劉 寧，張宿義，，3*，明紅梅，，3，董 異，，3，王 超，，3，敖宗華，，3，郭家秀，李德林，楊 艷，周燕妮，3，賈俊杰，3

（1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000）

“曲乃酒之骨，好曲出好酒”，大曲是白酒釀造中的傳統(tǒng)發(fā)酵劑，其是由多種微生物共同發(fā)酵谷物中的碳水化合物后得到的發(fā)酵產(chǎn)品，含有豐富的功能微生物群落和代謝酶，有利于白酒釀造過程的順利進(jìn)行和形成白酒特有的風(fēng)味化合物[1]。

酶是大曲的重要組成部分，包括淀粉酶類、酯化酶類、蛋白酶類、脂肪酶類和單寧酶類等[2]。淀粉酶類是大曲中一類重要的酶，其與大曲糖化力、液化力息息相關(guān)[3]。在白酒釀造過程中，淀粉酶能夠?qū)⒐任铮ǖ矸郏┓纸鉃楹鸵幌盗械牡途厶?，?duì)原料的轉(zhuǎn)化、風(fēng)味物質(zhì)以及乙醇的生成有著重要的影響[4]。產(chǎn)淀粉酶的菌株包括放線菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌等[5]，其中芽孢桿菌（Bacillussp.）是大曲中具有產(chǎn)淀粉酶能力的一類優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[6]，具有產(chǎn)酶量高、發(fā)酵周期短，對(duì)酸、熱具有強(qiáng)耐受性的特點(diǎn)[7]。目前已報(bào)道的具有產(chǎn)淀粉酶能力的芽孢桿菌主要有貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）以及解淀粉酶芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等[8]。近年來(lái)學(xué)者們已從大曲、糟醅、窖泥等來(lái)源中篩選出了許多株高產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，如胡曉龍等[9]從大曲中篩選出一株產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌，經(jīng)培養(yǎng)優(yōu)化后其酶活達(dá)8 158.23 U/mL，毛祥等[10]從醬香型大曲中篩選得到一株具有產(chǎn)淀粉酶能力的枯草芽孢桿菌，經(jīng)優(yōu)化后其酶活可達(dá)8 667.79 U/mL。有研究報(bào)道，酒醅中添加產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌后能夠提高基酒出酒率[11]，因此，其在釀酒企業(yè)中具有極高的生物強(qiáng)化潛力和應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用稀釋平板法和劃線法從中溫大曲中分離純化芽孢桿菌，利用透明圈法初篩和3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法復(fù)篩以篩選高產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定。以淀粉酶活力為響應(yīng)值，通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)篩選菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為大曲質(zhì)量的調(diào)控、釀酒原料利用率及白酒出酒率的提高提供理論指導(dǎo)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

中溫大曲：瀘州老窖制曲車間；蛋白胨、牛肉浸粉、胰蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；可溶性淀粉（生化試劑）：天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市密歐化學(xué)試劑有限公司；蔗糖、麥芽糖、乳糖、（NH4）2SO4、NaCl、（NH4）2HPO4、（NH4）2CO3（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；DNS（分析純）：廣州和為醫(yī)藥科技有限公司；Plant Genomic脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Mix預(yù)混液、PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基[12]：蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，可溶性淀粉10 g/L，pH值7.0。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[13]：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH值7.0。

種子培養(yǎng)基[13]：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉5 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.0。

篩選培養(yǎng)基[14]：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉5 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH值7.0。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃下高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-700E全自動(dòng)高壓滅菌鍋：日本Tomy Digital Biology公司；BSC-1300ⅡB2生物安全柜：蘇州賽鴻泰凈化科技有限公司；IFA-110-8強(qiáng)制對(duì)流通用型培養(yǎng)箱：杭州諾丁科學(xué)器材有限公司；HYL-C組合式多功能搖床：太倉(cāng)市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Eppendorf 5804R臺(tái)式低溫高速離心機(jī)：北京阿拉斯加科技有限公司；JC-HH-6水浴鍋：青島精誠(chéng)儀器儀表有限公司；Multiskan Sky全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：賽默飛科技有限公司；奧林巴斯BX53M正置金項(xiàng)顯微鏡：上海儀景通光學(xué)科技有限公司；JJ6000型電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；T100 PCR儀、PathoMPS S1000水平電泳儀、Gel Doc Go全自動(dòng)凝膠成像儀：美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌的分離純化[15]

稱取10 g中溫大曲樣品放入無(wú)菌錐形瓶中，并與90 mL無(wú)菌水混合。將混合物以200 r/min振蕩2 h，在80 ℃水中熱處理30 min。將混合物梯度稀釋10倍，吸取不同梯度的稀釋液200 μL涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取具有芽孢桿菌形態(tài)特征的菌落進(jìn)行劃線和分離純化。

