殷 嫻，曹 爽，郭慧敏，王家棟，廖永紅*

（1.北京工商大學 輕工科學技術學院，北京 100048；2.北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

中醫(yī)藥寶庫中有著大量可以藥食兩用的中藥，不但可以作為食品長期服用，而且具有一定的臨床效果。中藥發(fā)酵是利用微生物的降解和催化作用改變藥物的原有性質并增強或創(chuàng)造新的功效[1-2]。比如人參經(jīng)過發(fā)酵后總皂苷的含量增加了40%，其中人參皂苷Rb1或Rb2隨著發(fā)酵逐漸轉化為稀有的人參皂苷Rg3[3]。中藥經(jīng)發(fā)酵后通過微生物的分解轉化，可降低藥物毒性，將毒性成分進行分解或結構上的修飾使其毒性降低或者消失[4]。潘揚等[5]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后馬錢子堿的成分在質量和數(shù)量上都發(fā)生了明顯的變化?？鄥⒃诮?jīng)過靈芝菌絲體發(fā)酵進行生物轉化后，其毒性明顯降低，且發(fā)酵液的抗乙型肝炎病毒的效果顯著[6]。

六神曲是中國藥典中記載最早的傳統(tǒng)發(fā)酵藥物之一，被廣泛用作消化劑，治療因飲食不良引起的低胃酸性消化不良、胃腸炎、嘔吐和腹瀉[7]。六神曲由赤小豆、苦杏仁、青蒿、蒼耳草、辣蓼和面粉按一定比例混勻后自然發(fā)酵而成。在微生物群落演替和代謝過程中，微生物分泌各種水解酶[8]，通過酶促分解作用，催化發(fā)酵基質合成生物活性成分，形成易于腸道吸收的小分子糖苷、脂肪酸、小肽等功能物質[9-10]，達到健胃消食的作用[11]。因此解析六神曲的微生物結構并預測微生物群落的代謝功能對揭示六神曲的功效具有重要的意義。

傳統(tǒng)的六神曲炮制在原料上可分別使用鮮藥材和干藥材，制備流程存在一定差別。使用鮮藥材制備只進行一步發(fā)酵：赤小豆和苦杏仁粉碎成粗粉，與面粉混勻后，將鮮青蒿、鮮辣蓼和鮮蒼耳秧的煎液加入其中，攪拌均勻，得到柔軟的松散固體，將其揉搓成塊狀進行自然發(fā)酵。使用干藥材需要兩步發(fā)酵，取赤小豆加工成粗粉，加4倍左右的熱水（60～80 ℃）攪拌均勻，自然環(huán)境中敞開發(fā)酵3 d成赤小豆粥；另取苦杏仁、干青蒿、干辣蓼和干蒼耳秧分別粉碎成粉，加面粉后與赤小豆粥混勻，制成握之成團、擲之即散的軟材，置適宜容器內(nèi)再進行六神曲發(fā)酵。使用新鮮藥材需要煎湯，且受季節(jié)限制，而使用干藥材不受季節(jié)約束，更符合現(xiàn)代生產(chǎn)要求，本試驗中采用干藥材的炮制工藝進行發(fā)酵。

六神曲發(fā)酵是自然條件下多菌種混合發(fā)酵[12]，在炮制過程中其原料主要依靠微生物對其進行降解轉化，因此探究六神曲中存在的微生物菌群尤為重要。賈丹丹[13]在鮮藥材制備的六神曲中，分離純化到兼具淀粉酶和蛋白酶合成能力的菌種，包括枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型枯草芽孢桿菌等；且多數(shù)菌株的菌數(shù)在炮制過程中呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。鄔吉野等[14]從六神曲中分離得到12株霉菌，并利用優(yōu)勢菌株進行純菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)黃曲霉顯著提高了神曲淀粉酶和蛋白酶活性，雜色曲霉顯著提高了蛋白酶產(chǎn)生的酶活力，提高了六神曲質量。目前干藥材制備六神曲采用兩步發(fā)酵的微生物菌群結構尚有待研究，且中藥原料對六神曲發(fā)酵的影響尚不明確。

