劉永衡，王 葶，皇甫瑞娟

（寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 能源化工學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

近年來，寧夏葡萄酒在國(guó)家和當(dāng)?shù)卣闹С窒掳l(fā)展勢(shì)頭迅速，寧夏“十四五”規(guī)劃也提出要推進(jìn)葡萄酒產(chǎn)業(yè)，加快“葡萄酒之都”示范基地建設(shè)[1-2]。然而，隨著寧夏葡萄酒產(chǎn)量的不斷提升，釀造剩余皮籽也相應(yīng)增多，產(chǎn)區(qū)葡萄深加工企業(yè)數(shù)量較少且工藝簡(jiǎn)單，致使資源浪費(fèi)及污染周邊環(huán)境污染嚴(yán)重[3]。因此，對(duì)葡萄皮籽進(jìn)行深度研發(fā)加工利用不僅可以解決環(huán)保問題，也可以為葡萄酒產(chǎn)業(yè)帶來更多的收益。

目前有關(guān)于葡萄皮抑菌活性的研究較少，劉蕓等[4]研究表明，葡萄皮渣體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和大腸桿菌（Escherichia coli）均有較強(qiáng)的抑制作用；陳鳳清等[5]研究表明，葡萄皮色苷對(duì)土壤細(xì)菌和酵母表現(xiàn)出明顯的抑菌活性；課題組前期采用不同極性有機(jī)溶劑對(duì)葡萄籽進(jìn)行了初步提取，分析了葡萄籽油的化學(xué)成分，對(duì)提取物及葡萄籽油進(jìn)行了抑菌效果初步測(cè)試，研究結(jié)果表明，葡萄籽體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取物正丁醇萃取物（N-butanol part of 95%ethanol total extracts，TEN）抑菌效果最優(yōu)，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇總浸提物（95%ethanol total extracts，TE）也顯示出較強(qiáng)的抑菌活性[6]。超高壓液相色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）是近年來分析研究生物體化學(xué)成分的常用技術(shù)，相比較于傳統(tǒng)化學(xué)成分分析方法例如柱層析分離純化聯(lián)合質(zhì)譜、核磁共振技術(shù)[7]，其可以在短時(shí)間內(nèi)得到分析結(jié)果，且靈敏度及分辨率高，因此近年來該技術(shù)已成為中草藥、天然產(chǎn)物等化學(xué)成分分析的主要研究手段[8-11]。

為進(jìn)一步明確葡萄籽提取物化學(xué)成分，探索其抑菌活性機(jī)理，本研究采用UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)葡萄籽體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取物正丁醇萃取物（TEN）及體積分?jǐn)?shù)95%乙醇總浸提物（TE）的化學(xué)成分進(jìn)行分析，以常用食品添加劑山梨酸為對(duì)照，探究2種葡萄籽提取物對(duì)細(xì)菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）和真菌（尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、黑曲霉（Aspergillus oryzae）、柑橘青霉菌（Penicillium italicum））的防腐抑菌效果，旨在揭示葡萄籽中化學(xué)成分種類以及與防腐抑菌效果的關(guān)系，為葡萄籽提取物食用保鮮、天然防腐添加劑開發(fā)利用提供理論支持，為葡萄籽的深加工利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

葡萄籽：來源于釀酒葡萄品種蛇龍珠（Cabernet Gernischet），由寧夏西夏王葡萄酒業(yè)（集團(tuán)）有限公司提供。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（S）、大腸桿菌（Escherichia coli）（E）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（B）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）（F）、柑橘青霉菌（Penicillium italicum）（P）：寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院能源化工學(xué)院微生物分析實(shí)驗(yàn)室保藏；黑曲霉（Aspergillus niger）（A）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：英國(guó)Oxoid公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京奧博星生物有限公司；氯化鈉、山梨酸（sorbic acid，SA）（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇、乙酸銨、氨水（均為色譜純）：德國(guó)默克西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（不含瓊脂）、LB培養(yǎng)基：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XL-02A小型高速粉碎機(jī)：濟(jì)南歐萊博技術(shù)有限公司；SHIMADZU-UPLC30超高壓液相色譜儀：日本島津公司；ACQUITY UPLC BEH氨基柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）：上海沃特世科技有限公司；QE Plus四級(jí)桿高分辨質(zhì)譜儀：中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱、YXQ-50A型立式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-2FD型無菌操作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄籽萃取物TE、TEN的制備

