◎ 吳綺霞，高前程，梁枝聰，郭亞娟，高業(yè)成，豐時運

（1.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山 528400；2.完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528400）

腸道運動能力的強弱在一定程度上影響著腸道的生理功能，最終影響著人體的健康[1]。腸道動力紊亂是腸易激綜合征（Irritable Bowel Syndrome，IBS）癥狀發(fā)生的重要病理表現[2]。以腹瀉為主的IBS 患者呈腸道動力亢進的表現，腸道收縮次數增加，排泄次數頻繁，大便性狀改變；便秘型IBS 則表現為腸道動力不足，排泄困難。此外，還有以上兩種腸動力異常類型的混合型及不定型IBS。這類疾病的發(fā)病機制可能與飲食、內臟敏感性、神經心理、胃腸道炎癥和腸道動力紊亂等多種因素相關[3]。

益生菌是一種具有多種益生作用的微生物，對人體健康有重要作用。具有腸道定植能力的益生菌能通過改善腸道菌群提高消化系統(tǒng)的營養(yǎng)吸收能力以及機體免疫力[4-6]。所以，研究開發(fā)能夠調節(jié)腸道動力的益生菌功能食品，有助于對腸道動力紊亂疾病進行有效的預防和治療。

斑馬魚被廣泛應用于研究疾病機制和藥物研發(fā)及篩選[7-8]，其與人類的遺傳基因高度相似，且其腸道結構和解剖結構與哺乳動物非常相似[9]，是腸道疾病研究的理想模型。發(fā)育至5～6 d 的幼魚，腸道會自發(fā)蠕動，可通過統(tǒng)計幼魚腸道蠕動次數評價藥物的腸道功能活性[10]。本文利用斑馬魚模型，研究了益生菌復合制劑中的復合益生菌定植能力、促進腸道蠕動作用以及緩解由番瀉葉引起的非細菌性腹瀉作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生型AB 品系斑馬魚，自然成對交配繁殖，年齡為受精后4～5 d，用于腸腔定植、促腸道蠕動、改善非細菌性腹瀉實驗。用28 ℃養(yǎng)魚用水（pH 值為6.5～8.5，硬度為50～100 mg·L-1CaCO3，電導率為450～550 μS·cm-1）飼養(yǎng)斑馬魚，實驗所用斑馬魚由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心提供，實驗動物使用許可證號為 SYXK（浙）2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國際 AAALAC 認證（認證編號：001458）要求。

1.2 材料與試劑

益生菌復合制劑（主要成分為植物乳植桿菌LPPerfectus?001、鼠李糖乳酪桿菌LRPerfectusTM158、鼠李糖乳酪桿菌HN001、嗜酸乳桿菌NCFM、動物雙歧桿菌乳亞種HN019），由完美（廣東）日用品有限公司提供，淡紫紅色粉末，1.5 g/袋，345 億CFU/袋，-20 ℃保存。使用前將益生菌復合制劑常溫放置1 h，準確稱取0.15 g 于15 mL 離心管中，向其中加入10 mL 0.01 mol·L-1PBS，振蕩混合均勻，益生菌的最終濃度為3.45×108CFU·mL-1。將菌液于4 ℃，4 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，并重復2 次，將益生菌復合制劑中添加的輔料清洗干凈，現配現用。尼羅紅Nile Red：批號SLBP9326V，Sigma，用DMSO 配制成濃度為 10 mg·mL-1的母液，-20 ℃保存，使用前用胚胎培養(yǎng)液配制成10 ng·mL-1溶液。CM-DiI（紅色熒光）：批號C5324420，翌圣，使用前，加入50 μL DMSO 使其徹底溶解，然后使用PBS 將其稀釋至工作濃度5 μg·mL-1，現配現用。二甲基亞砜（DMSO）：批號20210701，天津市大茂化學試劑廠；甲基纖維素：批號20210402，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）：批號8122734，gibco 公司；番瀉葉提取物：批號A3042221，由廣東一方制藥有限公司提供，番瀉苷A（C43H38O20）和番瀉苷B（C42H38O20）的含量為12.2 mg·g-1，使用前用胚胎培養(yǎng)液配制成8 mg·mL-1溶液。胚胎培養(yǎng)液：分別稱取7.000 g NaCl、0.400 g NaHCO3、0.100 g KCl、0.235 g CaCl2用超純水溶解，定容至2 L 容量瓶。使用真空過濾器（孔徑0.2 μm）過濾后滅菌備用。實驗用水均為雙蒸水。6 孔、12 孔細胞培養(yǎng)板，康寧公司。