本研究利用基于擴增子的高通量測序技術，對干藥材六神曲兩步發(fā)酵過程的微生物多樣性進行分析，明確其微生物的區(qū)系構成，并通過PICRUSt菌群代謝預測的工具推測六神曲發(fā)酵期間代謝功能的差異，為六神曲功效的作用機理提供理論參考；同時對發(fā)酵原料分別缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁的六神曲進行微生物多樣性研究，探究單一中藥原料對六神曲發(fā)酵的影響。旨在為六神曲功效揭示提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料赤小豆、干青蒿、干辣蓼、干蒼耳秧、苦杏仁：河北省安國市廣盛商貿(mào)有限公司。

1.1.2 試劑

Fast 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Spin Kit for Soil：美國MP Biomedicals公司；瓊脂糖：法國Biowest公司；TransStart Fast Pfu DNA聚合酶（250 U）：北京全式金生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

FW-100粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；PHS-3D pH計：上海精科實驗設備有限公司；ABI GeneAmpR9700聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：紹興微泰生物科技有限公司；Nanodrop-2000分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific公司；安捷倫2100生物分析儀：美國Agilent公司；Illumina MiSeq測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 六神曲兩步法發(fā)酵工藝流程及操作要點

赤小豆粥發(fā)酵：將赤小豆粉碎成粉，加入4倍左右的60～80 ℃熱水，攪拌成粥狀，在32 ℃水浴中敞開培養(yǎng)3 d，發(fā)酵得赤小豆粥。

固態(tài)發(fā)酵：取苦杏仁、干青蒿、干辣蓼和干蒼耳秧分別粉碎成粗粉，按一定比例與面粉混合。加入上述發(fā)酵赤小豆粥，混勻并制成握之成團、擲之即散的軟材，放入盤中，置于發(fā)酵箱32 ℃和85%濕度環(huán)境中培養(yǎng)3 d，即得六神曲。

1.3.2 樣本采集

赤小豆粥發(fā)酵時，在發(fā)酵0 h、24 h、48 h、72 h時取樣于無菌離心管中，編號分別為c0、c1、c2和c3。固態(tài)發(fā)酵時，在發(fā)酵0 h、48 h和72 h時取樣，編號分別為b0、b2和b3。在原料缺失實驗時，分別缺少干青蒿、干辣蓼、干蒼耳秧和苦杏仁中的一種藥材，進行固態(tài)發(fā)酵，在發(fā)酵72 h時取樣，編號分別為B、C、D和E。所有樣本均凍存于-80 ℃。三批發(fā)酵，每批發(fā)酵多點取樣并混勻，為實驗樣本。

1.3.3 DNA提取

利用試劑盒FastDNA Spin Kit for Soil提取微生物基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，并使用Nanodrop-2000分光光度計測定DNA純度和濃度。

1.3.4 擴增子測序

使用通用引物338F和806R擴增原核微生物16S rRNA基因V3～V4區(qū)，用通用引物ITS1F和ITS2R擴增真菌ITS區(qū)。通用原核引物338F和806R的PCR擴增程序如下：95 ℃預變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在10 ℃進行保存。通用真菌引物ITS1F和ITS2R的PCR擴增程序如下：95 ℃預變性3 min，35個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在10 ℃進行保存。PCR擴增體系為：緩沖液4 μL，2.5mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，超純水補足至20 μL。純化PCR產(chǎn)物，并通過安捷倫2100生物分析儀和Quantu Fluorometer評估最終產(chǎn)物的質量和數(shù)量。使用NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit進行建庫。

由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina MiSeq測序平臺進行雙端測序（GenBank登錄號PRJNA860715）。

