駱紅波，孫優(yōu)蘭，范奇高，胡建鋒，張 健*

（貴州習(xí)酒股份有限公司，貴州 遵義 564622）

中國(guó)白酒是具有民族特色的酒精飲料，通常以不同的谷物為原料，以大曲、麩曲等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、蒸餾、貯存和勾兌組合而成[1]。不同的自然環(huán)境、釀造原料、制曲工藝、釀造工藝、氣候條件等決定了白酒的風(fēng)格，目前已形成了各具特色的12種白酒香型，其中濃香、清香和醬香型深受國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的喜愛(ài)。許多研究和生產(chǎn)實(shí)踐表明，復(fù)雜而獨(dú)特的微生物貫穿釀造全生命周期，對(duì)白酒的風(fēng)味特征起著重要作用。釀造微生物來(lái)源是多途徑的，原輔料、糖化發(fā)酵劑、發(fā)酵容器、生產(chǎn)場(chǎng)地和工具等都會(huì)提供不同種類的微生物，進(jìn)而形成復(fù)雜多樣的微生物生態(tài)系統(tǒng)。因此，全面解析釀造微生物的群落組成特征、代謝通路、代謝產(chǎn)物等對(duì)明晰白酒特征風(fēng)味物質(zhì)、改善酒體品質(zhì)、推進(jìn)智能化釀造方面具有重要意義。

長(zhǎng)期以來(lái)，研究人員一直利用傳統(tǒng)的微生物學(xué)技術(shù)研究復(fù)雜的釀造微生物體系。隨著分子技術(shù)及測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，一些組學(xué)手段（如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)學(xué)和代謝組學(xué)等）已經(jīng)開(kāi)始被運(yùn)用于釀造微生物研究，為全面解析釀造功能菌、功能基因和代謝通路、酶活性和代謝產(chǎn)物及其互作研究提供了技術(shù)支持[2-4]。例如，目前已通過(guò)基因組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)挖掘到多個(gè)細(xì)菌（如乳酸菌、芽孢桿菌、葡萄球菌和梭菌）、真菌（如鐮刀菌、畢赤酵母和根霉）等微生物與酒體風(fēng)味形成相關(guān)[5-10]，這些微生物有望成為提升白酒風(fēng)味的媒介。本文對(duì)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)在白酒釀造微生物的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)組學(xué)技術(shù)在未來(lái)釀造微生物的研究方向提出了思考與展望，旨在為后續(xù)探索微生物協(xié)同作用、風(fēng)味形成機(jī)理、質(zhì)量控制等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供理論指導(dǎo)。

1 基因組學(xué)技術(shù)在白酒釀造微生物中的應(yīng)用

基因組幾乎包含了生物體所有的遺傳信息，是微生物特定功能和表型形成的根源。因此，全基因組測(cè)序?yàn)樵诨蛩浇沂景拙漆勗煳⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)、功能基因、代謝機(jī)制等信息提供技術(shù)手段。一代測(cè)序以Sanger雙鏈終止法為代表，具有測(cè)序讀段長(zhǎng)（可達(dá)1 000 bp），準(zhǔn)確性高（可達(dá)99.999%）等特點(diǎn)，但存在測(cè)序成本高、測(cè)序通量低等缺點(diǎn)。二代測(cè)序技術(shù)以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa/Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為代表，具有測(cè)序成本低、測(cè)序速度快、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。三代測(cè)序以PacBio公司的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)和ONT公司的單分子納米孔測(cè)序技術(shù)為代表，具有準(zhǔn)確性高、讀長(zhǎng)超長(zhǎng)、檢測(cè)簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。目前，全基因組測(cè)序主要借助于二代和三代測(cè)序技術(shù)，這些技術(shù)在解析釀造微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性特征、功能基因及通路、溯源釀造微生物等方面得到了廣泛應(yīng)用（表1）。

1.1 二代測(cè)序技術(shù)

