方裕理，張 雨，李彥中，袁天萌，黃丹丹，邊名鴻*

（1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.四川江口醇隆鼎酒業(yè)有限公司，四川 巴中 636000；3.川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；4.南充生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 南充 637000）

桑葚（Morus albaL.），也被稱為桑葚果、桑實(shí)和桑棗，是?？粕俣嗄晟颈局参锷涞墓麑?shí)，主要產(chǎn)于四川和湖南兩省，是一種藥食兩用的水果[1-3]。研究表明，桑葚不僅含有豐富的碳水化合物、17種氨基酸、7種維生素和礦物質(zhì)，還能調(diào)節(jié)人體的免疫功能，促進(jìn)造血細(xì)胞的生長，具有抗突變、抗衰老、降低血糖水平和降低血脂等保健作用[4-7]。桑葚鮮果在自然環(huán)境下極易腐敗，采摘期和貯存周期都非常短，因此桑葚的深加工顯得極其重要，釀造桑葚酒不僅極大地保留桑葚本身的營養(yǎng)成分，增加桑葚附加值，還可以推動(dòng)三產(chǎn)融合，促進(jìn)桑農(nóng)收入。

果酒釀造過程中，酵母菌直接影響果酒風(fēng)味和酒精度。普通釀酒酵母發(fā)酵的桑葚酒常出現(xiàn)口感粗糙、香味寡淡等問題。隨著研究深入，非釀酒酵母在果酒釀造中的作用逐漸受到重視，如能夠合成乙酸丁酯、乙酸異戊酯等揮發(fā)性物質(zhì)，而且酶系豐富，能產(chǎn)生大量果膠酶和葡萄糖苷酶等，在塑造酒體香氣和提高酒體復(fù)雜性方面具有積極作用[8-10]?？勰腋材そ湍福⊿accharomycopsis fibuligera）是一株從中高溫大曲中分離出來的酵母，由于其產(chǎn)香能力較強(qiáng)，出酒率較高，正被運(yùn)用于多種酒的釀造[11]。王乃軍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，扣囊覆膜酵母酶系豐富，產(chǎn)酯、產(chǎn)酸、產(chǎn)醇等風(fēng)味物質(zhì)能力較強(qiáng)，能增強(qiáng)白酒細(xì)膩感，提升白酒品質(zhì)。YANG Y等[13]研究發(fā)現(xiàn)，將扣囊覆膜酵母和其他非釀酒酵母用于發(fā)酵甜米酒，會(huì)增加甜米酒中的己酸乙酯、丁酸乙酯等酯類和一些醇類、酮類物質(zhì)，產(chǎn)生令人愉悅的香氣。目前，扣囊覆膜酵母發(fā)酵桑葚的研究還鮮見報(bào)道。

本研究以桑葚為原料，扣囊覆膜酵母為發(fā)酵菌株制備桑葚酒，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，對(duì)其理化、微生物指標(biāo)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，以期為扣囊覆膜酵母發(fā)酵桑葚酒提供理論參考，同時(shí)拓寬桑葚的加工形式，降低豐產(chǎn)后的滯銷問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

桑葚（無核大十）：宜賓市長寧縣；扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）：四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；安琪釀酒酵母SY：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀（均為分析純）：重慶川東化工試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHSJ-3F型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；WZ101型手持糖度計(jì)：海南博漢森科技開發(fā)有限公司；890N-5975B型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀：美國Agilent科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桑葚酒加工工藝流程及操作要點(diǎn)

桑葚→打漿→調(diào)整成分→接種活化酵母→發(fā)酵→滅菌→倒罐→陳釀→過濾、澄清→桑葚酒

操作要點(diǎn)：

預(yù)處理：清洗鮮桑葚表面的灰塵、泥土，瀝干后于打漿機(jī)中低速打漿。

調(diào)整成分：偏重亞硫酸鉀的使用量為60 mg/L，將糖度調(diào)整為18°Bx，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH至3.5～4.5。

扣囊覆膜酵母的活化：將扣囊覆膜酵母劃線接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基，在26 ℃條件下培養(yǎng)20 h。挑取單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在26 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)20 h。將所得菌液于4 ℃、3 000 r/min的條件下離心10 min，棄掉上清液，將菌體重懸后再次離心取沉淀。

接種與發(fā)酵：發(fā)酵罐的裝液量為175 mL/250 mL，扣囊覆膜酵母接種量為2%，在28 ℃的條件下發(fā)酵12 d左右，測(cè)其酒精度不再變化時(shí)，終止發(fā)酵。

