最終含量由25 ℃發(fā)酵的4.53 g/L下降為4.41 g/L，而pH則由4.04增加為4.09；不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒中有機酸和氨基酸的種類及含量都差異顯著；發(fā)酵溫度對主要揮發(fā)性化合物的類別產生了不同的影響，與25 ℃發(fā)酵蘋果酒相比，在低溫發(fā)酵的蘋果酒中顯示出較高的總酯含量、脂肪酸含量和較低的高級醇含量，其含量分別為4 576.62 μg/L、703.53 μg/L、3 297.05 μg/L。因此，發(fā)酵溫度的變化會顯著影響關鍵香氣化合物的產生和蘋果酒的理化成分，這些結果可以幫助蘋果酒生產商在最佳發(fā)酵溫度下為消費者生產出質量更好的產品。