＊楊 斌

（廣州醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 廣東 511436）

納米載體技術(shù)的發(fā)展革新了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的診斷和治療，為多種疾病的治療提供了高新技術(shù)手段。利用不同納米材料并合理選擇制備方法可以獲得具有各種尺寸、形狀和表面性質(zhì)的載體，通過(guò)考察相關(guān)性質(zhì)對(duì)納米制劑生物學(xué)效應(yīng)的影響，可以得到針對(duì)不同種類(lèi)細(xì)胞進(jìn)行遞送的納米載體系統(tǒng)。進(jìn)一步篩選合適的分子作用靶點(diǎn)，能夠利用特定的納米制劑調(diào)控相應(yīng)的功能，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的靶向治療[1-3]。作為功能性納米載體的一種，刺激響應(yīng)型（stimuli-responsive）聚合物在藥物控制釋放、基因載體及納米反應(yīng)器等諸多領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。聚陽(yáng)離子納米材料能夠通過(guò)靜電作用負(fù)載DNA等負(fù)電性治療劑，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的包封和可控釋放，是一類(lèi)理想的納米載體系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)源于生物醫(yī)用高分子領(lǐng)域的前沿研究成果，應(yīng)用于我校生物醫(yī)學(xué)工程專(zhuān)業(yè)的生物醫(yī)學(xué)材料綜合實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)，面向大三年級(jí)本科生開(kāi)設(shè)。通過(guò)本教學(xué)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，期望學(xué)生能夠在指定的實(shí)驗(yàn)方向下自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和詳細(xì)步驟，在不同實(shí)驗(yàn)分組完成后比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行分析，最終得出結(jié)論。在該課程中綜合了本專(zhuān)業(yè)相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容與操作，同時(shí)將設(shè)計(jì)性融入到實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神。由于該實(shí)驗(yàn)相對(duì)比較復(fù)雜，需要學(xué)生前期掌握有機(jī)化學(xué)、高分子化學(xué)、生物材料的合成與制備技術(shù)、生物材料的表征技術(shù)等相關(guān)理論和實(shí)驗(yàn)課程，而這些課程已經(jīng)在本專(zhuān)業(yè)前期教學(xué)中均有所涉及，從而為本實(shí)驗(yàn)的順利開(kāi)展奠定了良好的基礎(chǔ)。

1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

（1）掌握聚陽(yáng)離子納米載體材料構(gòu)建的基本原理和方法。

（2）掌握納米載體材料的常用表征手段。

（3）熟悉自組裝的原理和方法。

（4）了解主客體化合物的基本性質(zhì)。

2.實(shí)驗(yàn)原理

環(huán)糊精是由葡萄糖單元經(jīng)（1→4）糖苷鍵相連形成的環(huán)狀低聚物，根據(jù)單糖個(gè)數(shù)的不同（6、7、8個(gè)）分別命名為α-、β-、γ-環(huán)糊精。環(huán)糊精本身具有兩親性結(jié)構(gòu)，內(nèi)腔疏水，外側(cè)親水，這使得其能在水中溶解，毒性很低且無(wú)免疫原性。作為主體分子，環(huán)糊精能夠與多種小分子客體通過(guò)超分子作用力進(jìn)行組裝，從而引入不同的功能。最為典型的是，β-環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）與金剛烷（Adamantane，AD）能夠通過(guò)主客體作用形成類(lèi)似“鎖鑰”關(guān)系的分子間專(zhuān)一性結(jié)合。因此，借助環(huán)糊精和金剛烷的主客體自組裝構(gòu)建聚陽(yáng)離子材料不會(huì)涉及復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，易于實(shí)現(xiàn)材料的功能化修飾，通過(guò)后期組裝制備具有納米尺度的載體，具有廣泛的應(yīng)用前景[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模板-模塊的形式將功能性客體分子組裝到低分子量的陽(yáng)離子載體體系中[8-9]，即以氨基修飾的環(huán)糊精作為模板分子（主體部分）有效負(fù)載DNA，同時(shí)功能化的金剛烷衍生物作為模塊（客體部分）可以介導(dǎo)特定的功能，二者自組裝得到聚陽(yáng)離子納米載體材料（如圖1所示）。進(jìn)一步借助實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的儀器設(shè)備和條件，通過(guò)核磁共振氫譜、掃描電子顯微鏡、凝膠電泳儀等探究載體材料的結(jié)構(gòu)正確性和功能有效性，以期用于基因和藥物的有效負(fù)載，最終實(shí)現(xiàn)治療的目的。

圖1 聚陽(yáng)離子納米載體材料的合成路線(xiàn)示意圖（A）主體化合物CD-TAEA的合成；（B）客體分子PB-AD的合成及其主客體組裝納米載體的結(jié)構(gòu)