1.3.5 高通量測序數(shù)據(jù)分析

使用Fastp軟件[15]對原始測序序列進行質控，再通過FLASH[16]組裝過濾后的序列；區(qū)分樣本后使用UPARSE軟件[17]進行序列分析，以97%[17-18]的相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類并剔除嵌合體。利用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）分類器[19]進行注釋（KEGG數(shù)據(jù)庫v94.2版本）。對OTU進行多樣性指數(shù)分析[20]；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 六神曲發(fā)酵的pH變化

環(huán)境是影響微生物存活的重要因素，分析制備過程pH變化，結果見圖1。由圖1可知，赤小豆粥發(fā)酵階段第1天pH出現(xiàn)明顯下降，從6.64下降至4.68，隨后保持在4.1左右。在赤小豆粥發(fā)酵第3天，與適當比例的苦杏仁、干青蒿、干辣蓼、干蒼耳秧和面粉混合，進行固態(tài)發(fā)酵，繼續(xù)發(fā)酵3 d，pH從5.45逐漸下降至3.65。由此可知，發(fā)酵兩階段pH均下降至酸性，且范圍相近。

圖1 六神曲發(fā)酵過程pH值變化Fig.1 Changes of pH value during LiuShenqu fermentation

2.2 六神曲發(fā)酵細菌群落多樣性變化

由表1可知，按1.3.2獲得六神曲發(fā)酵過程的7個樣本，進行測序，共得到462 819條序列，樣本的覆蓋率指數(shù)均達到96%以上，樣本測序深度滿足反映六神曲發(fā)酵微生物全部信息的要求。以Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評估的細菌群落的α-多樣性變化，赤小豆粥樣本的細菌多樣性在發(fā)酵24 h后出現(xiàn)明顯下降，固態(tài)發(fā)酵樣本的細菌多樣性在發(fā)酵48 h后出現(xiàn)明顯的下降。六神曲樣本細菌群落α-多樣性的變化可能與發(fā)酵環(huán)境有關，微生物群落的多樣性受酸度增加的影響，不耐酸的微生物隨發(fā)酵環(huán)境酸度的提升而死亡[21]，發(fā)酵過程中，優(yōu)勢菌群的生長也會降低赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵樣本的細菌微生物多樣性。

表1 赤小豆粥發(fā)酵及六神曲固態(tài)發(fā)酵過程的細菌Alpha多樣性分析Table 1 Alpha diversity analysis of bacteria during red bean porridge fermentation and solid-state fermentation of LiuShenqu

2.3 六神曲發(fā)酵的細菌群落結構組成演替

對赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵過程的細菌群落結構進行分析，共檢測到38個門，其中11個門的相對豐度＞1%；共鑒定出836個屬，其中38個屬的相對豐度＞1%。

由圖2可知，在赤小豆粥發(fā)酵和六神曲固態(tài)發(fā)酵起始時，細菌的優(yōu)勢菌門基本一致，菌群的門水平相對豐度存在差別，豐度最高的5類細菌均依次為放線菌門（Actinobacteriota）（31.03%～34.81%）、變形菌門（Proteobacteria）（25.31%～25.87%）、酸桿菌門（Acidobacteriota）（10.82%～13.74%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（8.54%～11.00%）和厚壁菌門（Firmicutes）（2.52%～5.93%），這5個門的相對豐度占總豐度的84.68%～84.92%。隨著發(fā)酵的進行，放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門的相對豐度明顯降低，厚壁菌門相對豐度均顯著增加。在赤小豆粥發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵的第3天，厚壁菌門分別占總豐度的97.57%和99.53%。說明六神曲發(fā)酵過程中存在明顯的細菌演替過程。

圖2 基于門水平赤小豆粥（A）及六神曲固態(tài)發(fā)酵（B）過程中細菌群落結構Fig.2 Bacterial community structure during red bean porridge (A)and Liushenqu solid-state fermentation (B) based on phylum level