1.3.2 高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選

初篩：將純化的芽孢桿菌菌株劃線接種于篩選培養(yǎng)基上，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，將數(shù)滴0.05%盧戈氏碘溶液添加到培養(yǎng)基中，并用棉簽均勻涂抹，測(cè)定菌落周圍透明圈的直徑（D）和菌落直徑（d），選擇D/d值＞1.5的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

復(fù)篩：將初篩D/d值較大的菌株劃線接種于篩選培養(yǎng)基上，37 ℃條件下活化培養(yǎng)24 h后，用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃、150 r/min條件下富集培養(yǎng)24 h；調(diào)整菌液OD600nm值為0.5±0.05，并以5%（V/V）的接種量接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃、150 r/min條件下發(fā)酵48 h；取發(fā)酵液30 mL于50 mL離心管中，在10 ℃條件下以8 000 r/min離心10 min，取上清液，使用DNS法測(cè)定淀粉酶活性[16]，篩選高產(chǎn)淀粉酶的菌株。

1.3.3 高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）[17]對(duì)菌株的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察；革蘭氏染色后鏡檢觀察菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

分子生物學(xué)鑒定：采用Plant Genomic DNA Kit提取復(fù)篩菌株的基因組DNA，以其為模板，采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA11.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.3.4 高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在接種量5%、初始pH值7.0、培養(yǎng)溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、裝液量100 mL/250 mL的條件下，以淀粉酶活力為篩選依據(jù)，探究碳源種類（蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、高粱粉、小麥粉）及最佳碳源添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L）、氮源種類（蛋白胨、牛肉浸粉、胰蛋白胨、硫酸銨、氯化銨、磷酸氫二銨）及最佳氮源添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%、11%）、發(fā)酵溫度（31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃）、轉(zhuǎn)速（90 r/min、120 r/min、150 r/min、180 r/min、210 r/min、240r/min）、裝液量（40mL/250mL、60mL/250mL、80mL/250mL、100mL/250mL、120mL/250mL、140mL/250mL、160 mL/250 mL）以及培養(yǎng)基初始pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0）共9個(gè)因素對(duì)淀粉酶活力的影響。

（2）Plackett-Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman試驗(yàn)從7個(gè)因素（碳源添加量（X1）、氮源添加量（X2）、接種量（X3）、發(fā)酵溫度（X4）、轉(zhuǎn)速（X5）、裝液量（X6）、初始pH值（X7））中篩選出對(duì)菌株淀粉酶活性具有顯著影響的因子，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design for culture conditions optimization

（3）最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)淀粉酶活性具有顯著影響的因素，利用最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面中心點(diǎn)。

（4）Box-Behnken試驗(yàn)

在Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以淀粉酶活力（Y）為響應(yīng)值，接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）及裝液量（C）為考察因素，通過Design-Expert 13軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表2。

表2 培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for culture conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的分離純化及篩選

通過稀釋涂布和平板劃線從中溫大曲中共分離純化出72株芽孢桿菌，通過初篩得到12株D/d值＞1.5的菌株，進(jìn)行淀粉酶活力測(cè)定，結(jié)果見表3。由表3可知，菌株ZTW17-6的淀粉酶活性顯著高于其他菌株（P＜0.05），為3 207.47 U/mL，因此，確定該菌株為高產(chǎn)淀粉酶活的菌株。

表3 高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌菌株的篩選結(jié)果Table 3 Screening results for high-yield amylase Bacillus sp.strains

2.2 菌株ZTW17-6的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株ZTW17-6的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1A可知，菌株ZTW17-6的菌落呈白色，四周粗糙，有溝壑，中間突起，頂端為圓環(huán)狀，整體形狀酷似火山；由圖1B可知，菌體經(jīng)革蘭氏染色后呈藍(lán)紫色，說明為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體呈桿狀，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》初步判定菌株ZTW17-6為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖1 菌株ZTW17-6的菌落形態(tài)（A）及細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.1 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain ZTW17-6

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株ZTW17-6的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 基于16S rRNA基因序列分析菌株ZTW17-6的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZTW17-6 based on 16S rRNA gene sequences analysis

由圖2可知，菌株ZTW17-6與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）FZB42聚于一支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合菌落形態(tài)觀察，可鑒定菌株ZTW17-6為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

2.3 菌株ZTW17-6產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)

不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ZTW17-6產(chǎn)淀粉酶的影響見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ZTW17-6產(chǎn)淀粉酶的影響Fig.3 Effect of different culture conditions on amylase produced by strain ZTW17-6

