王 宇，鄒玉鋒，張家旭，羅 靜，許 強，袁天萌，邊名鴻，韓保林*

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.成都蜀之源酒業(yè)有限公司，四川 成都 611335）

桑葚含有豐富的有機酸、礦物質(zhì)、維生素和氨基酸等，不但營養(yǎng)豐富，而且具有良好的保健功能。由于桑葚季節(jié)性強且不易保存，將其加工成果汁、果脯、果酒等產(chǎn)品是提高其價值的主要途徑[1-3]，其中低醇桑葚果酒因具有較高的營養(yǎng)價值和功能活性成分，受到諸多消費者喜愛[4]。同時，隨著社會的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們更加追求健康營養(yǎng)的飲食，因此低醇桑葚果酒具有較大發(fā)展?jié)摿5]。但由于低醇桑葚果酒的發(fā)酵周期短、酒精度低，導致在發(fā)酵過程中花色苷和多酚類物質(zhì)浸出量相對較少、色澤和香味物質(zhì)含量低，影響產(chǎn)品的整體質(zhì)量[6]。

果膠酶是一個多酶復合體系，在果酒加工過程中，果膠酶可以快速脫除果膠，降低果汁黏度，有利于后續(xù)產(chǎn)品的過濾和澄清[7-8]。果膠酶還能增加芳香物質(zhì)、功能物質(zhì)的浸提率，促進多酚類物質(zhì)的釋放，從而改善果酒的品質(zhì)和成色[9]。LIU M M等[10]研究發(fā)現(xiàn)，添加果膠酶顯著促進了柿子酒的澄清并使得蘋果酸含量增加，同時降低了可滴定酸的含量。此外，還導致葡萄酒中主要的酚類化合物和抗氧化活性顯著增加；曹力等[11]使用果膠酶對山茱萸果酒進行澄清處理并確定了最佳澄清工藝參數(shù)；韋婷等[12]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)果膠酶酶解后紅陽獼猴桃出汁率和果酒感官評分的綜合得分率提高，并且風味更加協(xié)調(diào)，同時其總酸含量降低，自然澄清度增加。因此，在低醇桑葚果酒釀造過程中，利用果膠酶對桑葚進行酶解，可以增加風味物質(zhì)與功能性成分的溶出，是提升低醇桑葚果酒品質(zhì)有效途徑。

本研究采用7種果膠酶分別對桑葚進行酶解處理后發(fā)酵，對低醇桑葚果酒的理化指標、感官指標和揮發(fā)性香氣成分的進行分析，以期為果膠酶在低醇桑葚酒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚（無核大十）：采自四川省宜賓市長寧縣；蔗糖：市售；安琪果酒專用酵母SY：安琪酵母股份有限公司；7種果膠酶樣品（編號1～7號）：湖南鴻鷹生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHSJ—3F pH測定儀：上海精密科學儀器有限公司；NanoDrop2000分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific公司；iNose電子鼻：上海瑞芬國際貿(mào)易有限公司；WZ101手持糖度計：海南博漢森科技開發(fā)有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學儀器有限公司；MJ-150I恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；7890A-5975B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：美國Agilent科技有限公司；DZKW電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；50/30 μm DVB/CAR on PDMS頂空固相微萃取、固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）手動進樣柄和萃取頭：上海安譜科學儀器有限公司；HJ-8B型恒溫磁力攪拌器：金潭市正基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低醇桑葚果酒的釀造工藝流程及操作要點

桑葚原料挑選→破碎打漿→調(diào)整成分→添加SO2→入罐→添加果膠酶→接種酵母→前發(fā)酵→過濾→后發(fā)酵→低溫靜置→陳釀→澄清處理→粗濾→精濾→低醇桑葚果酒