在屬水平上，對六神曲發(fā)酵樣本的細菌菌群結構進行分析，揭示其組成差異。選取相對豐度＞10%的屬為優(yōu)勢菌群，篩選得到5個屬，分別是魏斯氏菌屬（Weissella）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）以及片球菌屬（Pediococcus）。由7個樣本的細菌菌群熱圖（圖3）可見，發(fā)酵后的赤小豆粥以腸球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬和片球菌屬為主要菌屬，占總豐度的76.03%。鑒于赤小豆粥發(fā)酵時，體系迅速變酸（圖1），耐酸的乳酸菌逐漸成為優(yōu)勢菌屬。將發(fā)酵后的赤小豆粥和藥材混合后進行固態(tài)發(fā)酵，則僅乳桿菌屬和片球菌屬成為固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)勢菌，總豐度占比達98.67%，尤其是乳桿菌屬，占總豐度的85.01%，說明赤小豆粥發(fā)酵的優(yōu)勢菌群，在固態(tài)發(fā)酵時，僅乳桿菌屬和片球菌屬的生長優(yōu)勢更明顯。魏斯氏菌屬在赤小豆粥發(fā)酵24 h時相對豐度增加，72 h時相對豐度亦維持在較高水平，但在固態(tài)發(fā)酵過程中則直至72 h相對豐度才略上升，且相對豐度水平不高，因此魏斯氏菌屬雖然在赤小豆粥發(fā)酵時具有一定的生長優(yōu)勢，但也不是固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)勢菌。同處發(fā)酵后期的赤小豆粥樣本（48h和72h）和固態(tài)發(fā)酵樣本（72 h）細菌菌群結構較相似，說明赤小豆粥發(fā)酵起到富集優(yōu)勢細菌的作用，為后續(xù)固態(tài)發(fā)酵提供優(yōu)勢細菌。XU Y等[9]對六神曲一步發(fā)酵的微生物多樣性采用變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）進行分析，擴增到的14個條帶中包含乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）形成的條帶，與本研究結論相似。腸球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬和片球菌屬均為益生菌菌株屬[22-23]。乳酸桿菌是有助于消食的益生菌，常在乳制品工業(yè)中用于制造發(fā)酵產(chǎn)品[24]，其在防止乳制品中由于酸化而導致的腐敗菌生長方面起到重要的作用[22]，可維持腸道微生態(tài)平衡，促進消化，合成氨基酸和維生素，降低膽固醇，抑制內(nèi)毒素的合成[25]。同時，乳酸桿菌屬是兼性厭氧菌，廣泛存在于白酒釀造過程，可將谷物中的淀粉通過自身代謝系統(tǒng)轉化為乳酸[26-28]，這可能會促使六神曲樣本在發(fā)酵期間的酸度增加。片球菌屬具有抗微生物和益生菌的特性，以產(chǎn)生細胞素的形式到達結腸，并可能發(fā)揮其潛在的有益作用[22，29]。

2.4 六神曲發(fā)酵的真菌群落結構組成演替

按1.3.2獲得六神曲發(fā)酵過程的7個樣本，進行真菌核酸測序，共產(chǎn)出1 137 675條序列，樣本的覆蓋率指數(shù)均達到99%以上（表2），測序深度滿足反映六神曲發(fā)酵微生物全部信息的要求。使用Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評估真菌微生物多樣性，赤小豆粥樣本的真菌多樣性在發(fā)酵24 h后出現(xiàn)明顯下降，固態(tài)發(fā)酵樣本的真菌多樣性在發(fā)酵48 h后出現(xiàn)明顯的下降。發(fā)酵過程中，優(yōu)勢菌群的生長降低了赤小豆粥和六神曲樣本的真菌微生物多樣性。

表2 赤小豆粥發(fā)酵及六神曲固態(tài)發(fā)酵過程的真菌Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis of fungi during red bean porridge fermentation and solid-state fermentation of LiuShenqu

對赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵時的真菌群落結構進行分析，共檢測到15個門，其中5個門的相對豐度超過1%；共鑒定出573個屬，其中39個屬的相對豐度超過1%。