1.3 儀器與設備

BX43 正置熒光顯微鏡，OLYMPUS 公司；ZXGPA2160 恒溫培養(yǎng)箱，上海智成分析儀器制造有限公司；愛生研究級斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)；MS1003S/01 電子分析天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；5430/R 小型臺式高速冷凍離心機，Eppendorf。

1.4 實驗方法

1.4.1 復合益生菌在斑馬魚腸腔定植存活實驗

根據前期實驗確定復合益生菌對正常斑馬魚的無可見有害作用（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）濃度為3.45×108CFU·mL-1。在經前處理后的菌體中加入10 mL 含5 μg·mL-1CM-Dil 的1×PBS 溶液，37 ℃孵育20 min，孵育結束后離心收集菌體，并用0.01 mol·L-1PBS 清洗兩遍，再次離心后加入10 mL 胚胎培養(yǎng)液振蕩混合均勻，復合益生菌終濃度為3.45×108CFU·mL-1。

隨機挑選發(fā)育正常的5 dpf 斑馬魚胚胎置于12 孔板中，每孔15 尾，每孔加入熒光標記后的益生菌菌液1 mL，28 ℃培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)24 h，于共培養(yǎng)期間的2 h、6 h、18 h、24 h 進行拍照，分別隨機選取10 尾斑馬魚，用正置熒光顯微鏡拍照，觀察各時間段內復合益生菌于其腸腔內分布情況。共同培養(yǎng)結束后，用無菌的胚胎培養(yǎng)液將斑馬魚胚胎清洗3 次，轉入到新的孔板中，每天更換胚胎培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 dpf。于胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)的2 h、6 h、18 h、24 h 和48 h 進行熒光拍攝，觀察移除復合益生菌培養(yǎng)后，斑馬魚腸腔內熒光情況。用ImageJ 圖像處理軟件進行熒光圖像分析，計算斑馬魚腸腔內熒光強度。

1.4.2 對斑馬魚腸道蠕動的促進作用評價

本實驗參考賈福懷等[11]實驗方法，并加以修改。在經前處理后的菌體中加入10 mL 胚胎培養(yǎng)液振蕩混合均勻，使復合益生菌濃度為3.45×108CFU·mL-1。隨機挑選5 dpf 幼魚，水溶給予尼羅紅（終質量濃度為10 ng·mL-1）于28 ℃培養(yǎng)箱避光暴露4 h，使斑馬魚腸道完全充滿尼羅紅染料。尼羅紅暴露結束，清洗染色后的斑馬魚3 次，將斑馬魚隨機分配于六孔板中，每孔30 尾斑馬魚，給予前處理后的益生菌3.45×108CFU·mL-1，同時設置正常對照組，于28 ℃培養(yǎng)箱避光暴露12 h，期間不投餌。暴露12 h 后，每組隨機選取10 尾斑馬魚，使用熒光顯微鏡進行觀察和拍照，使用ImageJ 軟件處理圖像并計算腸道尼羅紅熒光強度（S），以腸蠕動促進率評價樣品對斑馬魚腸蠕動的促進作用。斑馬魚腸蠕動促進作用計算公式為

式中：S1為正常對照組平均值，Pixels；S2為復合益生菌實驗組平均值，Pixels。

1.4.3 緩解斑馬魚非細菌性腹瀉功效評價

本實驗參考趙文嘉[12]實驗方法，并加以修改。隨機挑選5 dpf 幼魚，分配于6 孔板中，每孔各30 尾，設置正常對照組、模型對照組、復合益生菌實驗組。除正常對照組外，其余各組均給予番瀉葉溶液8 mg·mL-1的方式建立斑馬魚非細菌性腹瀉模型，于28 ℃培養(yǎng)箱避光處理10 h。造模結束后，清洗至少3 遍，復合益生菌實驗組加入前處理后的益生菌3.45×108CFU·mL-1，模型對照組、正常對照組加入胚胎培養(yǎng)液，于28 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)6 h。最后各實驗組斑馬魚避光暴露于尼羅紅水溶液中（終質量濃度10 ng·mL-1），于28 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)3 h。孵育結束后清洗3 遍，每組隨機選取10 尾斑馬魚，使用熒光顯微鏡進行觀察和拍照，使用ImageJ 軟件處理圖像并計算腸道熒光強度（F），以腹瀉緩解率評價樣品改善非細菌性腹瀉的功效，斑馬魚改善非細菌性腹瀉的緩解作用計算公式為