目前，二代測(cè)序技術(shù)在白酒釀造微生物群落方面已取得諸多成果。例如，在醬香型白酒中，ZHU C T等[18-19]研究發(fā)現(xiàn)，溫度、濕度和酸度影響曲塊微生物群落結(jié)構(gòu)和演變規(guī)律；無(wú)色桿菌屬（Achromobacter）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stentrophomonas）和代爾夫特菌屬（Delftia）是翻曲過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌，且一次翻曲操作有助于風(fēng)味功能微生物的富集，二次翻曲有利于酯化功能微生物的富集，該研究對(duì)翻曲操作進(jìn)行科學(xué)解釋。在濃香型白酒中，WANG X J等[28-29]研究發(fā)現(xiàn)，在同一窖池中，不同空間位置、不同發(fā)酵原料的窖泥微生物群落在豐度和結(jié)構(gòu)組成上具有顯著差異，其中古菌在窖泥中豐度最高，其次是細(xì)菌和真菌；并且發(fā)現(xiàn)微生物的豐富度和多樣性與窖泥年限呈正相關(guān)。在釀造環(huán)境方面，ZHU Q等[39-40]對(duì)茅臺(tái)釀造核心產(chǎn)區(qū)、和義興優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)和習(xí)酒產(chǎn)區(qū)環(huán)境空氣的微生物群落解析，發(fā)現(xiàn)茅臺(tái)釀造產(chǎn)區(qū)的微生物結(jié)構(gòu)與另外兩個(gè)產(chǎn)區(qū)顯著不同；進(jìn)一步對(duì)茅臺(tái)酒釀造環(huán)境、釀造過(guò)程、周邊環(huán)境以及其他區(qū)域共100余株釀酒酵母基因組研究，發(fā)現(xiàn)茅臺(tái)核心產(chǎn)區(qū)長(zhǎng)期的釀造活動(dòng)篩選進(jìn)化出獨(dú)特的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），為茅臺(tái)酒的釀造提供了優(yōu)質(zhì)酵母資源。

1.2 三代測(cè)序技術(shù)

近年來(lái)，三代測(cè)序技術(shù)在釀造微生物的新基因組裝與挖掘、生物學(xué)功能注釋等方面研究逐漸增多。例如，XU Y Q等[38]對(duì)從酒曲中篩選出的分散型泛菌（Pantoea dispersa）BJQ0007進(jìn)行測(cè)序，獲得了其基因組的完整圖。該菌的基因組大小為4.3 Mbp，鳥(niǎo)嘌呤（guanine，G）胞嘧啶（cytosine，C）含量為57.9%，共有4 285個(gè)基因，其中有4 176編碼基因；通過(guò)基因注釋發(fā)現(xiàn)，超三分之一的編碼基因與碳水化合物、氨基酸等代謝功能相關(guān)；進(jìn)一步的代謝通路分析表明，一些與鄰苯二甲酸酯降解相關(guān)的基因在該菌中顯著富集，而鄰苯二甲酸酯是白酒中常見(jiàn)的塑化劑。該研究加強(qiáng)了對(duì)微生物降解鄰苯二甲酸酯的認(rèn)識(shí)，也為白酒食品安全管控提供新思路。由此可見(jiàn)，三代測(cè)序技術(shù)能獲得目標(biāo)菌株的完整基因組信息，并對(duì)其基因功能進(jìn)行深入解析。