滅菌：將發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液取出，采用7層紗布進(jìn)行粗濾，然后放入65～85 ℃恒溫水浴鍋滅菌30 min。

倒罐與陳釀：陳釀期間每隔24 h倒罐一次，10 ℃條件下避光陳釀30 d。

過濾、澄清：選用自然澄清法，將果酒放在一個(gè)密封的容器中，放置10 d，待果酒中的懸浮物慢慢沉淀后，將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的容器中，得到清澈透明的桑葚酒成品。

1.3.3 桑葚酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

本次試驗(yàn)采用單因素輪換法，依次考察酵母接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、桑葚與水料液比（100∶0、85∶15、70∶30、55∶45、40∶60（g∶mL））和發(fā)酵溫度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃）對(duì)桑葚酒酒精度及感官品質(zhì)的影響。

1.3.4 桑葚酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù)，以桑葚酒酒精度（Y）為響應(yīng)值，選擇影響顯著的因素發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）和料液比（C）為自變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

1.3.5 分析檢測(cè)

還原糖、總酸、總酯含量的測(cè)定：參照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；酒精度的測(cè)定：參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》；可溶性固形物含量的測(cè)定：參照GB/T 12143—008《飲料通用分析方法》；pH的測(cè)定：參照HJ 1147—2020《水質(zhì)pH值的測(cè)定電極法》；花青素含量的測(cè)定：參照DB12T885—2019《植物提取物中原花青素的測(cè)定紫外-可見分光光度法》。微生物菌落總數(shù)、大腸桿菌、致病菌的測(cè)定：參照NYT 1508—2017《綠色食品果酒》。

1.3.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定參照許強(qiáng)等[14]方法并加以修改，具體如下。

預(yù)處理：萃取頭在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）儀進(jìn)樣口活化25 min，用精密注射器從樣品瓶中部抽取2.5 mL桑葚酒注入加有磁力攪拌子的密封頂空瓶中，再加入3 g NaCl，采用恒溫磁力攪拌器調(diào)節(jié)水浴控制酒樣溫度，將活化好的萃取頭插入頂空瓶進(jìn)行頂空萃取5 min，達(dá)到萃取時(shí)間后抽出萃取頭，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口進(jìn)行解吸。

氣相色譜條件：載氣為高純氦氣（He），流速1.00mL/min；進(jìn)樣方式為無分流手動(dòng)進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；初始溫度40 ℃保持3 min，再以5 ℃/min程序升溫至230 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，El）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；掃描范圍20～550 amu。

定性定量方法：根據(jù)全掃圖中母離子信息，利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）MS Search2.3數(shù)據(jù)庫做物質(zhì)鑒定，對(duì)檢測(cè)出得各組分定性分析，并用峰面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)性風(fēng)味成分相對(duì)含量。

1.3.7 感官評(píng)價(jià)

由10位經(jīng)過感官培訓(xùn)的人員組成評(píng)審小組，從色澤、香氣、滋味及典型性方面對(duì)桑葚酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)[14]，滿分為100分，桑葚酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 桑葚酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of mulberry wine

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 酵母接種量的確定

由圖1可知，酵母接種量為1%～2%時(shí)，桑葚酒感官評(píng)分和酒精度均逐漸增加；酵母接種量為2%時(shí)，桑葚酒感官評(píng)分和酒精度均為最高，分別為83分和7.9%vol；當(dāng)酵母接種量＞2%時(shí)，桑葚酒感官評(píng)分和酒精度均逐漸下降。其原因可能是，酵母接種量較低時(shí)，發(fā)酵速度緩慢，前發(fā)酵時(shí)間長，導(dǎo)致酒精度較低，影響風(fēng)味口感；接種量較高時(shí)，酵母過多導(dǎo)致發(fā)酵速度過快、中心溫度過高，產(chǎn)酒率隨之下降，同時(shí)酵母菌的細(xì)胞壁吸附作用會(huì)導(dǎo)致花色素含量降低，酒體色澤不穩(wěn)定，并且發(fā)酵結(jié)束后，酒體酵母味大，影響口感風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)[15]。綜合考慮，確定酵母接種量為2%。

圖1 酵母接種量對(duì)桑葚酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of mulberry wine

