李雪梅,肖斯婷,曹春然（北京市藥品檢驗(yàn)研究院,國家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全研究與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥成分分析與生物評價北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206）

苯磺順阿曲庫銨是一種骨骼肌松弛藥物，用于手術(shù)和其他操作以及重癥監(jiān)護(hù)的治療。作為全麻的輔助用藥或在重癥監(jiān)護(hù)病房起肌松作用的藥物，其可以松弛骨骼肌，使氣管插管和機(jī)械通氣易于進(jìn)行[1]。臨床給藥途徑主要有靜脈單次注射和靜脈滴注。對于苯磺順阿曲庫銨注射液的內(nèi)毒素檢查，是保證其安全使用的前提，有效控制其中內(nèi)毒素的含量尤為重要[2]。

目前對于苯磺順阿曲庫銨注射液的內(nèi)毒素檢查多使用凝膠法，查詢相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，該品種的內(nèi)毒素檢查法的研究中，苯磺順阿曲庫銨對內(nèi)毒素的抑制作用是被公認(rèn)的，但對于消除該抑制作用的緩沖劑選擇描述卻很模糊。為更準(zhǔn)確地測定該品種中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，本文采用動態(tài)顯色法對其內(nèi)毒素進(jìn)行測定。根據(jù)臨床用法用量，將其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中內(nèi)毒素限值規(guī)定為小于3.0EU/mg。為研究苯磺順阿曲庫銨對內(nèi)毒素的抑制作用，我單位將使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水為稀釋劑和使用鎂離子緩沖液稀釋劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為稀釋劑時，其實(shí)驗(yàn)方法不成立，特此將苯磺順阿曲庫銨注射液可行的內(nèi)毒素檢查法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 苯磺順阿曲庫銨注射液，規(guī)格：5ml:10mg，樣品選擇國產(chǎn)某企業(yè)生產(chǎn)，批號：G010M，性狀：無色透明液體。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（以下簡稱BET水），湛江安度斯生物有限公司，批號：1806130，規(guī)格：50ml/瓶。鎂離子緩沖液，湛江安度斯生物有限公司，批號：2005210，規(guī)格：4ml/支。鱟試劑，湛江安度斯生物有限公司，批號：2004280，靈敏度：0.005EU/ml，標(biāo)示檢測限50-0.005EU/ml。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢驗(yàn)研究院，批號：150800-201987，規(guī)格：80EU/支；批號：150800-202088，規(guī)格：60EU/支。

1.2 儀器 EasyBET細(xì)菌內(nèi)毒素測定系統(tǒng)，型號：BET-48G，生產(chǎn)單位：湛江安度斯生物有限公司，工作狀態(tài)正常。

2 方法與結(jié)果

苯磺順阿曲庫銨注射液內(nèi)毒素限值為：3.0EU/mg，按其規(guī)格：5ml:10mg計(jì)算，其濃度為2mg/ml，折合內(nèi)毒素限值為6.0EU/ml。

2.1 采用滅菌注射用水稀釋步驟與測定方法

2.1.1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的配制 取1支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（60EU/支）+BET水1.0ml→60EU/m l；取0.5 m l（6 0 E U/m l）+B E T 水2.5ml→10EU/ml；取2ml（10EU/ml）+BET水2ml→5EU/ml；取1ml（5EU/ml）+BET水4ml→1EU/ml；取2ml（10EU/ml）+BET水2ml→0.5EU/ml；取1ml（0.5EU/ml）+BET水4ml→0.1EU/ml；取2ml（0.1EU/ml）+BET水2ml→0.05EU/ml；取1ml（0.05EU/ml）+BET水4ml→0.01EU/m l；取2 m l（0.0 1 E U/m l）+B E T 水2ml→0.005EU/ml。

2.1.2 供試品溶液的制備 M V D=L/λ=6.0EU/ml÷0.005EU/ml=1200倍。取0.2ml樣品溶液+BET水1.8ml→10倍稀釋液；取0.2ml（10倍稀釋液）+BET水1.8ml→100倍稀釋液；取0.5ml（100倍稀釋液）+BET水2.5ml→600倍稀釋液；取1ml（600倍稀釋液）+BET水1ml→1200倍稀釋液。

2.1.3 供試品陽性溶液的制備 取0.5ml（600倍稀釋液）+0.5ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.16EU/ml）→1200倍稀釋陽性溶液（0.08EU/ml）。

2.1.4 測定方法 將溶解的鱟試劑分裝到無熱原的儀器專用檢測管內(nèi)，每只檢測管內(nèi)加0.1ml，然后按順序分別加入0.1ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或稀釋好的供試品溶液、供試品陽性溶液，陰性孔加入內(nèi)毒素檢查用水，陽性孔加入0.5EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，輕輕混勻后放入細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀設(shè)定位置，儀器自動開始檢測。按照中國藥典2020年版四部通則1143中光度測定法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與結(jié)果計(jì)算。

2.1.5 采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為稀釋劑的測定結(jié)果 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，樣品回收率為28%，小于50%，說明其方法學(xué)驗(yàn)證不通過，見表1。

表1 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水為稀釋劑的測定結(jié)果

2.2 采用鎂離子緩沖液稀釋步驟與測定方法[1]

2.2.1 鎂離子緩沖液（陰性對照）的稀釋取10ml鎂離子緩沖液+BET水50mlBET水→60ml（6倍鎂離子稀釋液）；取20ml（6倍鎂離子稀釋液）+BET水20ml→40ml（12倍鎂離子稀釋液）。

實(shí)驗(yàn)前，采用凝膠法測定鎂離子緩沖液的內(nèi)毒素含量，檢查結(jié)果顯示，鎂離子緩沖液的內(nèi)毒素小于0.015EU/ml，與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水的內(nèi)毒素要求限值一致。