葡萄籽以水清洗干凈后置于烘箱70 ℃烘干處理，小型粉碎機(jī)處理成粉末狀，粉碎細(xì)度為200目，稱取1 000 g粉末置于5 L玻璃瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇3 L，常溫避光密閉浸漬提取1個(gè)月，期間每隔3～6 d攪拌處理，備用；取浸漬上清液500 mL，旋蒸減壓濃縮后即得TE樣品；另取浸漬上清液500 mL使用正丁醇以分液漏斗進(jìn)行萃取，將正丁醇萃取層減壓濃縮后即得體積分?jǐn)?shù)95%乙醇總浸提物正丁醇萃取物，以下簡(jiǎn)稱為TEN。

1.3.2 葡萄籽提取物化學(xué)成分分析

樣品前處理：取TE、TEN樣品各5 g，用甲醇溶解配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的樣品溶液，15 000 r/min離心20 min，0.22 μm濾膜過濾用于下一步分析檢測(cè)。

氣相色譜條件：進(jìn)樣量2μL，柱溫25℃，流速0.3mL/min；色譜流動(dòng)相A：水+25 mmol/L乙酸銨，流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序如下：0～1 min，95%B；1～7 min，95%B～65%B；7～9 min，65%B～35%B；9～10.5 min，35%B；10.5～11 min，35%B～95%B；11～15 min，95%B。

質(zhì)譜條件：樣品采用電噴霧電離（electron spray ioniza tion，ESI）源進(jìn)行正離子（+）和負(fù)離子（-）模式檢測(cè)，離子化條件：噴霧電壓：3.8 kv（+）和3.2 kv（-）；毛細(xì)管溫度：320 ℃；鞘氣：30 arb；輔助氣：5 arb；氣化溫度：350 ℃；離子透鏡電壓頻率：50。質(zhì)譜采集條件：時(shí)間12 min，母離子掃描范圍：80～1 200 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率：70 000@m/z 200；二級(jí)質(zhì)譜分辨率：17 500@m/z 200；二級(jí)質(zhì)譜激活類型：高能量碰撞解離（high-energy c-trap dissociation，HCD），隔離窗口：2 m/z，歸一化碰撞能量：10 eV、20 eV、30 eV。

數(shù)據(jù)分析：原始數(shù)據(jù)采用MSDIAL軟件（Ver 4.18）進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積，代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配（質(zhì)量偏差＜20 parts per million）和二級(jí)譜圖匹配（質(zhì)量偏差＜0.02 Da）的方式，檢索人類代謝數(shù)據(jù)庫（human metabolome database，HMDB）、Mass Bank公共數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)化學(xué)成分。

1.3.3 提取物防腐效果評(píng)價(jià)

供試樣品溶液制備：參照GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中山梨酸（SA）使用量[12]，分別配制質(zhì)量濃度分別為1.5 g/L、1.0 g/L、0.5 g/L的SA、TE、TEN溶液，以去離子水為空白對(duì)照（CK），配制完成后115 ℃高壓滅菌30 min備用。

供試菌株活化液制備：參照GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[13]及李鳳琴等[14]實(shí)驗(yàn)方法，3種供試細(xì)菌均在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行活化及培養(yǎng)，3種真菌均在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上進(jìn)行活化及培養(yǎng)，供試細(xì)菌均培養(yǎng)至OD600nm值=0.6的初始菌懸液，供試真菌取孢子以滅菌生理鹽水配制成1×106CFU/mL濃度孢子的初始菌懸液，所有初始菌懸液均以滅菌去離子水梯度稀釋10-3～10-6，涂布至對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。

防腐能力測(cè)定：將上述合適梯度稀釋菌液分別吸取100 μL加入10 mL不同濃度SA、TEN、TE溶液中，以加入100 μL相應(yīng)菌液的滅菌去離子水為空白對(duì)照，3種細(xì)菌于37 ℃搖床振蕩分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h，3種真菌于28 ℃搖床振蕩分別培養(yǎng)48 h、60 h、72 h，取上述培養(yǎng)至不同時(shí)期的菌液1 mL涂布至相應(yīng)培養(yǎng)平板上，培養(yǎng)至菌落可見并計(jì)數(shù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用線上生信制圖軟件繪制防腐效果菌落計(jì)數(shù)氣泡圖（http：//www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_ballon_plot_048）。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄籽提取物UPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果分析