2.1.2 料液比的確定

由圖2可知，料液比為40∶60、55∶45、70∶30（g∶mL）時(shí)，桑葚酒酒精度和感官評(píng)分均逐漸增加；料液比為70∶30（g∶mL）時(shí)，桑葚酒酒精度和感官評(píng)分均為最高，分別為8.3%vol和86分；料液比為70∶30、85∶15、100∶0（g∶mL）時(shí)，桑葚酒酒精度和感官評(píng)分均逐漸下降。料液比的大小會(huì)影響酒體香氣和口味的協(xié)調(diào)性，當(dāng)料液比過低時(shí)，桑葚原汁較少導(dǎo)致酒體果香較弱，桑葚酒典型性差；當(dāng)料液比過高時(shí)，桑葚原汁較多，酒體相對(duì)粘稠，酸感較突出，感官評(píng)分較低。綜合考慮，確定最佳料液比為70∶30（g∶mL）。

圖2 料液比對(duì)桑葚酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effects of material to liquid ratio on alcohol content and sensory score of mulberry wine

2.1.3 發(fā)酵溫度的確定

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度在22～24 ℃范圍內(nèi)的增加，感官評(píng)分逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為24 ℃時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值，為87分；發(fā)酵溫度＞24 ℃時(shí)，感官評(píng)分逐漸下降。隨著發(fā)酵溫度在22～26 ℃范圍內(nèi)的增加，酒精度逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為26 ℃時(shí)，酒精度達(dá)到最大值，為8.57%vol；發(fā)酵溫度＞26 ℃時(shí)，酒精度逐漸下降。發(fā)酵溫度過低時(shí)，不僅易染雜菌，而且酵母活性較低，生長繁殖速度緩慢，導(dǎo)致發(fā)酵不充分，因此桑葚酒酒精度偏低和風(fēng)味口感較差；當(dāng)溫度較高時(shí)，抑制微生物代謝能力的同時(shí)，也會(huì)使果酒中的花色苷降解，導(dǎo)致酒體酒精度不高、色澤不穩(wěn)定、口感和成分被破壞[16-18]。綜合考慮，確定最佳發(fā)酵溫度為26 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)桑葚酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of mulberry wine

2.2 桑葚酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）、料液比（C）為自變量，以酒精度（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

采用Design Expert 13.0軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到3個(gè)因素與酒精度（Y）之間的回歸方程：

由表4可知，用響應(yīng)面法建立的二次回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），即所構(gòu)建的模型與試驗(yàn)的差異較小，說明其他因素對(duì)模型的干擾程度低[19-20]，決定系數(shù)R2為0.955 6，調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.898 5，說明89.85%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異型可用此回歸模型解釋，由表4亦可知，一次項(xiàng)C及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AC對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，3個(gè)因素對(duì)桑葚酒酒精度影響順序：料液比（C）＞酵母接種量（B）＞發(fā)酵溫度（A）。

2.2.2 各因素間交互作用對(duì)酒精度的影響

響應(yīng)曲面越平緩說明該試驗(yàn)中的某一因素對(duì)酒精度的影響越小，等高線近似于一個(gè)圓球面，那么就表示這兩個(gè)因素的交互作用越弱[21-22]。采用Design Expert 13.0軟件繪制各因素間交互作用對(duì)桑葚酒酒精度影響的響應(yīng)曲面及等高線見圖4。由圖4可知，在該模型中，AC的等高線呈現(xiàn)明顯的橢圓形，說明AC交互作用顯著（P＜0.05），而AB、和BC響應(yīng)曲面較為平坦，并且等高線未呈現(xiàn)明顯的橢圓形，說明其有一定的交互作用，但交互作用不顯著（P＞0.05），這與方差分析結(jié)果一致。

圖4 各因素間交互作用對(duì)桑葚酒酒精度影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the alcohol content of mulberry wine

采用Design Expert 13.0軟件對(duì)多元回歸方程預(yù)測(cè)，得到最優(yōu)桑葚酒發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度為26.1 ℃、酵母接種量為1.9%、料液比為75∶25（g∶mL），在此條件下，桑葚酒酒精度的理論值為8.62%vol，為方便實(shí)際操作，將發(fā)酵工藝條件修正為發(fā)酵溫度26 ℃、酵母接種量2%、料液比為75∶25（g∶mL）。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化工藝的可行性，在最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行了3次試驗(yàn)，測(cè)得平均酒精度實(shí)際值為8.72%vol，感官評(píng)分為90分。與理論值相差不大，證明了響應(yīng)面法得到的模型參數(shù)的準(zhǔn)確性和可靠性，可真實(shí)反映不同因素對(duì)桑葚酒發(fā)酵的影響。

2.3 桑葚酒的理化及微生物指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

桑葚酒的理化及微生物指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表5。由表5可知，扣囊覆膜酵母發(fā)酵的桑葚酒各項(xiàng)理化及微生物指標(biāo)均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 1508—2017《綠色食品果酒》的要求。