2.2.2 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋 取1支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（60EU/支）+BET水1.0ml→60EU/ml；取0.5ml（60EU/ml）+BET水2.5ml→10EU/ml；取2ml（10EU/ml）+6倍鎂離子稀釋液2ml→5EU/ml；取1ml（5EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液4ml→1EU/ml；取2ml（10EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液2ml→0.5EU/ml；取1ml（0.5EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液4ml→0.1EU/ml；取2ml（0.1EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液2ml→0.05EU/ml；取1ml（0.05EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液4ml→0.01EU/ml；取2ml（0.01EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液2ml→0.005EU/ml。

2.2.3 供試品溶液的制備 MVD=L/λ=6.0EU/ml÷0.005EU/ml=1200倍。取0.5ml樣品+BET水4.5ml→10倍稀釋液；取0.5ml（10倍稀釋液）+BET水4.5ml→100倍稀釋液；取1ml（100倍稀釋液）+BET水2ml→300倍稀釋液；取2ml（300倍稀釋液）+6倍鎂離子稀釋液2ml→600倍稀釋液；取1ml（600倍稀釋液）+12倍鎂離子稀釋液1ml→1200倍稀釋液。

2.2.4 供試品陽性溶液制備 取1ml（600倍樣品稀釋液）+1ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1EU/ml）→1200倍稀釋陽性溶液（0.5EU/ml）。

2.2.5 測定方法 將溶解的鱟試劑分裝到無熱原的儀器專用檢測管內(nèi)，每只檢測管內(nèi)加0.1ml，然后按順序分別加入0.1ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或稀釋好的供試品溶液、供試品陽性溶液，陰性孔加入12倍鎂離子稀釋液，陽性孔加入0.5EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，輕輕混勻后放入細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀設(shè)定位置，儀器自動開始檢測。按照中國藥典2015年版四部通則1143中光度測定法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與結(jié)果計(jì)算。

2.2.6 采用鎂離子緩沖液作為稀釋劑的測定結(jié)果 從測定結(jié)果看，以鎂離子緩沖液作為稀釋劑，在此對苯磺順阿曲庫銨注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的測定，其方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)成立條件，則認(rèn)為結(jié)果準(zhǔn)確，見表2。

表2 鎂離子緩沖液為稀釋劑的測定結(jié)果

2.3 結(jié)果 苯磺順阿曲庫銨注射液使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和鎂離子緩沖液作為稀釋劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果顯示，兩種稀釋方法的線性回歸方程分別為：LgTg=2.6768-0.2684LgC和LgTg=0.42533-0.03972LgC，相關(guān)系數(shù)分別為：-0.9961和0.9975；兩種稀釋方法中內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品不同稀釋倍數(shù)及干擾管的變異系數(shù)均小于10%；兩種稀釋方法中內(nèi)毒素的回收率分別為28%和89%。由此可見，采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為稀釋劑時，其內(nèi)毒素回收率低于50%，與《中國藥典》規(guī)定的回收率應(yīng)在50%-200%不相符，實(shí)驗(yàn)不成立。采用鎂離子緩沖液作為稀釋劑對樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋并測定，其結(jié)果回收率為89%，符合實(shí)驗(yàn)成立要求。則苯磺順阿曲庫銨注射液在進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時應(yīng)使用鎂離子緩沖液作為稀釋劑，實(shí)驗(yàn)方可成立。

3 討論

苯磺順阿曲庫銨注射液對內(nèi)毒素有抑制作用，補(bǔ)充適量的二價離子可有效消除苯磺順阿曲庫銨注射液對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的抑制[3]。鎂離子緩沖液是一種輔助劑，用于枸櫞酸鹽類抗凝劑及一些會導(dǎo)致鱟試驗(yàn)反應(yīng)溶液中二鉀離子缺失的樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。在使用鎂離子緩沖液對樣品進(jìn)行稀釋后再根據(jù)動態(tài)顯色法進(jìn)行檢查，結(jié)果表明方法可行。

目前對于苯磺順阿曲庫銨注射液的內(nèi)毒素檢測，文獻(xiàn)報道中提及可用凝膠法[4]，但有關(guān)其采用動態(tài)顯色法對細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行質(zhì)量控制的措施卻沒有提及。在文獻(xiàn)[3]報道中，為消除苯磺順阿曲庫銨對內(nèi)毒素的抑制作用，可使用稀釋劑Ⅰ作為溶劑。稀釋劑Ⅰ是一種輔助劑，含有一定濃度的二價離子，可飽和枸櫞酸鹽的螯合反應(yīng)，維持鱟試劑的正常靈敏度，并有較強(qiáng)的pH緩沖能力，使反應(yīng)介質(zhì)保持反應(yīng)所需的最佳pH。近來湛江安度斯生物有限公司將稀釋劑Ⅰ更名為鎂離子緩沖液。

目前苯磺順阿曲庫銨注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，越來越多的企業(yè)選擇使用與進(jìn)口品種相同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行內(nèi)毒素檢查，即使用動態(tài)顯色法，而不再使用凝膠法，但所有涉及苯磺順阿曲庫銨注射液品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅寫明“采用動態(tài)顯色法進(jìn)行內(nèi)毒素的測定”，但對其實(shí)驗(yàn)過程中藥品主要成分對內(nèi)毒素有抑制作用，需采用鎂離子緩沖液對樣品進(jìn)行稀釋后測定并未寫明。故筆者認(rèn)為，在后續(xù)企業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)提高和該品種的日常檢驗(yàn)中，應(yīng)寫明實(shí)驗(yàn)過程中采用的稀釋劑，以便更好地完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對該品種的安全性質(zhì)量控制有重要的意義和價值[5-22]。