孟令昀,肖長芳,胡 濛,孫飏煬,王群博,姚一博

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肛腸科,上海 200032)

便秘屬于消化道疾病,主要表現(xiàn)為排便吃力、大便量少和便后留有不盡感[1]。在治療方法上,臨床多采用改善生活方式、生物反饋、藥物治療和手術(shù)處理等措施進(jìn)行干預(yù)[2]。從便秘治療的長期隨訪中發(fā)現(xiàn),這些治療措施存在療效欠佳、癥狀易反復(fù)等問題[3-4]。中醫(yī)在便秘的治療中獨(dú)具特色,認(rèn)為肺脾與便秘的發(fā)生密切相關(guān),肺氣下布,促進(jìn)腸道蠕動;脾胃調(diào)節(jié)全身氣機(jī),調(diào)控腸道順利傳導(dǎo)糟粕[5-6]。中醫(yī)在便秘的治療中遵循整體與局部相調(diào)控,在經(jīng)方藥對的應(yīng)用上尤其具有代表性。麻子仁丸中,杏仁為臣,上肅肺氣,下潤大腸;枳實(shí)為佐使,下氣破結(jié),使通便之力增強(qiáng)[7]。大五柔丸中,枳實(shí)為臣,降氣行滯;杏仁為佐使,導(dǎo)氣下行[8]。在枳實(shí)-杏仁藥對中,枳實(shí)調(diào)暢氣機(jī),除脹消滿;杏仁宣肺降氣,潤腸通便;兩者配合,行氣潤腸,共奏通便之效。但目前對于枳實(shí)-杏仁藥對治療便秘的作用機(jī)制缺少一定的研究,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)依據(jù)藥物活性成分與疾病靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性及結(jié)合親密度,預(yù)測藥物治療疾病的作用機(jī)制,可為分析枳實(shí)-杏仁藥對治療便秘的作用機(jī)制提供新的思路[9-10]。

1 資料與方法

1.1 枳實(shí)-杏仁藥對活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)的篩選

以口服生物利用度(OB)為標(biāo)準(zhǔn)選擇吸收代謝程度較好的中藥成分,以類藥性(DL)為要求篩選對人體較安全的中藥成分。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http：//tcmspw.com/tcmsp. org/)中設(shè)置上述參數(shù),篩選枳實(shí)-杏仁藥對中有利吸收且不良反應(yīng)小的活性成分及靶點(diǎn);利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)找到對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。

1.2 便秘疾病靶點(diǎn)及枳實(shí)-杏仁藥對與便秘共有靶點(diǎn)的收集整理

在DrugBank、GeneCards、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(TTD)、PharmGKB和人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM)中收集便秘靶點(diǎn),然后與藥對作用靶點(diǎn)進(jìn)行交互,得到藥對與便秘的共有靶點(diǎn)。

1.3 枳實(shí)-杏仁藥對主要有效成分的篩選

將枳實(shí)-杏仁藥對的活性成分及枳實(shí)-杏仁藥對與便秘共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape,形成枳實(shí)-杏仁藥對活性成分與共有靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)可視化分析圖,計(jì)算Degree值,搜尋藥對中可治療便秘的主要有效成分。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)

便秘靶點(diǎn)PPI詳情通過STRING version 11.5 數(shù)據(jù)庫平臺獲得(http：//string-db.org/),然后導(dǎo)入Cytoscape軟件,利用拓?fù)浞治鰳?gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖,得到核心共有靶點(diǎn)。

1.5 基因和通路富集分析

運(yùn)用R 4.1.1軟件對共有靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析,可得到藥對調(diào)控便秘的主要生物學(xué)過程;進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,可找到藥對調(diào)控便秘的核心信號通路。

1.6 分子對接驗(yàn)證

通過PubChem、ChemOffice 14.0.0.117生成小分子配體結(jié)構(gòu);通過PDB選擇大分子受體結(jié)構(gòu);應(yīng)用AutoDockTools 1.5.7處理配受體分子;應(yīng)用Vina 1.1.2 計(jì)算配受體對接的結(jié)合能。

2 結(jié)果

2.1 枳實(shí)-杏仁藥對的活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)