1.3 二代與三代測(cè)序技術(shù)聯(lián)合

二代與三代測(cè)序技術(shù)逐漸被聯(lián)合用于釀造微生物研究，主要研究思路是先對(duì)較大批量的菌株進(jìn)行二代測(cè)序，然后挑選代表性菌株進(jìn)行三代測(cè)序，并整合二代和三代測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)分析基因組特征。田浩杰等[17]對(duì)新篩選的醬香型高溫大曲糖萊斯氏菌（Laceyella sacchari）FBKL4.014的基因組結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行深度解析，發(fā)現(xiàn)該菌株具備碳水化合物和氨基酸代謝潛力。LIU Y B等[32]對(duì)新分離純化的高產(chǎn)蛋白酶的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）DW-7進(jìn)行蛋白編碼基因預(yù)測(cè)、代謝通路富集分析，共注釋出3 662個(gè)蛋白編碼基因，其中有196個(gè)高產(chǎn)蛋白酶基因主要富集于丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等代謝通路。

綜上可知，在白酒釀造微生物研究中，基因組測(cè)序主要用于微生物群落結(jié)構(gòu)和演變規(guī)律解析。二代測(cè)序雖然在數(shù)據(jù)分析方面存在難度，但因其通量高、成本低、精度高等優(yōu)勢(shì)被運(yùn)用得最為廣泛。三代測(cè)序雖然讀段長(zhǎng)，但目前測(cè)序錯(cuò)誤率高，且測(cè)序錯(cuò)誤隨機(jī)出現(xiàn)。因此，二代測(cè)序與三代測(cè)序的聯(lián)合，將在提高測(cè)序精度的同時(shí)，又能全面注釋和解析新基因的功能。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在白酒釀造微生物中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可以對(duì)特定時(shí)期、特定環(huán)境生物體的基因轉(zhuǎn)錄情況以及調(diào)控規(guī)律進(jìn)行研究。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，相繼出現(xiàn)了多種轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)?；虮磉_(dá)譜芯片技術(shù)是最早應(yīng)用于微生物領(lǐng)域的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，其具有效率高、成本低、可以同時(shí)測(cè)序多個(gè)樣本等優(yōu)點(diǎn)；但也存在精度較低、對(duì)低表達(dá)的基因敏感度較低、只能測(cè)已知序列等缺點(diǎn)。近年來(lái)，具有高分辨率、高靈敏度、速度快、通量大等優(yōu)點(diǎn)的核糖核酸測(cè)序（ribonucleicacidsequencing，RNA-seq）技術(shù)成為主流。此外，一些新興測(cè)序技術(shù)，如單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)等，由于成本高、通量低、操作要求高等缺點(diǎn)還尚未在微生物領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在解析釀造微生物群落中活性物種的精細(xì)組成及表征對(duì)應(yīng)功能基因和通路的表達(dá)水平中得到較廣泛應(yīng)用（表2）。

表2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在釀造微生物研究中的應(yīng)用Table 2 Application of transcriptomics technology in brewing microorganism

2.1 基因表達(dá)譜芯片技術(shù)

基因表達(dá)譜芯片采用互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）或寡核苷酸片段作探針，用基于核酸探針雜交的原理檢測(cè)基因表達(dá)水平的變化，在釀造微生物領(lǐng)域運(yùn)用極少。葉燕銳等[52]為研究釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的代謝重構(gòu)現(xiàn)象，采用表達(dá)譜芯片研究了釀酒酵母的全基因組表達(dá)譜變化。研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，許多與氨基酸合成和代謝相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，提示酵母的代謝轉(zhuǎn)向三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）和乙醛酸循環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致酒精的生產(chǎn)速率降低，該研究為深入解析酒精發(fā)酵機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

彭素琴等[41]以產(chǎn)醬香地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CGMCC 3963為研究對(duì)象，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度系統(tǒng)分析該菌在多重脅迫條件下的耐受機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下，該菌與耐高滲、耐酸、耐乙醇相關(guān)的基因表達(dá)異常；進(jìn)一步分析表明，高溫刺激能更強(qiáng)地誘導(dǎo)與其他耐受相關(guān)的特異性基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致CGMCC 3963的環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)，該研究為后續(xù)篩選和富集釀造過(guò)程中高耐受能力菌株提供了思路。