UPLC-MS-MS正、負(fù)離子模式掃描下TEN及TE樣品中的化學(xué)成分分別見表1和表2。由表1及表2可知，從TE及TEN樣品中共鑒定出60種化合物，其中正離子模式掃描下共鑒定出33種化合物，包括氨基酸（7種）、生物堿（6種）、酚類化合物（4種）、核苷（2種）、黃酮（2種）、脂肪酸（1種）、芳香酮（1種）、有機(jī)酸（1種）、維生素（1種）、糖苷（1種）、酯類化合物（1種）、嘌呤（1種）、脂肪酸衍生物（1種）、脂類化合物（1種）、糖類化合物（1種）、香豆素（1種）、苯乙醇苷類化合物（1種）；負(fù)離子模式掃描下共鑒定出27種化合物，包括有機(jī)酸（6種）、酚類化合物（3種）、酯類化合物（4種）、糖苷（3種）、黃酮（2種）、糖類化合物（2種）、醛類化合物（2種）、核苷（1種）、芳香酮類化合物（1種）、維生素（1種）、糖醇（1種）、有機(jī)磺酸（1種）；TEN樣品中共鑒定出48種化合物，TE樣品中共鑒定出52個(gè)化合物，正離子模式下TE樣品中相對(duì)含量較多的化合物有腺嘌呤（40.86%）、（2-糠甲基）-9H-嘌呤-6-胺（16.20%）、硬脂酰胺（13.32%）、哈爾滿堿（5.41%）、查爾酮（3.24%），TEN樣品中相對(duì)含量較多的化合物有腺嘌呤（41.74%）、硬脂酰胺（12.72%）、丹皮酚（12.72%）、哈爾滿堿（4.97%）、甜菜堿（4.17%）；負(fù)離子模式下TE樣品中相對(duì)含量較多的化合物有檸康酸（32.13%）、表兒茶素（12.13%）、3,4,5-三羥基-3'-二苯乙烯吡喃葡萄糖苷（8.42%）、甲基-β-半乳吡喃糖苷（6.76%）、山梨醇（6.08%），TEN樣品中相對(duì)含量較多的化合物有檸康酸（28.62%）、3,4,5-三羥基-3'-二苯乙烯吡喃葡萄糖苷（13.28%）、2-甲基戊二酸（12.68%）、甲基β-半乳吡喃糖苷（8.51%）、表兒茶素（13.13%）、山梨醇（6.04%）。目前已報(bào)道葡萄籽化學(xué)成分種類并不多，陳徐回[15]通過柱層析分離純化的手段從葡萄籽乙酸乙酯萃取物和水相萃取物中分離鑒定出9種化合物，包括表兒茶素、兒茶素、十六烷、亞油酸、β-谷甾醇、α-黑曲霉糖、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、異香蘭酸；王俠[16]從葡萄籽中檢出了對(duì)羥基苯甲酸、沒食子酸、兒茶素和齊墩果酸4種化合物；其他化合物見于葡萄籽油，主要為亞油酸、亞麻酸等脂肪酸以及酯類[6，17]。

表1 UPLC-MS/MS正離子模式掃描下TEN及TE樣品中的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of TEN and TE samples under positiveion mode scanning by UPLC -MS/MS

表2 UPLC-MS/MS負(fù)離子模式掃描下TEN及TE樣品中的化學(xué)成分Table1 Chemical composition of TEN and TE samples under negativeion mode scanning by UPLC -MS/MS

2.2 葡萄籽提取物防腐效果分析

2.2.1 3種細(xì)菌及3種真菌的生長(zhǎng)狀況

細(xì)菌及真菌的菌落生長(zhǎng)情況見圖1。由圖1A可知，3種細(xì)菌在培養(yǎng)24 h后平板菌落數(shù)均已超過200個(gè)，其中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌落數(shù)分別為293個(gè)、247個(gè)、209個(gè)（國(guó)標(biāo)中細(xì)菌菌落數(shù)＞300個(gè)為不可計(jì)數(shù)）；由圖1B可知，3種真菌在培養(yǎng)72 h后平板菌落數(shù)分別為19個(gè)（尖孢鐮刀菌）、27個(gè)（黑曲霉）、31個(gè)（柑橘青霉菌）。

圖1 細(xì)菌（A）及真菌（B）的平板菌落計(jì)數(shù)氣泡圖Fig.1 Bubble chart of plate colony count of bacteria (A) and fungi (B)