操作要點：

原料挑選：剔除腐爛、變質(zhì)的桑葚，去除石子、樹葉等異物。使用無菌水對桑葚進行簡單沖洗，去掉表面泥土及污垢。

破碎打漿：瀝干水分后在打漿機中低速打漿。

調(diào)整成分：使用蔗糖調(diào)整桑葚果漿初始糖度為140 g/L，用檸檬酸調(diào)節(jié)初始發(fā)酵pH為4.0，靜置24 h。

添加SO2：添加偏重亞硫酸鉀使發(fā)酵液中SO2含量達到60 mg/L。

酵母活化：將果酒酵母與等質(zhì)量蔗糖混合，用10倍質(zhì)量、35～40 ℃的無菌水溶解，靜置20 min。

接種酵母：將不同酶解處理的發(fā)酵液裝于250 mL錐形瓶中，裝液量為75%，將活化好的酵母按1%的接種量接種到發(fā)酵液中。

前發(fā)酵：于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。

后發(fā)酵：用8層紗布進行過濾，在4～8 ℃條件下發(fā)酵7 d。

陳釀：發(fā)酵結(jié)束后，在4 ℃條件下避光陳釀30 d，期間每隔7 d倒罐一次。

澄清、過濾：經(jīng)陳釀果酒澄清、粗濾、精濾后得到低醇桑葚果酒。

1.3.2 理化指標

總酸、總糖、酒精度：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；顏色參數(shù)、總花色苷、多酚、總黃酮：參照田琳等[13-14]的方法測定；所有指標均重復測定3 次。

聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）酶活：參照丁平等[15]的方法利用3,5-二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）測定；果膠裂解酶（pectate lyase，PL）酶活：參照何玉蘭[16]的方法測定；果膠甲酯酶（pectin methyles-terase，PME）酶活：參照孫凱[17]方法利用點位滴定法測定。

1.3.3 感官品評

選擇10名經(jīng)過專業(yè)培訓的人員（年齡在20～45歲之間）組成感官品評小組。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中感官分級評價描述以及時蒙蒙等[18]的方法進行修改，從桑葚酒色澤、香氣、滋味、典型性等方面進行感官品評分析，總分即為酒樣的得分，結(jié)果取10名人員的平均值，滿分100分。

1.3.4 揮發(fā)性香氣成分的測定[17]

（1）揮發(fā)性香氣成分提取

取不同果膠酶預(yù)處理的低醇桑葚酒樣品各5mL于15mL頂空萃取瓶中，添加1.0 g NaCl，放入攪拌子，在40 ℃條件下加熱平衡15 min，然后將萃取針頭插入頂空瓶中，萃取30 min，磁力攪拌速度為800 r/min。

（2）揮發(fā)性香氣成分GC-MS分析

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），萃取頭解吸5 min，進樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣（He），載氣流量為恒定流速1.0 mL/min，不分流進樣。程序升溫：50 ℃保持2 min，以6 ℃/min 升至150 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至220 ℃，保持7 min。

質(zhì)譜條件：5973 型四極桿質(zhì)譜儀，接口溫度250 ℃，電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1 353 V，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍33～450 amu。

定性定量方法：根據(jù)所得譜圖與美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫檢索進行定性分析，實驗結(jié)果保留與數(shù)據(jù)庫對比匹配度＞80的鑒定結(jié)果。采用面積歸一法定量分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2019整理實驗數(shù)據(jù)，采用SPSS 26軟件進行數(shù)據(jù)顯著性分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。采用Origin2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果膠酶酶活測定

果膠酶是一個多酶復合體系，各類酶活力的大小確定其基本性質(zhì)，7種果膠酶的聚半乳糖醛酸酶活性、果膠裂解酶活性、果膠甲酯酶活性測定結(jié)果見圖1。

聚半乳糖醛酸酶（PG）是一種水解酶，作用于果膠并水解聚半乳糖醛酸中的半乳糖醛酸殘基間的α-（1-4）糖苷鍵[19]。由圖1A可知，5號、6號和7號果膠酶的PG酶活性較高，分別為33 183 U/g、26 854 U/g、27 329 U/g，具有較強的澄清果汁能力。

果膠裂解酶（PL）作用于酯化的多聚半乳糖醛酸第5位的β-碳原子，使β-碳原子上的氫原子轉(zhuǎn)移到糖苷鍵的氧原子上，在半乳糖醛酸的C-4和C-5之間形成雙鍵，從而導致α-1,4糖苷鍵斷裂[20-21]。由圖1B可知，4號和5號果膠酶的PL酶活較高，分別為10 640 U/g和2 721 U/g，可更好地促進酚類、黃酮類、花色苷的溶出。

果膠甲酯酶（PME）也屬水解酶類，其作用是水解果膠分子聚半乳糖醛酸聚糖中甲酯化的羧基，使其甲酯化的糖醛酸殘基生成聚半乳糖醛酸和甲醇，可加速PG降解果膠速度[22]。由圖1C可知，3號、5號和6號果膠酶的PME酶活較高，分別為2 961 U/g、3 242 U/g和4 559 U/g。而2號和4號果膠甲酯酶活力最低，僅為376 U/g和0 U/g。