3.儀器和試劑

儀器：磁力攪拌器，渦旋震蕩器，水浴鍋，pH計(jì)，冷凍干燥機(jī)，核磁共振波譜儀，掃描電子顯微鏡，凝膠電泳儀。

試劑：N,N-二甲基甲酰胺（DMF），二甲亞砜（DMSO），三乙胺（TEA），3-氨基苯硼酸（PB-NH2），N,N'-羰基二咪唑（CDI），β-環(huán)糊精（CD），1-金剛烷酰氯（ADC），三(2-氨基乙基)胺（TAEA），D2O，氫氧化鈉，鹽酸，瓊脂糖，編碼熒光素酶的質(zhì)粒pGL-3，GelRedTM染料。

4.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（1）β-環(huán)糊精-三(2-氨基乙基)胺（CD-TAEA）的合成。將CD（1.0g，0.9mmol）溶解在10mL DMF中，然后將事先溶解在10mL DMF中的CDI（2.0g，12.3mmol）溶液逐滴加入到上述溶液中，室溫下攪拌2h進(jìn)行活化，然后倒入無(wú)水乙醚中沉淀，離心后收集沉淀物并重新溶解在15mL DMSO中。將1mL三乙胺加入該DMSO混合液后滴加至事先溶解在5mL DMSO的TAEA溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)混合液經(jīng)透析（MWCO：3500）后冷凍干燥得產(chǎn)品CD-TAEA。

（2）金剛烷修飾的苯硼酸（PB-AD）的合成。將PB-NH2（0.6g，4.4mmol）與ADC（0.6g，3.0mmol）溶解在20mL DMF中，加入三乙胺1.2mL，0℃下攪拌反應(yīng)24h。將DMF溶劑減壓蒸出，過(guò)量的ADC及反應(yīng)生成的三乙胺鹽酸鹽用蒸餾水多次洗滌除去，然后在50℃下真空干燥得到淺黃色產(chǎn)品PB-AD。

（3）核磁氫譜（1H NMR）表征。分別取CD-TAEA和PB-AD固體，在氘代試劑中溶解后制備樣品，使用核磁共振波譜儀檢測(cè)。納米組裝體的結(jié)構(gòu)通過(guò)1H-1H COSY二維譜來(lái)表征其相互作用。

（4）納米組裝體的構(gòu)建。將PB-AD與CD-TAEA一起溶解在10mL DMF中，在50℃下劇烈攪拌1h。然后將5mL蒸餾水通過(guò)注射器在2h內(nèi)緩慢加入到上述溶液中，50℃下繼續(xù)攪拌過(guò)夜，將組裝體溶液對(duì)水透析（MWCO：3500），過(guò)濾后凍干得到超分子自組裝體PBAD/CD-TAEA。

（5）凝膠電泳。將不同N/P比的載體材料與0.1μg DNA的復(fù)合物加入含有2μL GelRedTM染料的0.7%(w/v)的瓊脂糖凝膠中，電泳實(shí)驗(yàn)在80V電壓下TAE緩沖溶液中進(jìn)行，1h后在凝膠成像儀下通過(guò)紫外照射成像來(lái)觀察。

（6）緩沖能力的測(cè)定。載體材料的緩沖能力通過(guò)酸堿滴定的方法測(cè)定。分別稱(chēng)取6mg的載體材料溶解于30mL的超純水中，將該溶液先用0.1M的NaOH調(diào)節(jié)pH到10，然后用0.1M的HCl溶液進(jìn)行滴定使其pH達(dá)到2.5，以pH值的變化對(duì)所加HCl溶液的體積作圖。在這里將緩沖能力定義為pH在7.4到5.1的范圍內(nèi)能夠被質(zhì)子化的氨基所占的百分含量，計(jì)算公式如下：PA=(ΔVHCl×0.1M)/Nmol×100%。其中ΔVHCl是將溶液的pH范圍從7.4滴定到5.1所需要的HCl溶液的體積；Nmol為6mg載體材料中能夠被質(zhì)子化的氨基總的摩爾數(shù)。

（7）掃描電鏡觀測(cè)形貌。載體材料與DNA的復(fù)合物形貌通過(guò)掃描電鏡來(lái)觀察。將三種材料在最佳N/P比時(shí)的復(fù)合物樣品進(jìn)行減壓噴金處理，在放大500倍的情況下對(duì)組裝體復(fù)合物的形貌進(jìn)行觀察。