由圖4可見，在相同發(fā)酵時期，赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵樣本中真菌的優(yōu)勢菌門基本一致，但各菌群的相對豐度差異很大。其中，赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵在發(fā)酵起始時，子囊菌門（Ascomycota）（68.89%～74.55%）、孢霉菌門（Mortierellomycota）（10.55%～18.84%）和擔子菌門（Basidiomycota）（9.87%～13.51%）相對豐度較高。赤小豆粥發(fā)酵第三天，擔子菌門和子囊菌門的相對豐度接近，分別為50.57%和49.04%；而固態(tài)發(fā)酵末期的六神曲樣本中擔子菌門占優(yōu)勢，豐度達73.23%，子囊菌門的豐度次之，為26.52%。

圖4 基于門水平赤小豆粥（A）及六神曲固態(tài)發(fā)酵（B）過程中真菌群落結構Fig.4 Fungal community structure during red bean porridge (A) and Liushenqusolid-state fermentation (B) based on phylum level

選取相對豐度＞10%的屬為優(yōu)勢菌群，篩選得到6個真菌屬，分別為毛孢子菌屬（Trichosporon）、Diutina、被孢霉屬（Mortierella）、毛殼菌屬（Chaetomium）、赤霉菌屬（Gibberella）以及鐮刀菌屬（Fusarium）。六神曲發(fā)酵過程中7個樣本的真菌群落結構見圖5，發(fā)酵初期的赤小豆粥和固態(tài)發(fā)酵樣本均以赤霉菌屬、被孢霉屬、毛殼菌屬和鐮刀菌屬為主，占總豐度的31.24%～46.67%；發(fā)酵末期的赤小豆粥以毛孢子菌屬（50.33%）和Diutina（39.40%）為主；六神曲固態(tài)發(fā)酵第3天結束時樣本以毛孢子菌屬為主，占總豐度的67.27%。赤小豆粥樣本（48 h和72 h）和六神曲樣本（72 h）真菌菌群結構相似，說明赤小豆粥富集發(fā)酵的真菌可為固態(tài)發(fā)酵提供優(yōu)勢菌種。

圖5 基于屬水平六神曲發(fā)酵過程中真菌的熱圖分析Fig.5 Heat map analysis of fungi during LiuShenqu fermentation based on genus level

2.5 六神曲發(fā)酵的菌群功能預測分析

利用PICRUSt2軟件將測序獲得的基因序列在KEGG數(shù)據(jù)庫中進行菌群代謝功能預測。六神曲發(fā)酵各階段的菌群菌落豐度集中于代謝（圖6），其中代謝途徑（Metabolic pathways）、次級代謝產(chǎn)物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、不同環(huán)境中的微生物代謝（Microbial metabolism in diverse environments）、氨基酸的生物合成（Biosynthesis of amino acids）和碳代謝（Carbon metabolism）的豐度最高。推測六神曲在發(fā)酵期間的菌群結構受代謝影響較為顯著，產(chǎn)生各種酶類，促進六神曲功效的產(chǎn)生。

圖6 六神曲發(fā)酵過程中菌群群落代謝功能第三級分布結果Fig.6 The third order distribution results of microbial community metabolic function during LiuShenqu fermentation