2.2 不同果膠酶處理的低醇桑葚果酒理化指標

由圖2A可知，不同果膠酶處理后的低醇桑葚果酒花色苷含量差異不顯著（P＞0.05）；酒精度為6.02%vol～8.06%vol，均高于對照組（（5.8±0.18）%vol）。原因可能是由于果膠酶催化水解桑葚中的聚半乳糖醛酸，促進了桑葚中糖分的釋放[23]。由圖2B可知，3號、4號和5號果膠酶處理后的低醇桑葚果酒總黃酮含量較高，分別為（170.04±3.54）mg/100 mL、（175.42±5.48）mg/100 mL和（179.41±4.25）mg/100 mL；4號、6號、7號和對照組果膠酶處理后的低醇桑葚果酒多酚含量較高，其中采用4號果膠酶處理后發(fā)酵的低醇桑葚果酒多酚含量最高，為（159.84±4.87）mg/100 mL。由圖2C可知，3號、5號果膠酶處理后的低醇桑葚酒總酸較高，4號果膠酶處理后的低醇桑葚酒總酸略低于3號、5號果膠酶處理后的低醇桑葚酒，總糖略低于5號果膠酶處理后的低醇桑葚酒。由圖2D可知，4號果膠酶處理后的低醇桑葚酒色澤最為紅亮，其亮度值和紅綠值高于其他組，分別為0.18±0.02和0.35±0.01。

圖2 不同果膠酶處理對低醇桑葚果酒花色苷和酒精度（A）、總黃酮和總多酚（B）、總酸和總糖（C）、色值和色差（D）影響Fig.2 Effects of different pectinases on anthocyanins and alcohol content (A), flavonoids and polyphenols (B), total acidity and total sugar (C),and color value and color difference (D) of low-alcohol mulberry wine

2.3 不同果膠酶處理的低醇桑葚果酒揮發(fā)性香氣成分的影響

果酒香氣是影響果酒品質(zhì)和風味的重要因素，主要有果香、酒香和陳釀香。果酒香氣的影響因素除了原料本身以外，還有原料的處理方法，發(fā)酵及陳釀等處理方法[21-22]。桑葚經(jīng)過不同的果膠酶處理后，發(fā)酵液中的花色苷含量和多酚類物質(zhì)含量有所改變，所得低醇桑葚果酒的揮發(fā)性香氣成分也因此存在差異[18]。不同果膠酶處理對低醇桑葚果酒揮發(fā)性香氣成分GC-MS測定結(jié)果見表1。

表1 不同果膠酶處理低醇桑葚果酒的揮發(fā)性香氣成分比較Table 1 Comparison of volatile aroma components in low-alcohol mulberry wine treated with different pectinases

由表1可知，在不同果膠酶處理后的低醇桑葚果酒中，酯類物質(zhì)在果酒香氣中占主導，乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯和棕櫚酸乙酯含量相對較高，這些物質(zhì)帶有令人愉悅的花香和果香，對低醇桑葚果酒的香氣有一定貢獻[6，26-27]。4號果膠酶處理后的酯類相對含量最高，種類也最為豐富，為13種。其原因可能是桑葚中果膠結(jié)構(gòu)高度酯化，而果膠水解酶對果汁的水解速率及程度隨著果膠酸酯化程度的增加而降低，但是果膠裂解酶對甲酯基的α-1,4糖苷鍵有著較強的專一性，能夠通過反式消除反應(yīng)促使果膠的D-半乳糖醛酸的α-1,4糖苷鍵的裂解，從而釋放更多的風味物質(zhì)、多酚類物質(zhì)，使得低醇桑葚果酒有著更好的色澤、口感和香氣[28]。

酸類物質(zhì)一部分源于原料，一部分是酵母菌在生長發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生，是酯類物質(zhì)的前體物質(zhì)。在不同果膠酶處理后的低醇桑葚酒中都存在乙酸和辛酸，當這些酸適量存在于果酒中時，對果酒風味有積極影響[29]。當酸類物質(zhì)的含量低于閾值時，可使酒中的各種香氣趨于協(xié)調(diào)、平衡，過量的酸類物質(zhì)則對果酒的風味和品質(zhì)帶來負面影響。4號果膠酶處理后的低醇桑葚酒中，乙酸及其他酸類物質(zhì)相對含量較其他組低，感官分析中酒體也表現(xiàn)出適度的酸度。因此，4號果膠酶的使用能有效減少酸類物質(zhì)含量，改善酒體風味。