5.結(jié)果與討論

（1）聚陽(yáng)離子納米載體的合成與結(jié)構(gòu)表征。本實(shí)驗(yàn)以氨基功能化的環(huán)糊精與金剛烷修飾的苯硼酸通過(guò)主客體作用構(gòu)建了一種超分子組裝體。首先，帶有多個(gè)氨基的TAEA小分子與經(jīng)CDI活化的環(huán)糊精反應(yīng)制備主體分子，然后通過(guò)3-氨基苯硼酸與1-金剛烷酰氯的酰胺化反應(yīng)合成苯硼酸連接的金剛烷作為客體分子。通過(guò)1H NMR來(lái)表征相關(guān)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，CD與TAEA所有基團(tuán)的特征峰都有相應(yīng)的歸屬，通過(guò)積分面積計(jì)算可以得出每個(gè)CD分子上連接TAEA分子的數(shù)目。PB-AD的合成在ADC過(guò)量的前提下通過(guò)酰胺化反應(yīng)完成，其中PB與AD基團(tuán)的特征峰都有相應(yīng)的歸屬。通過(guò)主客體組裝成功構(gòu)建了超分子體系，以1H-1H COSY二維譜（圖2）來(lái)證實(shí)組裝體的形成，可以看到CD與AD基團(tuán)的相關(guān)質(zhì)子具有偶合關(guān)系，相關(guān)峰的信號(hào)呈對(duì)稱(chēng)狀出現(xiàn)在二維譜圖中，從而證實(shí)了自組裝過(guò)程的發(fā)生。

圖2 PB-AD/CD-TAEA組裝體在D2O溶液中的1H-1H COSY圖譜

（2）聚陽(yáng)離子納米載體的性能測(cè)試。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)評(píng)估CD-TAEA及PB-AD/CD-TAEA結(jié)合質(zhì)粒DNA的能力，在不同的N/P比下考察氨基密度變化和聚陽(yáng)離子納米載體復(fù)合能力的關(guān)系。通過(guò)酸堿滴定的方法測(cè)定CD-TAEA及PB-AD/CD-TAEA的緩沖能力，以生理鹽水為陰性對(duì)照，金標(biāo)準(zhǔn)PEI25K為陽(yáng)性對(duì)照。一般而言，聚陽(yáng)離子的電荷密度越高，其復(fù)合DNA的能力越強(qiáng)，緩沖能力也越高，通過(guò)不同分組間聚陽(yáng)離子電荷密度的差異來(lái)驗(yàn)證上述結(jié)論。最后通過(guò)掃描電鏡（SEM）觀察載體與DNA在最佳N/P比下所形成復(fù)合物的形貌，可以發(fā)現(xiàn)復(fù)合物分布均勻且呈規(guī)則的球形，粒子大小均在100nm以下。

6.實(shí)驗(yàn)教學(xué)組織形式

本實(shí)驗(yàn)專(zhuān)為我校生物醫(yī)學(xué)工程專(zhuān)業(yè)生物醫(yī)學(xué)材料綜合實(shí)驗(yàn)課程開(kāi)設(shè)，面向大三年級(jí)本科生，目前已經(jīng)完成2屆學(xué)生的教學(xué)。在學(xué)生課前進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，以小分子化合物三(2-氨基乙基)胺與環(huán)糊精的的投料比不同進(jìn)行分組，每組4～5人，在完成所有實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行組間對(duì)比，通過(guò)討論分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終形成完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。整個(gè)綜合實(shí)驗(yàn)課程分3個(gè)階段完成：（1）理論講述相關(guān)實(shí)驗(yàn)背景和主要實(shí)驗(yàn)原理和內(nèi)容（1學(xué)時(shí)），分別完成主客體化合物的合成（7學(xué)時(shí)）；（2）表征合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，研究主客體自組裝行為（4學(xué)時(shí)）；（3）通過(guò)相關(guān)表征手段研究聚陽(yáng)離子納米載體的理化性質(zhì)并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果（8學(xué)時(shí)）。

7.結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合納米技術(shù)與生物材料研究中的熱點(diǎn)，通過(guò)主客體化學(xué)構(gòu)建不同電荷密度的聚陽(yáng)離子納米載體，并通過(guò)多種手段表征其理化性質(zhì)，綜合了本專(zhuān)業(yè)相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容與操作，同時(shí)將設(shè)計(jì)性融入到實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神。在教學(xué)過(guò)程中，將思政教育與生物醫(yī)學(xué)材料的教學(xué)元素有機(jī)融合，重點(diǎn)發(fā)掘知識(shí)體系中自帶的科學(xué)理性?xún)r(jià)值觀，可以有效激發(fā)學(xué)生的興趣，引導(dǎo)學(xué)生樹(shù)立正確的人生觀和價(jià)值觀。