彭怡 許紅玉 黃厚強 張曲

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM），簡稱為單增李斯特氏菌，是一種需氧兼性厭氧的食源性病原菌、革蘭氏陽性短桿菌，廣泛存在于自然界中。其中，奶制品、肉制品、水產(chǎn)品、海產(chǎn)品、禽類食品、蔬菜等容易受到該菌污染，誤食用含有該菌的新生兒、老年人等免疫力低者易患腦膜炎、敗血癥，孕婦則易發(fā)生早產(chǎn)或流產(chǎn)，致死率高達20%-30%，給食品安全造成嚴重威脅。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于單增李斯特氏菌的主要檢測方法包括國標法、免疫學檢測法、生物傳感器檢測法等，這些方法各有優(yōu)缺點。能力驗證通過對實驗室間的檢驗能力進行比對，評價參加者的能力，是證明實驗室檢驗能力的重要方式之一。資陽市食品藥品檢驗檢測中心生物檢驗科參加了由四川省食品檢驗研究院組織的“食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗能力驗證”，采用國標法《GB 4789.30-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》第一法對樣品進行定性檢驗。

一、材料與方法

1.樣品。由四川省食品檢驗研究院提供3份單核細胞增生李斯特氏菌樣品，每份樣品包括一瓶白色球狀西林瓶裝和一袋質(zhì)量約為25g的奶粉，樣品編號分別為LM-029、LM-177和LM-307。

2.菌種。單增李斯特氏菌ATCC 19115、斯氏李斯特氏菌ATCC 35967、伊氏李斯特氏菌ATCC 19119、英諾克李斯特氏菌ATCC 33090，均由廣東環(huán)凱生物科技有限公司提供。

3.主要試劑。腦心浸出液肉湯（BHI）、李氏菌增菌肉湯（LB1，LB2）基礎(chǔ)、PALCAM瓊脂、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、SIM生化管、HBI單增李斯特氏菌生化鑒定條（GB），購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、PALCAM瓊脂、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、血平板、革蘭氏染色液試劑盒、3%過氧化氫、單增李斯特氏菌干制生化鑒定試劑盒，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

4.主要儀器。電子天平（上海浦春 JEB602），恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海躍進 LRHS-150-II），生化培養(yǎng)箱（上海躍進 SPX-300-II），生物安全柜（蘇州博萊爾 BHC-1300IIB2），立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安 LDZH-150KBS），顯微鏡（Leica 1349522X）。

5.方法。依據(jù)四川省食品檢驗研究院提供的《食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗能力驗證作業(yè)指導書》和《GB 4789.30-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》第一法對樣品進行定性檢驗。

二、過程與結(jié)果

1.樣品的前處理。在生物安全柜內(nèi)將單核細胞增生李斯特氏菌樣品的西林瓶打開，取225mL滅菌LB1增菌液，加入到無菌均質(zhì)袋中，并將西林瓶內(nèi)白色小球加入LB1增菌液中，充分溶解。然后將與西林瓶相同編碼的奶粉樣品加入到上述LB1增菌液中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1-2min，使其混勻。依此方法分別對3份樣品進行處理。

2.增菌。于（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mL LB2增菌液內(nèi)，于（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。

3.分離。取LB2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24-48h，觀察各個平板上生長的菌落。典型菌落在 PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征，參照產(chǎn)品說明進行判定。

4.初篩及鑒定。自選擇性瓊脂平板上分別挑取3-5個典型或可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，同時在TSA-YE平板上劃線，于（36±1）℃培養(yǎng)18-24h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進行染色鏡檢、動力實驗、生化鑒定及溶血實驗。

5.結(jié)果。通過國標法檢驗與鑒定，樣品LM-177檢出單核細胞增生李斯特氏菌，樣品LM-029和LM-307未檢出，各樣品增菌和分離結(jié)果如表1和圖1-圖4所示，鑒定結(jié)果如表2和圖5-圖6所示。

三、討論與分析

顯色培養(yǎng)基是一種基于生化反應的微生物鑒定技術(shù)，通過加入特定底物，在特異性酶的作用下，發(fā)色基團游離并顯色，從而對菌種進行鑒別。通過圖1-圖4可以觀察到，PALCAM培養(yǎng)基雖然可以分離出李斯特氏菌，但不能有效區(qū)分單增李斯特氏菌和其他李斯特氏菌，所有種類的李斯特氏菌均為灰綠色菌落且菌落周圍都能產(chǎn)生棕黑色暈圈；而李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基能夠通過藍綠色菌落且周圍有無不透明環(huán)，有效區(qū)分單增李斯特氏菌和其他李斯特氏菌，其特異性明顯高于PALCAM培養(yǎng)基。最終，資陽市食品藥品檢驗檢測中心生物檢驗科在此次能力驗證考核中獲得的結(jié)果為“滿意”。

雖然順利通過了考核，但實驗中仍有許多需要注意、改進和總結(jié)的地方。例如，剛開始制備李斯特氏菌顯色平板，在添加配套試劑時，可能是因為沒有很好地把控培養(yǎng)基溫度，也可能是因為沒有一邊少量多次加入添加劑一邊搖晃玻璃瓶，導致培養(yǎng)基出現(xiàn)許多絮狀物，不得不重新配制新的顯色培養(yǎng)基。再如，在李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基的產(chǎn)品說明書中，為避免產(chǎn)生假陽性結(jié)果（菌落周圍出現(xiàn)不透明環(huán)），有的廠家建議培養(yǎng)24h，有的則建議培養(yǎng)24-48h，實際操作過程中我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48h的樣品菌落更大、更明顯。而為了避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，我們挑取了三個樣品的所有典型和可疑菌落分別進行后續(xù)鑒定試驗，在生化鑒定（圖5）中觀察到，三個樣品的生化鑒定結(jié)果與目標菌——單增李斯特氏菌一模一樣，為此只能再通過溶血試驗（圖6）進行觀察與判斷。但溶血試驗的操作難度較大，要求穿刺時在不能使瓊脂破裂的情況下盡量接近底部，否則很容易出現(xiàn)漏檢或者假陽性的可能。

通過此次能力驗證，我們不僅找到不足之處，還通過實驗分析尋找到解決問題的方法和對策，積累了許多經(jīng)驗教訓，提高了自身的檢驗能力。

作者簡介：彭怡（1994-），女，漢族，四川成都人，工程師，碩士研究生，研究方向為微生物相關(guān)檢測。

*通信作者：張曲（1991-），女，漢族，四川自貢人，工程師，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全及質(zhì)量控制。