高級醇是果酒中香味來源之一，是果酒中重要的風味物質(zhì)，可以通過氨基酸轉(zhuǎn)化和糖代謝產(chǎn)生[30]。若高級醇含量過低，則果酒酒體風味淡薄；若含量過高，則會帶來異味，且會使飲酒者頭疼和醉酒[31]。在不同果膠酶處理后的低醇桑葚果酒中，異丁醇、異戊醇、丁二醇和苯乙醇等高級醇的含量突出，他們都具有相應(yīng)的醇香和水果香[32-33]。4號果膠酶處理后發(fā)酵得到的低醇桑葚果酒中，異戊醇和苯乙醇含量最高，相對含量分別為11.83%和9.63%，這兩種醇分別具有白蘭地香氣和玫瑰香氣。

2.4 不同果膠酶處理的低醇桑葚果酒香氣分析

電子鼻是測定食品風味的一項快速檢測技術(shù)，能夠客觀并快速地對樣品的氣味進行評價[34]。14根傳感器對8個樣品的檢測信號值見圖3A。由圖3A可知，8個樣品大致都在S1、S2、S4、S5、S8和S11對應(yīng)的感應(yīng)值較高。其中4號果膠酶處理后的低醇桑葚果酒在S1芳香族化合物、S2氮氧化合物、S4有機酯和萜類化合物、S5萜類酯類的響應(yīng)值較其他組高，說明4號果膠酶處理后的低醇桑葚果酒中風味物質(zhì)更加的豐富。對8種低醇桑葚果酒進行主成分分析，結(jié)果見圖3B。由圖3B可知，主成分總方差貢獻率達到96.5%，識別指數(shù)（discrimination index，DI）值達到97.6%，各酒樣在坐標系上分離程度大，說明不同果膠酶處理桑葚原料發(fā)酵的低醇桑葚果酒差異較大，電子鼻能將不同果膠酶處理的低醇桑葚果酒區(qū)分開。

圖3 不同果膠酶處理的低醇桑葚果酒電子鼻檢測的揮發(fā)性物質(zhì)雷達圖（A）及主成分分析（B）Fig.3 Radar chart (A) and principal component analysis (B) of volatile compounds detected by electronic nose in low-alcohol mulberry wine treated with different pectinases

2.5 不同果膠酶處理的低醇桑葚果酒的感官評定

7種不同果膠酶處理的低醇桑葚果酒感官評定結(jié)果如表2所示。由表2可知，4號和6號果膠酶處理的低醇桑葚果酒的感官評分顯著高于其他組（P＜0.05）。從色澤方面，7種果膠酶處理后發(fā)酵的低醇桑葚果酒色澤都呈寶石紅，且有光澤，與色度分析一致。但香氣和滋味方面，4號和6號果香和酒香更加協(xié)調(diào)，滋味更加的豐滿醇厚，4號的典型性最好，具有典型桑葚果酒風味。

表2 不同果膠酶處理對低醇桑葚果酒感官評價結(jié)果的影響Table 2 Effect of different pectinases treatment on sensory evaluation results of low-alcohol mulberry wine

3 結(jié)論

解析7種不同果膠酶酶系及活力大小，并利用7種果膠酶對桑葚原料進行處理，探究果膠酶對低醇桑葚果酒的影響。不同果膠酶處理桑葚原料對低醇桑葚酒品質(zhì)的影響差異較大，由于不同種類的果膠酶對桑葚組織細胞中的聚半乳糖醛酸的作用效果不同，導致最終低醇桑葚果酒的酒精度、黃酮含量、多酚含量和花色苷含量等有所不同。其中，經(jīng)過4號果膠酶處理后的低醇桑葚果酒，其總黃酮含量、總多酚含量和花色苷含量較高，分別為175.4 mg/100 mL、159.8 mg/100 mL和125.5 mg/L。通過GC-MS和電子鼻對酒體進行了風味成分分析，以4號果膠酶處理后發(fā)酵得到的低醇桑葚果酒的風味物質(zhì)最為豐富，感官評分最高（85.0分）。綜上，果膠酶的使用在一定程度上改善低醇桑葚酒的理化性質(zhì)及酒體風味，提升低醇桑葚酒品質(zhì)，但對最佳酶系構(gòu)成及其具體使用條件需進一步探索。