2.2 RNA-seq技術(shù)

經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，RNA-seq技術(shù)在濃香型白酒的研究中運(yùn)用較為廣泛，在其他白酒香型中應(yīng)用較少。ZHOU W等[53]應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對(duì)濃香型白酒窖底和窖四周的窖泥微生物功能及影響濃香型白酒質(zhì)量的關(guān)鍵微生物和基因進(jìn)行解析。結(jié)果表明，古菌、梭狀芽孢桿菌和一些嗜熱微生物對(duì)老窖泥功能有顯著影響，且碳水化合物和氨基酸在老窖泥中能代謝產(chǎn)生更多的有機(jī)酸，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸代謝通路有8種關(guān)鍵酶表達(dá)活躍，進(jìn)而表明有機(jī)酸代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因?qū)庀阈桶拙粕a(chǎn)質(zhì)量有重要影響。王康麗[46]對(duì)濃香型白酒釀造過(guò)程中不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)酒醅樣品中的微生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)菌群主要富集在代謝相關(guān)通路，且主要為碳水化合物代謝通路；同時(shí)也注釋出在酒醅發(fā)酵過(guò)程中參與調(diào)控細(xì)胞代謝和生理過(guò)程的基因，該研究為揭示濃香型白酒發(fā)酵機(jī)理及發(fā)酵過(guò)程調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

綜上可知，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可以表征微生物的基因表達(dá)水平和代謝通路激活情況。隨著現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的不斷成熟，新興轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)如單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)等的快速發(fā)展，將有助于了解微生物在不同情況下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及調(diào)控信息，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)也將更廣泛的被應(yīng)用在釀造微生物研究。

3 蛋白組學(xué)技術(shù)在白酒釀造微生物中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以對(duì)特定時(shí)期、特定環(huán)境下生物體的蛋白質(zhì)組成特征、表達(dá)水平、變化規(guī)律及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。目前主流的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)有雙向凝膠電泳（twodimensional electrophoresis，2-DE），蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量（label-free quantification，LFQ）、同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）、串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tags，TMT）和數(shù)據(jù)非依賴性采集（data-independent acquisition，DIA）技術(shù)等。目前，蛋白組學(xué)技術(shù)已被成功用于釀造微生物蛋白圖譜構(gòu)建、差異蛋白研究及功能蛋白發(fā)掘（表3）。

表3 蛋白組學(xué)技術(shù)在釀造微生物研究中的應(yīng)用Table 3 Application of proteomics technology in brewing microorganism

3.1 2-DE技術(shù)

2-DE技術(shù)建立于1975年，其原理根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量的不同，在兩個(gè)維度對(duì)復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，是蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用最早且應(yīng)用范圍最廣的核心技術(shù)之一，但該技術(shù)存在重復(fù)性差、靈敏度低、覆蓋率低等缺點(diǎn)。近年來(lái)，該技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合可用于蛋白質(zhì)定性和鑒定差異蛋白。劉龍山[56]為了解醬香高溫大曲中多酶系的組成和功能，采用2-DE技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析對(duì)普通高溫大曲和強(qiáng)化高溫大曲中的蛋白質(zhì)組成進(jìn)行鑒定和比較。研究首先在強(qiáng)化高溫大曲和普通高溫大曲中分別鑒定出185種和165個(gè)蛋白，進(jìn)一步的差異分析發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)化高溫大曲相比普通高溫大曲共有24個(gè)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，4個(gè)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，這些蛋白主要與蛋白水解酶、糖代謝、次生代謝產(chǎn)物合成等相關(guān)。