碳源可以為菌體合成提供碳骨架成分并為微生物生長(zhǎng)提供能量，是微生物生長(zhǎng)的必要元素之一[20]。由圖3A可知，當(dāng)以高粱粉和小麥粉為碳源時(shí)，淀粉酶活力處于較低水平，當(dāng)乳糖為碳源時(shí)，淀粉酶活力最高，可達(dá)3 329.86 U/mL，顯著高于可溶性淀粉（3 018.53 U/mL）（P＜0.05），這可能是因?yàn)榫闦TW17-6產(chǎn)β-半乳糖苷酶能力較強(qiáng)，將乳糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力快于將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力，更利于菌株自身代謝產(chǎn)酶[21]。因此，確定乳糖為最佳碳源。

在菌體中，氮源參與了氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸及含氮代謝物的合成[22]。由圖3B可知，相比于無(wú)機(jī)氮，有機(jī)氮更能促進(jìn)菌體產(chǎn)淀粉酶，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮中含有豐富的氨基酸和生長(zhǎng)因子，有助于菌體生長(zhǎng)及蛋白質(zhì)的合成[9]。蛋白胨有助于延長(zhǎng)產(chǎn)物穩(wěn)定期，促進(jìn)產(chǎn)物代謝[23]，當(dāng)以蛋白胨為氮源時(shí)，淀粉酶活力最高，為3 186.36 U/mL，因此，確定蛋白胨為最佳氮源。

碳源和氮源是微生物生長(zhǎng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，過低的含量不利于微生物的生長(zhǎng)，含量過高則會(huì)出現(xiàn)反饋抑制[24]。由圖3C可知，當(dāng)乳糖添加量為10～50 g/L時(shí)，淀粉酶活力呈上升趨勢(shì)；當(dāng)乳糖添加量為50 g/L時(shí)，淀粉酶活力最高，為6 185.24 U/mL；當(dāng)乳糖添加量繼續(xù)升高時(shí)，淀粉酶活力開始降低，因此，確定最適乳糖添加量為50 g/L。由圖3D可知，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?0～60 g/L時(shí)，淀粉酶活力隨著蛋白胨添加量的升高而升高；當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?0 g/L時(shí)，淀粉酶活力最高，為5 298.38 U/mL；當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿浚?0 g/L之后，淀粉酶活力開始下降，因此，確定最適蛋白胨添加量為60 g/L。

由圖3E可知，當(dāng)接種量＜3%時(shí)，淀粉酶活力隨著接種量的增加而升高；當(dāng)接種量為3%時(shí)，淀粉酶活力最高，為5 645.50 U/mL；隨后淀粉酶活力急劇下降，并在接種量為7%～11%時(shí)趨于穩(wěn)定，這可能是由于接種量的增大縮短了停滯期，從而加快了微生物的繁殖和底物的消耗，使得后期淀粉酶的積累受到抑制。因此，確定最適接種量為3%。

不同微生物的最適生長(zhǎng)溫度不同，溫度過高或過低都不利于酶的表達(dá)[25]。由圖3F可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為31～35 ℃時(shí)，淀粉酶活力隨著發(fā)酵溫度的升高而升高；當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)，淀粉酶活力最高，為5 787.48 U/mL，這與BHATT K等[26]的研究結(jié)果一致；當(dāng)發(fā)酵溫度＞35 ℃時(shí)，淀粉酶活力開始受到抑制，隨著發(fā)酵溫度的升高而下降，因此，選擇35 ℃作為該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最適發(fā)酵溫度。

由圖3G可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速在90～180 r/min時(shí)，淀粉酶活力隨著轉(zhuǎn)速的增加而提高；當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，淀粉酶活力最高，為4 825.85 U/mL；當(dāng)轉(zhuǎn)速＞180 r/min時(shí)，淀粉酶活力隨著轉(zhuǎn)速的升高而降低。因此確定最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。

理論上裝液量越少，體積溶氧系數(shù)越高，越有利于微生物與氧氣接觸，但裝液量減少的同時(shí)也會(huì)使微生物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少[27]。由圖3H可知，當(dāng)裝液量為40～80 mL/250 mL時(shí)，淀粉酶活力隨著裝液量的增加而提高；當(dāng)裝液量為80 mL/250 mL時(shí)，淀粉酶活力最高，為4 483.72 U/mL；當(dāng)裝液量＞80 mL/250 mL時(shí)，淀粉酶活力隨著裝液量的增加而降低。因此，確定最適裝液量為80 mL/250 mL。

由圖3I可知，在低初始pH值條件下，淀粉酶活力較低，可能是因?yàn)槠岬陌l(fā)酵環(huán)境抑制了菌株的生物活性，從而降低了淀粉酶活力[28]；當(dāng)初始pH值為3～7時(shí)，淀粉酶活力隨著初始pH值的升高而升高；當(dāng)初始pH值為7時(shí)，淀粉酶活力達(dá)到最高值，為3 349.45 U/mL；當(dāng)初始pH值＞7時(shí)，淀粉酶活力隨著初始pH值的升高而降低。因此，確定最適初始pH值為7。

2.3.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 13軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis results of Plackett-Burman experiments