按照OB≥30%、DL≥0.18的要求,枳實(shí)共有22個活性成分,杏仁共有19個活性成分,共41個活性成分,見表1。活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)經(jīng)合并后共82個。

2.2 便秘疾病靶點(diǎn)及枳實(shí)-杏仁藥對與便秘共有靶點(diǎn)的匯總

從GeneCards數(shù)據(jù)庫得到1 117個便秘靶點(diǎn),從OMIM數(shù)據(jù)庫得到200個便秘靶點(diǎn),從PharmGkb數(shù)據(jù)庫得到410個便秘靶點(diǎn),從TTD數(shù)據(jù)庫得到11個便秘靶點(diǎn),從DrugBank數(shù)據(jù)庫得到100個便秘靶點(diǎn),去重后剩余1 526個便秘靶點(diǎn)。枳實(shí)-杏仁藥對對應(yīng)靶點(diǎn)與便秘作用靶點(diǎn)相互匹配后,最后取得60個共有靶點(diǎn)。

2.3 枳實(shí)-杏仁有效成分與共有靶點(diǎn)關(guān)系圖

成分-靶點(diǎn)關(guān)系圖中,左邊藍(lán)色長方形內(nèi)編號代表33個藥對有效成分,右邊藍(lán)色長方形內(nèi)編號代表60個疾病共有靶點(diǎn)。左邊有效成分上連接的直線越多,代表該有效成分越與疾病相關(guān);右邊疾病共有靶點(diǎn)的藍(lán)色面積越大,代表該靶點(diǎn)越與疾病相關(guān);通過網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖可進(jìn)一步突出主要有效成分和核心共有靶點(diǎn),見圖1。Degree值排序居前15位的有效成分見表2。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的繪制與篩選

將共有靶點(diǎn)按數(shù)據(jù)庫要求規(guī)范整理好格式后再導(dǎo)入STRING系統(tǒng),設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)、剔除部分靶點(diǎn)后,得到枳實(shí)-杏仁藥對治療便秘的PPI網(wǎng)絡(luò),見圖2。最后將篩選好的PPI信息導(dǎo)入Cytoscape,利用軟件中CytoHub插件計(jì)算節(jié)點(diǎn)的Degree、LAC和Network等值,標(biāo)準(zhǔn)為>中位值,使用R語言得出核心共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。

圖2 枳實(shí)-杏仁藥對治療便秘的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 2 PPI network of fructus aurantii immaturus-almond in treatment of consipation

圖3 核心PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Core PPI network diagram

圖4 GO分析Fig 4 GO analysis

圖5 KEGG分析Fig 5 KEGG analysis

2.5 基因和通路富集分析

將枳實(shí)-杏仁藥對治療便秘的60個共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,生物學(xué)過程包括衰老、平滑肌細(xì)胞增殖等;細(xì)胞組成包括局灶性粘連、細(xì)胞體等;分子功能包括鈣調(diào)素結(jié)合、兒茶酚胺結(jié)合等,見圖4。KEGG富集分析確定了磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)、雌激素受體等信號通路,見圖5。

2.6 有效成分與共有靶點(diǎn)對接

通過AutoDock-Vina軟件將主要有效成分木犀草素、甘草酚與核心共有靶點(diǎn)絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)進(jìn)行分子對接,結(jié)果顯示,木犀草素與MAPK1的結(jié)合能為-36.0 kJ/mol,甘草酚與GSK-3β的結(jié)合能為-40.6 kJ/mol。使用Pymol軟件直觀展現(xiàn)枳實(shí)-杏仁藥對有效成分與便秘疾病核心靶點(diǎn)的結(jié)合形式,見圖6。

A.MAPK1(1TV0)-木犀草素;B.GSK-3β(1J1B)-甘草酚。A.MAPK1(1TV0)-luteolin; B.GSK-3β(1J1B)-glycyrol.圖6 關(guān)鍵蛋白 MAPK1、GSK-3β與主要小分子的對接模式圖Fig 6 Molecular docking pattern of key proteins MAPK1 and GSK-3β with major small molecule

