秦婧 石菲

作者簡介：秦婧（1989—），女，陜西西安人，碩士，工程師。研究方向：食品微生物檢測與研究。

摘 要：目的：參加FAPAS乳粉中沙門氏菌能力驗(yàn)證可維持實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)芰?，提高檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)競爭力。方法：依據(jù)FAPAS作業(yè)指導(dǎo)書及GB 4789.4—2016對乳粉中沙門氏菌進(jìn)行檢測，同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 14028作為陽性對照。結(jié)果：樣品M280d072-A檢出沙門氏菌；樣品M280d072-B未檢出沙門氏菌。結(jié)論：國際FAPAS乳粉中沙門氏菌檢測能力驗(yàn)證結(jié)果評價(jià)為滿意。

關(guān)鍵詞：FAPAS；沙門氏菌；能力驗(yàn)證

Analysis of FAPAS Salmonella Ability Verification Results in Milk Powder

QIN Jing， SHI Fei

（Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Xian 710048， China）

Abstract： Objective： Participating in FAPAS Salmonella ability verification in milk power can maintain laboratory testing capacity and improve the competitiveness of testing institutions. Method： According to the instruction of FAPAS and GB 4789.4—2016， Salmonella in milk powder was detected and ATCC 14028 was added as a positive control. Result： The Salmonella was detected in sample M280d072-A; the Salmonella was undetected in sample M280d072-B. Conclusion： The results of the FAPAS test for Salmonella in milk powder were satisfactory.

Keywords： FAPAS; Salmonella; ability verification

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，廣泛存在于自然界中，能引起人和動(dòng)物急性腸胃炎、食物中毒、敗血癥等。世界各國都將沙門氏菌視為一項(xiàng)重要的食品安全指標(biāo)，且普遍規(guī)定沙門氏菌不得檢出。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》

（GB 29921—2021）對沙門氏菌的要求十分嚴(yán)格，2021年新出臺的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）對散裝即食食品沙門氏菌規(guī)定不得檢出。食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)是食品微生物檢驗(yàn)中的一項(xiàng)常規(guī)檢驗(yàn)，是每個(gè)檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)都應(yīng)該具備的資質(zhì)，是每個(gè)食品微生物檢驗(yàn)員都應(yīng)該具備的能力，同時(shí)對國民健康具有重要意義。中國合格評定國家認(rèn)可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）規(guī)定尋求并參加能力驗(yàn)證是合格評定機(jī)構(gòu)的責(zé)任和義務(wù)[1]。在食品分析領(lǐng)域，分析實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證（Food Analysis Performance Assessment Scheme，F(xiàn)APAS）已發(fā)展成為享譽(yù)全球的國際評價(jià)體系[2]，我國已經(jīng)有越來越多的檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)參與FAPAS能力驗(yàn)證。為評估實(shí)驗(yàn)室對食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)?zāi)芰Γ緦?shí)驗(yàn)室參加FAPAS于2022年11月組織的乳粉中沙門氏菌檢測能力驗(yàn)證，依據(jù)的方法是《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）。

1 材料與方法

1.1 試劑

緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（Tetrathionate Broth Base，TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（Selenite Cystine Broth，SC）、亞硫酸鉍瓊脂（Bismuth Sulfite Agar，BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（Xylose Lysine Desoxycholate，XLD）瓊脂、沙門顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒等均來自北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，SPX-250B-Z）；二級生物安全柜（美國賽默飛世爾科技，1300SERIESA2）；Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物生化鑒定儀（法國生物梅里埃股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品的接收和確認(rèn)

實(shí)驗(yàn)室收到FAPAS乳粉中沙門氏菌能力驗(yàn)證樣品2份，樣品編碼是M280d072-A、M280d072-B，樣品為25 g乳粉，塑料瓶包裝，外包裝完好，樣品性狀為白色粉末，且無結(jié)塊等異?，F(xiàn)象，因此確認(rèn)樣品完整。2份樣品標(biāo)記為072A和072B，安排兩位檢驗(yàn)員共同檢測，同時(shí)用實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 14028做陽性對照。