3.2 LFQ技術(shù)

LFQ是一種不依賴于同位素標(biāo)記的非標(biāo)記蛋白組定量技術(shù)，只需分析大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)時(shí)所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量，該技術(shù)具有實(shí)驗(yàn)靈活性強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前，LFQ技術(shù)主要應(yīng)用于酒曲糖化酶鑒定及圖譜構(gòu)建方向。如，WANG B W等[63]利用LFQ技術(shù)對(duì)白酒發(fā)酵過(guò)程的糖化酶及其功能進(jìn)行解析，結(jié)果共鑒定出51種與白酒發(fā)酵相關(guān)的碳水化合物水解酶，且80%的碳水化合物水解酶是由酒曲提供的；其中，來(lái)自曲霉屬（Aspergillus）和根霉屬（Rhizopus）產(chǎn)生的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶是白酒發(fā)酵的關(guān)鍵糖化酶，該研究揭示了白酒發(fā)酵過(guò)程中多種糖化酶對(duì)乙醇產(chǎn)量的協(xié)同作用。

3.3 iTRAQ技術(shù)

iTRAQ是由美國(guó)AB Sciex公司研發(fā)的多肽體外標(biāo)記定量技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)采用不同數(shù)量同位素標(biāo)簽特異性標(biāo)記多肽氨基酸基團(tuán)，即可實(shí)現(xiàn)不同樣本中蛋白質(zhì)的相對(duì)定量。該技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確性高、通量高、鑒定深度高等優(yōu)勢(shì)，是近年來(lái)定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。目前，iTRAQ技術(shù)主要應(yīng)用于釀造微生物的功能蛋白篩選及差異蛋白表征方向。如在米香型白酒中，HUANG G D等[57]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)探索了酒曲微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，研究共鑒定出4 062個(gè)蛋白，其中上調(diào)表達(dá)蛋白123個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白88個(gè)；代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)蛋白顯著富集于碳代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、丙酮酸代謝、碳水化合物代謝通路等；進(jìn)一步的差異蛋白調(diào)控趨勢(shì)和碳代謝通路分析提示，銨代償促進(jìn)了葡萄糖消耗，導(dǎo)致本應(yīng)進(jìn)入高級(jí)醇合成途徑的碳流被逆轉(zhuǎn)到三羧酸循環(huán)（TCA），從而降低了高級(jí)醇的含量。因此，基于iTRAQ技術(shù)可高效鑒定出不同樣本間的差異蛋白，并對(duì)其影響的生物學(xué)通路進(jìn)行研究。

3.4 DIA技術(shù)

DIA技術(shù)是將質(zhì)譜整個(gè)全掃描范圍分為若干個(gè)小窗口，然后高速、循環(huán)地對(duì)每個(gè)窗口中所有離子進(jìn)行選擇、碎裂、檢測(cè)，從而獲得樣本中所有離子的全部碎片信息，對(duì)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步生物信息學(xué)分析即可對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定、定量及差異蛋白分析等。該技術(shù)具有高覆蓋率、超高準(zhǔn)確率、高通量、高穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)。劉龍山[56]以醬香大曲為研究對(duì)象，采用DIA技術(shù)對(duì)大曲酶系在苯丙氨酸代謝中的功能進(jìn)行解析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在醬香大曲中共鑒定到1 965個(gè)蛋白，其中參與苯丙氨酸代謝的蛋白有31個(gè)，涉及11種酶，包括醛脫氫酶、酰胺酶、轉(zhuǎn)氨酶等；進(jìn)一步的功能分析發(fā)現(xiàn)，在這些酶和一些微生物的作用下苯丙氨酸可代謝合成芳香族化合物苯乙酸、苯乙醛，這些化合物為醬香大曲提供花果香，該研究為醬香型白酒風(fēng)味的形成提供理論基礎(chǔ)。

綜上可知，在眾多蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法中，2-DE技術(shù)雖然經(jīng)典但因分離能力有限、操作程序復(fù)雜等原因已逐漸被淘汰；LFQ成本較低，但只可以檢測(cè)到低豐度和高豐度蛋白質(zhì)；iTRAQ適合樣本量且需要精度較高的研究，樣本量大且需要高覆蓋率則DIA更為合適。因此，iTRAQ和DIA等定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已被常用于解析釀造微生物功能蛋白和繪制糖化酶圖譜，為系統(tǒng)研究微生物的代謝調(diào)控提供技術(shù)支持。