3 討論

藥對是方劑配伍的基本形式,與其他配伍相輔相成,在臨床發(fā)揮重要功效。枳實(shí)-杏仁是便秘經(jīng)方中的經(jīng)典藥對之一。上海市名中醫(yī)陸金根教授認(rèn)為,在肺氣不宣型便秘中,枳實(shí)可消積化滯通便[11]。李敏等[12]認(rèn)為,枳實(shí)可破氣化滯,從而減輕便秘腹脹的困擾。杏仁潤腸滑便作用顯著,可緩解腸燥便秘[13]。陸金根教授在腑氣不通型便秘中,采用杏仁,發(fā)揮其辛能行氣、苦能降氣的功效[11]。枳實(shí)-杏仁藥對調(diào)脾胃而理氣機(jī),降肺氣而潤腸道,共行通便之效。但是,對于枳實(shí)-杏仁藥對治療便秘的作用機(jī)制缺乏相關(guān)的研究。

本研究中,枳實(shí)-杏仁藥對共篩選出有效成分33個,便秘的治療靶點(diǎn)60個。有效成分主要為木犀草素、甘草酚。木犀草素可通過調(diào)節(jié)小鼠L型鈣通道改善結(jié)腸平滑肌運(yùn)動[14]。文獻(xiàn)報(bào)道,在便秘的腸道組織中發(fā)現(xiàn)了炎癥因子上調(diào)現(xiàn)象,提示抗炎可解決部分便秘問題[15]。甘草酚具有提高腸道微生物多樣性、抑制促炎因子表達(dá)的作用[16-17]。MAPK1、GSK-3β為治療便秘的關(guān)鍵靶點(diǎn)。增加MAPK1磷酸化水平,有利于膽堿能神經(jīng)元的分化,從而增強(qiáng)胃腸道運(yùn)動[18]。GSK-3β磷酸化水平的高表達(dá)可以保護(hù)平滑肌線粒體,降低腸細(xì)胞損傷,促進(jìn)慢性腸道炎癥消散[19-20]。

GO功能富集結(jié)果顯示,枳實(shí)-杏仁治療便秘包括調(diào)節(jié)衰老、肌動蛋白細(xì)胞骨架等生物學(xué)過程。衰老可能影響腸道激素分泌及腸蠕動,出現(xiàn)便秘癥狀[21-22]。枳實(shí)可通過黃酮類藥物成分興奮腸道平滑肌,增加老年便秘患者胃腸道的規(guī)律收縮,進(jìn)而改善便秘問題[23-24]。杏仁可提高細(xì)胞因子、激酶受體表達(dá),調(diào)控肌電信號傳遞,保證平滑肌收馳有度,以此緩解老年便秘[25-26]。枳實(shí)、杏仁水提物可以改善結(jié)腸平滑肌細(xì)胞萎縮、排列紊亂等問題,保證腸組織正常結(jié)構(gòu),進(jìn)而緩解便秘[27-28]。KEGG通路富集結(jié)果顯示,枳實(shí)-杏仁藥對可能通過調(diào)控PI3K-Akt、雌激素受體等信號通路改善便秘。電針刺激或中藥水煎劑灌胃刺激PI3K-Akt蛋白傳導(dǎo)通路后,增加了結(jié)腸組織中PI3K、Akt基因及蛋白表達(dá),進(jìn)而治療便秘[29-30]。雌激素受體通路被阻斷后,Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)會明顯減少,從而使便秘加重[31]。文獻(xiàn)報(bào)道,女性便秘患者結(jié)腸運(yùn)轉(zhuǎn)速度會發(fā)生周期性的改變,上調(diào)雌激素受體表達(dá)可明顯改善患者慢傳輸型便秘[32]。枳實(shí)可在一定程度抑制PI3K-Akt通路,減輕ICC自噬,從而改善便秘[33]。

綜上所述,枳實(shí)-杏仁藥對中的木犀草素、甘草酚等活性成分作用于便秘疾病MAPK1、GSK-3β等靶點(diǎn)蛋白,并通過干預(yù)PI3K-Akt、雌激素信號等信號通路,以豐富腸道微生物種類、修復(fù)腸道屏障、抑制炎癥發(fā)生、調(diào)節(jié)鈣離子通道和維持電信號傳導(dǎo)等方式達(dá)到緩解便秘的目的。本研究為進(jìn)一步探討枳實(shí)-杏仁藥對治療便秘提供了理論參考。