進一步利用KEGG Enzyme注釋，進行更詳細的基因功能信息分析。對六神曲發(fā)酵過程中總豐度排名前50的酶進行分析，并繪制熱圖，結果見圖7。由圖7可知，7個樣本在Enzyme水平存在顯著差異。細菌群落功能預測結果如圖7a所示，發(fā)酵期間的依賴于DNA的DNA聚合酶（EC 2.7.7.7）和DNA解旋酶（EC 3.6.4.12）豐度較高，說明菌群的DNA復制活躍。發(fā)酵后期，6-磷酸-β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.86）基因豐度顯著增加，有利于降解纖維二糖。此外，糖酵解通路中的磷酸甘油酸變位酶（EC 5.4.2.12）、蛋白質-N（pi）-磷酸組氨酸-糖磷酸轉移酶（EC 2.7.1.69）、23S rRNA假尿苷合成酶（EC 5.4.99.23）和蛋白酪氨酸磷酸酶（EC 3.1.3.48）基因豐度明顯升高，蛋白質酪氨酸磷酸酶被證實為腫瘤抑制基因的產(chǎn)物，具有抑制腫瘤發(fā)生的作用[30]。真菌群落功能預測結果如圖7b所示，發(fā)酵后六神曲中葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶（EC 3.2.1.3）基因豐度明顯上升，說明六神曲具有淀粉酶和糖化酶活力，可產(chǎn)生助消化功效，該酶主要依賴于真菌合成。

圖7 六神曲發(fā)酵過程中細菌（a）、真菌（b）PICRUSt基因功能預測熱圖Fig.7 Heatmap of bacterial (a) and fungal (b) gene function prediction by PICRUSt during LiuShenqu fermentation

2.6 藥材缺失對六神曲發(fā)酵菌群結構及功能的影響

對分別缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁藥材之一的原料，按1.3.1節(jié)方法進行固態(tài)發(fā)酵，在發(fā)酵72 h時取樣，編號分別為B、C、D和E，4個樣本測序細菌共獲得350 616條序列，真菌共獲得363 264條序列，樣本覆蓋率指數(shù)均達到99%以上，樣本測序深度滿足反映微生物全部信息的要求。由表3和表4可知，缺少四種藥材的任何一種，細菌的多樣性降低，而真菌的多樣性增加。

表3 藥材缺失條件下六神曲固態(tài)發(fā)酵的細菌Alpha多樣性分析Table 3 Alpha diversity analysis of bacteria in LiuShenqu with medicinal materials deficiency during solid-state fermentation

表4 藥材缺失條件下六神曲固態(tài)發(fā)酵的真菌Alpha多樣性分析Table 4 Alpha diversity analysis of fungi in LiuShenqu with medicinal materials deficiency during solid-state fermentation

對b3、B、C、D、E五個樣本進行OTU水平的Venn圖分析，直觀的展現(xiàn)不同樣本中物種（OTU）組成相似性及重疊情況，結果見圖8。由圖8a知，5個樣本細菌共有的OTU有25個，b3樣本獨有的OTU有53個；由圖8b知，5個樣本真菌共有的OTU有150個，b3樣本獨有的OTU有109個。而B、C、D和E樣本的細菌和真菌的總OTU數(shù)目均低于b3，原料缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁中的任何一種藥材，均會對六神曲的微生物群落結構產(chǎn)生影響。

圖8 操作分類單元水平細菌（a）、真菌（b）的Venn圖Fig.8 Venn diagram of bacteria (a) and fungi (b) based onoperational taxonomic unit level

對b3、B、C、D、E五個樣本進行微生物群落結構分析，細菌共檢測到6個門，其中3個門的相對豐度超過1%；真菌共檢測到6個門，其中3個門的相對豐度超過1%。由圖9a可知，發(fā)酵原料缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁使發(fā)酵后的厚壁菌門（Firmicutes）的豐度明顯降低，其中發(fā)酵原料缺少辣蓼的固態(tài)發(fā)酵后厚壁菌門降低最多，說明辣蓼對發(fā)酵細菌菌群結構影響最大。由圖9b可知，各六神曲固態(tài)發(fā)酵樣品在發(fā)酵后期均以子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）為優(yōu)勢菌門，但子囊菌門的豐度比擔子菌門高，四種原料均可能對子囊菌門的生長存在抑制作用，并對擔子菌門的生長存在促進作用，其中蒼耳秧對兩種真菌門的生長影響最大。

圖9 藥材缺失條件下六神曲基于門水平細菌（a）、真菌（b）的菌群結構Fig.9 Microflora structure of bacteria (a) and fungi (b) of LiuShenqu with medicinal materials deficiency based on phylum level