4 代謝組學(xué)技術(shù)在白酒釀造微生物中的應(yīng)用

代謝組學(xué)技術(shù)是對(duì)生物體在特定時(shí)期或特定狀態(tài)下的低分子質(zhì)量（＜1 500 Da）代謝產(chǎn)物、激素和信號(hào)分子的規(guī)律進(jìn)行分析。根據(jù)研究目的的不同，代謝組學(xué)可進(jìn)一步分為非靶向（無(wú)偏向性的檢測(cè)所有小分子代謝物）和靶向代謝組學(xué)（針對(duì)特定一類代謝物）。根據(jù)分析手段的不同，代謝組學(xué)技術(shù)可分為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）、全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（comprehensive two dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF/MS）等。這些技術(shù)已經(jīng)在釀造微生物代謝化合物組成與變化、代謝化合物與風(fēng)味有著廣泛的應(yīng)用（表4），在一定程度上推動(dòng)了白酒釀造機(jī)理的探索進(jìn)程。

表4 代謝組學(xué)技術(shù)在釀造微生物中的應(yīng)用Table 4 Application of metabolomics technology in brewing microorganism

4.1 GC-MS技術(shù)

GC-MS技術(shù)采用氣相色譜分離樣品，根據(jù)色譜保留時(shí)間和離子質(zhì)荷比進(jìn)行定性，基于色譜峰面積進(jìn)行定量。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性香氣成分的分析，其具有色譜的高分離度、高通量及質(zhì)譜的高靈敏度和特異性，但存在樣本前處理比較復(fù)雜、產(chǎn)生的數(shù)據(jù)難以充分利用的缺點(diǎn)。目前，GC-MS在微生物代謝組學(xué)的研究運(yùn)用得較為廣泛。例如，楊輝等[65]為研究鳳香型基酒儲(chǔ)存過(guò)程中化合物的變化規(guī)律，采用GC-MS對(duì)6組不同年份鳳香型基酒的化合物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在新酒中檢測(cè)到的化合物共有51種，是所有年份基酒中化合物種類最少的，而經(jīng)過(guò)2年以上酒海貯存的基酒中化合物種類增多到了59種，說(shuō)明貯存時(shí)間越長(zhǎng)，化合物種類和含量越多。進(jìn)一步的變量重要性分析篩選出包括有機(jī)酸、氨基酸、糖類等共20種差異化合物，這些物質(zhì)在貯存過(guò)程中含量發(fā)生顯著變化，該研究為深入解析白酒老熟機(jī)理提供一定的理論指導(dǎo)。

4.2 LC-MS技術(shù)

LC-MS技術(shù)主要原理是采用液相色譜分離樣品，根據(jù)色譜保留時(shí)間、母離子質(zhì)荷比和二級(jí)碎片離子圖譜進(jìn)行定性，采用一級(jí)質(zhì)譜獲得的母離子峰面積進(jìn)行定量。該技術(shù)被廣泛用于非揮發(fā)性香氣成分的分析，具有快速、高效、高靈敏度和高置信等優(yōu)勢(shì)；但存在基質(zhì)效應(yīng)，導(dǎo)致目標(biāo)物的離子化效率降低或增強(qiáng)，引起響應(yīng)降低或增高。LUO S等[68]為研究醬香黑曲的形成機(jī)制，采用LC-MS對(duì)從發(fā)酵倉(cāng)隨機(jī)采集39份大曲樣本的代謝物進(jìn)行檢測(cè)和比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從所有樣品中共鑒定出1 062種相對(duì)豐度不同的代謝化合物；差異分析發(fā)現(xiàn)，相比于白曲和黃曲，黑曲中有251種代謝物含量上調(diào)；進(jìn)一步的代謝通路功能分析表明，這些上調(diào)的代謝化合物顯著富集于酪氨酸代謝通路，而該通路與酶促褐變和黑色素生成相關(guān)。該研究為控制黑曲的形成和提高白酒品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