表5 桑葚酒的理化及微生物指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Table 5 Determination results of physicochemical and microbiological indexes of mulberry wine

花青素是桑葚中重要的營養(yǎng)成分，屬于黃酮類化合物，基本結(jié)構(gòu)是2-苯基苯并呋喃，具有預(yù)防心腦血管疾病，保護(hù)肝臟和抗癌等多種生理功能[23-25]?？勰腋材そ湍干］鼐圃谧罴寻l(fā)酵工藝條件下測(cè)得花青素含量高達(dá)3.1 mg/mL，分析原因可能是因?yàn)榻湍阜N類不同所導(dǎo)致的，非釀酒酵母中膠酶、葡萄糖苷酶等分泌較多，從而發(fā)酵出來的桑葚酒花青素含量增加[26]。除花青素外，還原糖、總酯和多糖也高于商品酵母發(fā)酵的桑葚酒。

綜上所述，扣囊覆膜酵母發(fā)酵桑葚酒的感官評(píng)分和酒體品質(zhì)均高于安琪酵母發(fā)酵桑葚酒。

2.4 桑葚酒揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

將最優(yōu)工藝條件下扣囊覆膜酵母發(fā)酵的桑葚酒與安琪酵母發(fā)酵的桑葚酒進(jìn)行揮發(fā)性成分對(duì)比，結(jié)果見表6。

表6 桑葚酒主要揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination results of main volatile components in mulberry wine

由表6可知，扣囊覆膜酵母發(fā)酵桑葚酒中共檢測(cè)出24種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類12種，醇類4種，酸類4種，醛類4種，而安琪酵母發(fā)酵桑葚酒僅檢測(cè)出14種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中，酯類8種，醇類4種，酸類1種，酮類1種。在兩種酵母發(fā)酵的桑葚酒中，扣囊覆膜酵母發(fā)酵桑葚酒的酯類物質(zhì)種類較多，扣囊覆膜酵母發(fā)酵對(duì)乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異戊酯等酯類物質(zhì)含量的提升較為明顯，增加了桑葚酒中的草莓香、含羞草香等，使得桑葚酒更加厚重[27]。兩種酵母發(fā)酵的桑葚酒對(duì)醇類物質(zhì)種類數(shù)量影響不大，均為4種，但扣囊覆膜酵母發(fā)酵增加了桑葚酒中苯乙醇（15.67%）和2,3-丁二醇（2.30%）的含量，同時(shí)大幅降低桑葚酒中異戊醇（3.83%）的相對(duì)含量，使得桑葚酒的口感更加細(xì)膩凈爽。扣囊覆膜酵母發(fā)酵桑葚酒還降低了乙酸（1.63%）的含量，減少了桑葚酒中的酸味，使桑葚酒后味變得醇和回甜?？勰腋材そ湍赴l(fā)酵桑葚酒還檢測(cè)出釀酒酵母發(fā)酵桑葚酒中不具有的4種醛類物質(zhì)，分別為苯甲醛（0.93%）、乙醛（0.20%）、壬醛（0.74%）和癸醛（0.82%），賦予了桑葚酒獨(dú)特的杏仁香和橘皮香[28]。結(jié)合感官品質(zhì)與理化指標(biāo)分析，扣囊覆膜酵母發(fā)酵的桑葚酒香味與口感顯著增強(qiáng)，能有效提升桑葚酒的品質(zhì)。

3 結(jié)論

經(jīng)過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到適合于扣囊覆膜酵母的發(fā)酵條件：酵母接種量2%，料液比75∶25（g∶mL），發(fā)酵溫度26 ℃。在此優(yōu)化條件下，桑葚酒感官評(píng)分為90.0分，酒精度為8.72%vol，總酯含量為5.7 g/L、總酸含量為4.8 g/L、總多酚含量為2.5 mg/mL，理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)均符合相關(guān)國標(biāo)要求。桑葚酒共檢出24種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中，酯類12種，醇類4種，酸類4種，醛類4種，并且所得桑葚酒含有乙酸丁酯、乙酸異戊酯和乙酸苯甲酯等多種風(fēng)味物質(zhì)，香氣協(xié)調(diào)，口感醇厚，具有桑葚酒典型風(fēng)格?？勰腋材そ湍赣糜谏］鼐瓢l(fā)酵能有效改善果酒品質(zhì)，為非釀酒酵母發(fā)酵果酒提供了一定的數(shù)據(jù)支撐，為高品質(zhì)桑葚酒的開發(fā)提供參考。