式中：F1為復合益生菌實驗組平均值，Pixels；F2為正常對照組平均值，Pixels；F為模型對照組平均值，Pixels。

1.4.4 數據統(tǒng)計分析

腸道蠕動促進評價及緩解腹瀉功效評價實驗結果采用均值±標準差表示，斑馬魚腸腔益生菌定植存活實驗結果采用均值±標準誤差表示。結果使用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計和單因素方差分析，用Dunnett's-t檢驗進行統(tǒng)計，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 復合益生菌在斑馬魚腸腔定植實驗

大腸和小腸是益生菌發(fā)揮作用的消化部位，而益生菌能否最終發(fā)揮應有的功用，則需要它們在腸道存活一定時間[13]。如果益生菌不能黏附定植，就將成為過路菌，直接被排除出體外。如圖1、圖2 所示，斑馬魚與CM-Dil 紅色熒光標記的復合益生菌共同培養(yǎng)2 h、6 h、18 h、24 h 后，其腸腔的熒光逐漸增強，2 h 時，復合益生菌已經進入斑馬魚腸腔。與2 h 對比，6 h 時充滿腸腔，24 h時熒光強度達到最高。共同培養(yǎng)24 h后，腸道熒光強度均隨時間的推移逐漸下降，且在24 h 仍有熒光信號。從實驗結果可知，該復合益生菌可在腸腔定植，并可存活24 h 以上。

圖1 不同時間段斑馬魚腸道中的復合益生菌熒光強度典型圖

圖2 不同時間段斑馬魚腸道中的復合益生菌熒光強度圖

2.2 復合益生菌對斑馬魚腸道蠕動的促進作用

給斑馬魚喂食尼羅紅一定時間后，斑馬魚腸道內會充滿尼羅紅，但腸道內的尼羅紅不會被斑馬魚吸收。因此，在尼羅紅熒光淬滅之前，通過斑馬魚腸道內尼羅紅熒光信號的強弱可判定斑馬魚腸腔內蠕動狀況[14]。尼羅紅水溶液染色4 h 后斑馬魚腸腔內熒光情況見圖3。使用ImageJ 圖像處理軟件計算斑馬魚腸腔內熒光強度，分析該復合益生菌對斑馬魚腸道蠕動促進作用，結果見表1。由表1 可知，與正常對照組相比，斑馬魚給予復合益生菌6 h后，斑馬魚腸腔內的熒光強度顯著降低，腸道蠕動促進率為28.68%（P＜0.05），表明該益生菌復合制劑對斑馬魚腸蠕動有一定的促進作用。

表1 斑馬魚腸腔熒光強度以及復合益生菌對斑馬魚腸道蠕動促進率結果表

圖3 復合益生菌對斑馬魚腸道蠕動促進作用典型圖

2.3 復合益生菌緩解斑馬魚非細菌性腹瀉

番瀉葉有效成分主要為番瀉苷A、B，經消化系統(tǒng)吸收分解后，分解產物蒽醌會刺激骨盆神經節(jié)以收縮大腸，引起腹瀉[15]。復合益生菌對番瀉葉提取物誘導斑馬魚非細菌性腹瀉結果見圖4。使用ImageJ 圖像處理軟件計算斑馬魚腸腔內熒光強度，分析該款復合益生菌緩解非細菌性腹瀉效果，結果見表2。由表2可知，與模型對照組相比，正常對照組腸腔內熒光強度極極顯著增加（P＜0.001）。斑馬魚腸道內容物減少，出現類似腹瀉癥狀。斑馬魚給予復合益生菌6 h 后，相比于模型對照組，斑馬魚腸腔內的熒光強度顯著增加，腹瀉緩解率為30.25%（P＜0.05），表明該益生菌復合制劑對斑馬魚非細菌性腹瀉具有一定的緩解作用。

表2 斑馬魚腸腔熒光強度以及復合益生菌對斑馬魚緩解非細菌性腹瀉效果結果表

圖4 該復合益生菌對斑馬魚非細菌性腹瀉緩解作用典型圖

3 討論

3.1 益生菌的腸道定植能力

目前的研究表明，益生菌具有改善腸道微生態(tài)平衡、增強機體免疫、調節(jié)腸道動力、促進營養(yǎng)物質吸收等多種功效，主要通過4 種機制發(fā)揮作用：抑制病原菌、增強腸道上皮屏障功能、調節(jié)宿主免疫功能以及參與腸-腦軸調節(jié)[16]。在機體中益生菌主要存在于胃、小腸和大腸中[17]。因此，能夠在腸道定植是益生菌發(fā)揮作用的關鍵?？诜且环N常見的益生菌攝入方式，但由于胃腸道環(huán)境特殊，大多數定植能力差的益生菌無法在腸道內長時間存活，在食用后不久便會排出體外，導致無法發(fā)揮出應有的益生作用[18]。