4.3 GC×GC-TOF/MS技術(shù)

GC×GC-TOF/MS可以檢測(cè)到更多一維方法無(wú)法分離的色譜峰，相比于常規(guī)氣質(zhì)聯(lián)用具有高容量、高分離度和高靈敏度等顯著優(yōu)勢(shì)，是解析復(fù)雜物質(zhì)與檢測(cè)未知物質(zhì)的重要技術(shù)手段。該技術(shù)存在的主要缺點(diǎn)是在全掃描模式下靈敏度低，對(duì)于檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)中痕量成分時(shí)存在誤差。在醬香型白酒中，YANG L等[66]為研究高溫黃曲、白曲和黑曲三種類型的代謝物組成不明確、發(fā)酵性能不清晰等問(wèn)題，采用GC×GC-TOF/MS技術(shù)對(duì)高溫大曲中的化合物進(jìn)行解析，研究共發(fā)現(xiàn)高溫大曲有647種化合物，其中有401種揮發(fā)性化合物和246種難揮發(fā)化合物；同時(shí)對(duì)大曲物質(zhì)形成的代謝通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有21條通路與大曲代謝表型差異相關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析篩查出48個(gè)可用于區(qū)分不同類型大曲的生物標(biāo)志物，主要為醇類、芳香族化合物及難揮發(fā)的酸類化合物，該研究對(duì)揭示大曲代謝機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，也促進(jìn)了不同類型高溫大曲的有效應(yīng)用及醬香型白酒的高質(zhì)量釀造。

綜上可知，代謝組學(xué)技術(shù)在解析釀造微生物代謝化合物領(lǐng)域運(yùn)用廣泛。盡管目前代謝組學(xué)技術(shù)還在儀器分析范圍存在局限、數(shù)據(jù)分析繁瑣、數(shù)據(jù)庫(kù)不完整等挑戰(zhàn)，但隨著技術(shù)的不斷發(fā)展以及數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，代謝組學(xué)技術(shù)在未來(lái)的釀造微生物代謝研究中仍將占主導(dǎo)地位。

5 多組學(xué)技術(shù)在白酒釀造微生物中的應(yīng)用

白酒特征風(fēng)味的形成是由多個(gè)代謝通路協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜調(diào)控過(guò)程，僅從群落組成、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)或代謝物等的任一層次都無(wú)法全面揭示其中的機(jī)制。多組學(xué)分析是指將兩種或兩種以上由組學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行有效整合，從而實(shí)現(xiàn)不同層次數(shù)據(jù)的互補(bǔ)，有助于增強(qiáng)對(duì)微生物與微生物、微生物與環(huán)境之間復(fù)雜相互作用解析。目前，多組學(xué)分析已被用于解析微生物群落多樣性與風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理、功能活性及代謝特征之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制等方面（表5）。

表5 多組學(xué)技術(shù)在釀造微生物研究中的應(yīng)用Table 5 Application of multi-omics technology in brewing microorganism

基因組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)的聯(lián)合分析在釀造微生物研究中尤為常見(jiàn)。例如，MU Y等[82]探討了太空誘變和生物合成的兩種生物擾動(dòng)對(duì)濃香大曲微生物群落、理化性質(zhì)和代謝特征的影響。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)生物擾動(dòng)后乳酸菌和曲霉菌數(shù)量顯著減少，而酶的活性都升高；此外，在鑒定出的14種芳香活性揮發(fā)物和51種差異代謝物中，大多數(shù)在生物擾動(dòng)后含量都升高，如吡嗪類、醇類、小肽類和碳水化合物；進(jìn)一步相關(guān)性分析和代謝通路分析表明，大曲風(fēng)味品質(zhì)的差異主要與細(xì)菌群落有關(guān)，其中與芽孢桿菌（Bacillus）等相關(guān)性最為顯著，該研究對(duì)闡明大曲風(fēng)味形成機(jī)理和推動(dòng)生物擾動(dòng)技術(shù)在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用提供了參考。