2.2.2 兩種葡萄籽提取物及山梨酸對(duì)3種細(xì)菌的防腐效果

由圖2可知，各個(gè)濃度SA在不同時(shí)間處理的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌平板上均未檢測(cè)出菌落，說明SA對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果達(dá)到100%，即表現(xiàn)出了完全抑制效果；同樣，1.5 g/L TEN樣品處理大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的平板上均未檢測(cè)出菌落，說明該濃度條件下TEN樣品對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果達(dá)到100%，而1 g/L TEN樣品只對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出100%抑菌效果；TE樣品僅在1.5 g/L質(zhì)量濃度條件下對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出100%抑菌效果；3種供試樣品對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最弱，在質(zhì)量濃度0.5 g/L各供試樣品處理下均檢測(cè)到50個(gè)以上的菌落，在質(zhì)量濃度1.0 g/L各供試樣品處理下均檢測(cè)到20個(gè)以上菌落，且隨著處理時(shí)間的增加菌落數(shù)量也相應(yīng)增長(zhǎng)，在質(zhì)量濃度1.5 g/L供試樣品處理下各平板依然檢測(cè)到了菌落，在12 h、24 h時(shí)，各樣品處理下菌落數(shù)目均在10個(gè)左右，但在48 h時(shí)，與TEN樣品相比，TE樣品處理的SA菌落數(shù)目明顯較多。因此，TE、TEN樣品及SA對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，其次為大腸桿菌，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果最差。

圖2 兩種葡萄籽提取物及山梨酸對(duì)3種細(xì)菌的防腐效果氣泡圖Fig.2 Bubble chart of preservative effect of two grape seed extracts and sorbic acid on three kinds of bacteria

2.2.3 兩種葡萄籽提取物及山梨酸對(duì)3種真菌的防腐效果

由圖3可知，3種樣品在質(zhì)量濃度1.5 g/L、培養(yǎng)不同時(shí)期對(duì)3種真菌均表現(xiàn)出100%抑菌效果，在1.0 g/L質(zhì)量濃度下SA及TEN樣品在培養(yǎng)不同時(shí)期對(duì)3種真菌抑菌效果達(dá)100%，這些處理均未檢測(cè)到真菌菌落，說明質(zhì)量濃度1.0 g/L、1.5 g/L TEN樣品對(duì)3種真菌的抑制效果與同等濃度SA相近；在質(zhì)量濃度0.5 g/L、不同培養(yǎng)時(shí)間處理下TEN樣品對(duì)尖孢鐮刀菌、柑橘青霉菌的抑制效果和SA相近，但在該濃度SA處理下未檢測(cè)到黑曲霉菌落，TEN樣品檢測(cè)到了1個(gè)黑曲霉菌落；總體上看TEN樣品、SA對(duì)3種真菌的抑制效果明顯強(qiáng)于TE樣品。此外，兩種葡萄籽提取物中含量較多且已被報(bào)道明確具有抑菌防腐效果的化學(xué)成分有丹皮酚[18]、甜菜堿[19-20]、丁香酚[21-22]、白藜蘆醇[23-25]、兒茶素[26]，已報(bào)道具有和其他化合物有協(xié)同防腐作用的成分有查爾酮[27-29]、表兒茶素[30]，這些化合物對(duì)于葡萄籽提取物樣品的防腐抑菌能力可能起到了重要作用；而TEN樣品中丹皮酚、甜菜堿、丁香酚、兒茶素含量均高于TE樣品，說明正丁醇能夠更多的提取富集這些化合物，這也可能是TEN樣品防腐抑菌效果明顯強(qiáng)于TE樣品的原因。然而，兩個(gè)樣品化學(xué)成分中含量較多的腺嘌呤、檸康酸、3,4,5-三羥基-3'-二苯乙烯吡喃葡萄糖苷、甲基-β-半乳吡喃糖苷、2-甲基戊二酸等成分是否具有防腐抑菌效果目前并無報(bào)道，因此有必要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

圖3 兩種葡萄籽提取物及山梨酸對(duì)三種真菌的防腐效果氣泡圖Fig.3 Bubble chart of preservative effect of two grape seed extracts and sorbic acid on three kinds of fungi

3 結(jié)論

本研究通過UPLC-MS/MS技術(shù)從葡萄籽提取物中共鑒定出60種化合物，包括7種酚類化合物、7種氨基酸、6種生物堿、6種有機(jī)酸、4種黃酮等成分。除枯草芽孢桿菌以外，質(zhì)量濃度為1.5 g/L的TEN樣品及TE樣品對(duì)其他菌株的抑菌效果均達(dá)100%；此外，質(zhì)量濃度為1 g/L的TEN樣品對(duì)金黃色葡萄球菌及真菌抑菌效果達(dá)100%；因此，1.5 g/L質(zhì)量濃度葡萄籽正丁醇提取物的防腐抑菌效果與常用防腐添加劑山梨酸抑菌效果相似，有成為食用天然防腐劑的潛力。本研究結(jié)果進(jìn)一步解析了葡萄籽的化學(xué)成分，為葡萄籽深加工利用提供了新的理論依據(jù)。