在有關益生菌腸道定植能力的研究中，CHEN等[16]通過給予斑馬魚乳雙歧桿菌，發(fā)現在6 h 時益生菌可充滿斑馬魚腸腔，且可存活24 h 以上。郭亞娟等[19]通過給予斑馬魚復合益生菌，發(fā)現4 h 時斑馬魚腸腔已布滿益生菌，并可以在腸腔中穩(wěn)定存活。在本研究中，在斑馬魚與益生菌共同培養(yǎng)期間，隨著培養(yǎng)時間的增加，斑馬魚腸道中檢測出的熒光信號強度逐漸增強，在6 h 時復合益生菌布滿腸道，24 h 時腸道內總熒光強度達到最高12 781.90±725.91；在無益生菌培養(yǎng)期間，48 h 時仍可在斑馬腸道內檢測到熒光信號，表明該款益生菌復合制劑中添加的益生菌具有較好的腸道定植能力。

3.2 益生菌的促腸道蠕動作用

隨著飲食的變化和持續(xù)的社會以及心理壓力，IBS 的患病人數也在逐年上升，通?；颊哂兄煌潭鹊谋忝匕Y狀[20]。在以往的研究中，一般使用營養(yǎng)療法進行治療，但大多數治療只能短期改善，使用益生菌等微生物制劑治療功能性腸胃病正逐漸被人們所接受，大量研究表明腸道菌群對人體的健康至關重要[21]。有研究證實，益生菌產生的短鏈脂肪酸和多肽等具有調節(jié)胃腸動力促進腸道蠕動作用。益生菌也可以促進5-羥色胺分泌，來調控腸神經反射，作用于迷走神經，調節(jié)胃腸的收縮功能[22]。

已有多項研究表明了益生菌及其組合物的促腸道蠕動作用，陳家倫等[23]研究中通過對小鼠給予益生菌組合物，發(fā)現低、高劑量均可促進小鼠小腸推進率，顯著降低首粒黑便時間。程光麗等[24]的研究中，志愿者在連續(xù)3 個月服用益生菌產品后，食物在腸道內停留時間顯著性減少，腸動次數及腸道收縮力顯著增加。在本研究中，斑馬魚給予復合益生菌6 h 后，腸腔內的尼羅紅熒光強度下降（P＜0.05），腸道內容物減少，腸道蠕動促進率為28.68%，表明該款益生菌復合制劑具有促進腸胃蠕動的作用。

3.3 益生菌的緩解腹瀉作用

腹瀉主要癥狀為排便量增加，患腹瀉的原因有多種[5]。此外，腸道微生態(tài)系統(tǒng)紊亂會使炎癥因子增加，引起腸道免疫系統(tǒng)障礙，最終導致腸道黏膜、組織受損[25-26]。已有研究證明，益生菌可以實現在小腸黏膜上皮細胞上定植以促進β-防御素的產生，進一步提高腸上皮細胞的自我保護及修復受損；此外，益生菌的代謝活動會合成具有抗炎、抗氧化、調節(jié)免疫的有益代謝物，使病原菌的生長繁殖受到抑制[27-29]。

在一些研究中，通過益生菌干預能夠達到緩解或治療腹瀉癥狀。汪家琦等[30]利用添加抗生素建立小鼠腹瀉模型，并通過復合益生菌灌胃進行治療，結果表明益生菌治療具有修復隱窩、保護腸粘膜、減輕腹瀉的功效。在王慕華等[31]的研究中腹瀉患者在益生菌干預后大便次數從原來的4.8 次/日恢復到了1 次/日，并能夠減輕腹瀉引起的腹痛等癥狀。在本研究中，使用番瀉葉構建斑馬魚腹瀉模型，給予該款復合益生菌進行干預，結果發(fā)現斑馬魚腸道尼羅紅熒光信號強度顯著高于模型組，表明該款益生菌復合制劑具有緩解腹瀉的作用。

4 結論

該款益生菌復合制劑經本實驗研究，具有良好的腸道定植能力，在斑馬魚腸腔存活時間較長。在健康斑馬魚上可有效促進腸道蠕動，具有潤腸通便的功效；在斑馬魚非細菌性腹瀉模型上，可有效緩解腹瀉癥狀，減少過度排泄。綜合上述，該款益生菌復合制劑能增強健康腸道蠕動功能，減輕腸道受到刺激而導致的過度收縮排泄，維持腸道動力平衡，具有雙向調節(jié)腸道動力作用，可能對營養(yǎng)吸收、免疫調節(jié)、消化等腸道生理功能有著潛在的積極影響，具體機制需進一步研究。