基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)技術(shù)的聯(lián)合分析也逐漸開(kāi)始流行。如TAN Y W等[85]為了評(píng)估白酒風(fēng)味化合物和微生物生態(tài)的地理特征，從全中國(guó)9個(gè)代表性酒廠收集了403個(gè)發(fā)酵樣品，通過(guò)聯(lián)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和可培養(yǎng)驗(yàn)證等技術(shù)手段進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國(guó)白酒不同香型的風(fēng)味特征差異主要體現(xiàn)在20～40個(gè)不同的特征風(fēng)味化合物的組成上，而微生物菌群的區(qū)域差異微生物生態(tài)主要是48～156個(gè)核心微生物的共同作用，進(jìn)而形成了不同香型白酒的產(chǎn)區(qū)特征優(yōu)勢(shì)；進(jìn)一步功能分析發(fā)現(xiàn)，基于真菌-細(xì)菌相互作用與菌群組裝模式，可能與白酒發(fā)酵優(yōu)質(zhì)率、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)特征相關(guān)，該研究為闡明中國(guó)白酒產(chǎn)區(qū)的地域微生態(tài)釀造優(yōu)勢(shì)提供了新證據(jù)。

綜上可知，在解析釀造微生態(tài)研究方面，多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合比單一組學(xué)技術(shù)更具優(yōu)勢(shì)。例如，基因組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，可以實(shí)現(xiàn)不同微生物群落差異表達(dá)基因和代謝通路表達(dá)分析，有助于鑒定群落的特征基因、核心代謝通路，系統(tǒng)解析釀造微生物的功能機(jī)制。因此，多組學(xué)聯(lián)合分析有助于全面了解白酒釀造過(guò)程的復(fù)雜性和整體性，加深對(duì)釀造微生物的多層次認(rèn)識(shí)，未來(lái)多組學(xué)整合將是白酒釀造微生物研究中的大趨勢(shì)。

6 結(jié)論與展望

白酒風(fēng)味形成主要由釀造體系內(nèi)菌系、酶系和物系的共同作用。越來(lái)越多的研究表明，使用單一的組學(xué)技術(shù)并不能系統(tǒng)解析白酒發(fā)酵過(guò)程。多組學(xué)技術(shù)可以從基因水平到轉(zhuǎn)錄水平到蛋白水平到代謝水平對(duì)白酒釀造微生物的多樣性和風(fēng)味成分進(jìn)行系統(tǒng)研究。但目前多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用價(jià)格較貴，且產(chǎn)生的數(shù)據(jù)維度高、異質(zhì)性高、價(jià)值密度稀疏等特點(diǎn)，導(dǎo)致算法模型的精確度和靈敏度受到影響。此外，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方法尚不能對(duì)數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行完整驗(yàn)證，導(dǎo)致從研究數(shù)據(jù)指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)還存在困難。當(dāng)然，隨著近年來(lái)人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)的不斷發(fā)展，將有助于挖掘多組學(xué)數(shù)據(jù)中隱含的知識(shí)和規(guī)律。因此，研究人員要與時(shí)俱進(jìn)，積極將大數(shù)據(jù)和人工智能領(lǐng)域的新興技術(shù)引用到釀造微生物領(lǐng)域來(lái)，加強(qiáng)與多組學(xué)數(shù)據(jù)的聯(lián)動(dòng)，全面解析釀造微生物機(jī)理，實(shí)現(xiàn)白酒生產(chǎn)科學(xué)化和標(biāo)準(zhǔn)化，助推中國(guó)白酒高質(zhì)量生產(chǎn)。