由表4及表5可知，各因素對(duì)菌株ZTW17-6產(chǎn)淀粉酶影響的先后順序?yàn)閄4＞X3＞X6＞X5＞X7＞X1＞X2，該模型的P值為0.006 8，極顯著（P＜0.01），決定系數(shù)R2為0.969 8，調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.917，表明該模型的擬合度較好。其中X3（接種量）、X4（發(fā)酵溫度）、X6（裝液量）對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），為主要影響因素，且X3對(duì)結(jié)果的影響是正效應(yīng)，X4及X6對(duì)結(jié)果的影響是負(fù)效應(yīng)，因此，選擇X3、X4和X6進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，其余因素以單因素試驗(yàn)結(jié)果確定最佳水平。

2.3.3 最陡爬坡試驗(yàn)

為了逼近X3（接種量）、X4（發(fā)酵溫度）和X6（裝液量）的響應(yīng)中心點(diǎn)，根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 13設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。由表6可知，在試驗(yàn)號(hào)2的培養(yǎng)條件下，淀粉酶活力最高，可達(dá)8 132.46 U/mL。因此，選擇試驗(yàn)號(hào)2的培養(yǎng)條件，即接種量3%、發(fā)酵溫度35 ℃、裝液量80 mL/250 mL為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest climbing experiments

2.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以淀粉酶活力（Y）為響應(yīng)值，接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）及裝液量（C）為考察因素，通過Design-Expert 13軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果見表8。

表7 培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments for culture conditions optimization

采用Design-Expert 13軟件對(duì)表7結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到淀粉酶活力（Y）對(duì)接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和裝液量（C）的二次多元回歸方程：Y=-663 878+1 357.06A+38 526.52B+84.66C-7.92AB-3.29AC+20.32BC-110.85A2-578.40B2-5.10C2。

由表8可知，模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.383 2＞0.05），表明該模型可靠。決定系數(shù)R2=0.994 6、調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.987 7，表明該模型精確度高，誤差小，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的擬合度較高，能夠?qū)闦TW17-6的淀粉酶活力進(jìn)行預(yù)測(cè)。由P值可知，一次項(xiàng)A、B、C、交互項(xiàng)BC及二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；由F值可知，影響淀粉酶活力的因素主次順序?yàn)锽（發(fā)酵溫度）＞C（裝液量）＞A（接種量）。交互項(xiàng)BC對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面及等高線見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度與裝液量間交互作用對(duì)貝萊斯芽孢桿菌ZTW17-6產(chǎn)淀粉酶活力影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plot and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature and liquid volume on amylase activity of Bacillus velezensis ZTW17-6

由圖4可知，發(fā)酵溫度與裝液量間交互作用對(duì)淀粉酶活力影響的響應(yīng)面呈凸面，存在最高點(diǎn)，等高線呈橢圓形，說明兩者間交互作用對(duì)貝萊斯芽孢桿菌ZTW17-6產(chǎn)淀粉酶活力的影響極顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

采用Design-Expert 13軟件對(duì)二次多元回歸方程進(jìn)行最優(yōu)求解，得到貝萊斯芽孢桿菌ZTW17-6產(chǎn)淀粉酶的最佳培養(yǎng)條件為接種量5%、發(fā)酵溫度34.6℃、裝液量75.69 mL/250mL，在此條件下，淀粉酶活力的預(yù)測(cè)值為8 536.45 U/mL。為便于實(shí)際操作，將培養(yǎng)條件修正為接種量5%、發(fā)酵溫度35 ℃和裝液量76 mL/250 mL。在該培養(yǎng)條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，測(cè)得淀粉酶活力實(shí)際值為（8 352.95±78.94）U/mL，與預(yù)測(cè)值接近，說明該模型可行。

3 結(jié)論

本研究采用稀釋平板法和劃線法從中溫大曲中分離純化出72株芽孢桿菌，通過透明圈法初篩和3,5-二硝基水楊酸法（DNS）法復(fù)篩得到一株高產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌，編號(hào)為ZTW17-6，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)以及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化確定菌株ZTW17-6產(chǎn)淀粉酶的最優(yōu)培養(yǎng)條件為乳糖添加量50 g/L、蛋白胨添加量60 g/L、接種量5%、發(fā)酵溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、裝液量76 mL/250 mL、初始pH值7。在此優(yōu)化培養(yǎng)條件下，淀粉酶活力最高，可達(dá)8 352.95 U/mL，是優(yōu)化前的2.61倍。在此基礎(chǔ)上，后續(xù)將研究菌株對(duì)大曲糖化力以及液化力的影響，并將該大曲應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)中，研究其對(duì)白酒出酒率的影響，以期為大曲質(zhì)量提升以及白酒出酒率的提高提供理論指導(dǎo)和實(shí)踐依據(jù)。