進一步對屬水平進行分析，由圖10a和10b可知，發(fā)酵原料缺少四種藥材任意一種，優(yōu)勢細菌均由乳桿菌屬（Lactobacillus）轉變?yōu)槠蚓鷮伲≒ediococcus），而優(yōu)勢真菌毛孢子菌屬（Trichosporon）的相對豐度也明顯降低，不再成為優(yōu)勢菌。

圖10 藥材缺失條件下六神曲基于屬水平細菌（a）、真菌（b）的菌群結構Fig.10 Microflora structure of bacteria (a) and fungi (b) of LiuShenqu with medicinal materials deficiency based on genus level

將b3、B、C、D、E五個樣本的細菌和真菌基因序列在KEGG數(shù)據(jù)庫中利用PICRUSt2軟件進行菌群功能預測。對總豐度排名前50的酶進行分析，結果見圖11。由圖11a可知，細菌群落功能預測顯示5種樣本均以DNA解旋酶（EC 3.6.4.12）、脫氧核糖核酸指導的脫氧核糖核酸聚合酶（EC 2.7.7.7）、蛋白質-N（pi）-磷酸組氨酸-糖磷酸轉移酶（EC 2.7.1.69）為主，其中發(fā)酵原料缺少某一種藥材的樣本發(fā)酵后的EC 3.6.4.12、EC 2.7.7.7的基因豐度降低。由圖11b可知，b3樣本中三磷酸腺苷酶（EC 3.6.1.3）和葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶（EC 3.2.1.3）的豐度高于其他4種藥材單一缺失樣本，說明青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁四種藥材均對提升六神曲中淀粉酶和糖化酶豐度具有促進作用，有助于六神曲功效的發(fā)揮。

圖11 藥材缺失條件下六神曲細菌（a）、真菌（b）PICRUSt基因功能預測熱圖Fig.11 Heat map of PICRUSt gene function prediction of bacteria (a)and fungi (b) in LiuShenqu with medicinal materials deficiency

將b3、B、C、D、E五個樣本的細菌基因序列在KEGG數(shù)據(jù)庫中利用PICRUSt2軟件對菌群代謝途徑進行功能預測。對總豐度排名前50的代謝途徑（Pathway level3）進行分析。

由圖12可知，細菌群落功能預測顯示，5種發(fā)酵樣本均以代謝途徑（Metabolic pathways）、次級代謝產(chǎn)物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）和不同環(huán)境中的微生物代謝（Microbial metabolism in diverse environments）的影響為主，且五個樣本的基因豐度沒有明顯差異，但在磷酸轉移酶系統(tǒng)（Phosphotransferase system）、核糖體（Ribosome）、氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids）、氨基糖和和核苷糖代謝（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism）、ABC轉運系統(tǒng)（ABC transporters）、糖酵解/糖異生（Glycolysis/Gluconeogenesis）、果糖和甘露糖代謝（Fructose and mannose metabolism）等途徑存在基因豐度差異。

3 結論

采用高通量測序技術對六神曲發(fā)酵過程中群落結構的演替變化進行分析，并結合PICRUSt2預測發(fā)酵期間菌群的功能變化。研究發(fā)現(xiàn)，在六神曲自然發(fā)酵過程中，菌群多樣性和pH隨發(fā)酵時間明顯降低，后期菌群逐漸單一，細菌中的乳桿菌屬、片球菌屬和真菌中的毛孢子菌屬成為發(fā)酵階段明顯的優(yōu)勢菌。發(fā)酵原料缺少四種藥材之一，優(yōu)勢細菌均由乳桿菌屬轉變?yōu)槠蚓鷮?，?yōu)勢真菌毛孢子菌屬的相對豐度也明顯降低。其中，辣蓼對發(fā)酵細菌菌群結構影響最大；蒼耳草對子囊菌門和擔子菌門的生長影響最大。本研究為后續(xù)六神曲的功效研究提供支撐。