1.3.2 樣品的前處理和預(yù)增菌

根據(jù)此次能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書的說明，開啟樣品前應(yīng)先將兩份樣品072A和072B置于室溫下

30 min。在P2生物安全實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中以無菌操作開啟樣品，將樣品置于提前準(zhǔn)備好的無菌均質(zhì)袋中，先加入少量BPW充分沖洗塑料瓶內(nèi)部，并將BPW吸出轉(zhuǎn)入之前的無菌均質(zhì)袋中，最終使水化的BPW總量為225 mL。用均質(zhì)器將樣品和BPW充分混勻1～2 min，即為預(yù)增菌液，并做好標(biāo)記，分別標(biāo)記為072A和072B。同時(shí)接種ATCC 14028做陽性對照，以未接種的BPW做空白對照，將預(yù)增菌液于（36±1）℃培養(yǎng)8～18 h。后續(xù)依據(jù)GB 4789.4—2016進(jìn)行檢測分析。

1.3.3 選擇性增菌

將072A、072B、ATCC 14028、空白對照的預(yù)增菌液于（36±1）℃培養(yǎng)18 h后取出，混勻，移取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL TTB內(nèi)，于（42±1）℃培養(yǎng)18～24 h。同時(shí)，另取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL SC內(nèi)，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。分別做好樣品標(biāo)記，以上操作均在生物安全柜中進(jìn)行。

1.3.4 分離

將所有TTB、SC選擇性增菌液于（36±1）℃培養(yǎng)24 h后取出，經(jīng)混勻后，將每支TTB和SC分別劃線接種于BS瓊脂、XLD瓊脂和沙門顯色培養(yǎng)基上，并做好樣品標(biāo)識。其中BS瓊脂于（36±1）℃培養(yǎng)48 h，XLD瓊脂和沙門顯色培養(yǎng)基于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。

1.3.5 生化試驗(yàn)

從072A、ATCC 14028的選擇性瓊脂平板上分別挑取可疑菌落接種營養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行純培養(yǎng)，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的純培養(yǎng)物接種至沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒，同時(shí)采用Vitek2 Compact全自動(dòng)微生物生化鑒定儀對純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性增菌結(jié)果

1.3.3中培養(yǎng)后的TTB、SC培養(yǎng)物觀察情況如表1所示，兩名檢驗(yàn)員檢測的結(jié)果一致。

2.2 分離結(jié)果

按1.3.4方法進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果見表2。TTB和SC培養(yǎng)結(jié)果相一致，其中072A和ATCC 14028的選擇性培養(yǎng)基上各有一種可疑菌落，需要進(jìn)行后續(xù)生化試驗(yàn)；072B的選擇性培養(yǎng)基未見菌落生長，判定M280d072B沙門氏菌未檢出（25 g乳粉）。兩名檢驗(yàn)員檢測結(jié)果一致。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒結(jié)果

沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒鑒定結(jié)果見表3。依據(jù)GB 4789.4—2016中5.4.1～5.4.2對生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定，樣品072A和ATCC 14028均為沙門氏菌屬，且兩名檢驗(yàn)員檢測結(jié)果一致。

2.3.2 Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物生化鑒定儀結(jié)果

經(jīng)鑒定，發(fā)現(xiàn)樣品072A和ATCC 14028均為鼠傷寒沙門氏菌，且兩名檢驗(yàn)員檢測結(jié)果一致。

2.4 結(jié)果報(bào)告

綜合生化試驗(yàn)和Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物生化鑒定儀的結(jié)果，樣品M280d072-A檢出沙門菌/

25 g，樣品M280d072-B未檢出沙門菌/25 g。

3 結(jié)論與討論

此次國際FAPAS乳粉中沙門氏菌能力驗(yàn)證結(jié)果評價(jià)為滿意，表明該實(shí)驗(yàn)室具備沙門氏菌檢測分析能力。BPW是一種廣泛性增菌液，也可作為稀釋液，具有修復(fù)細(xì)胞的作用，可復(fù)蘇沙門氏菌，也可用與單增李斯特氏菌的檢驗(yàn)。TTB、SC是選擇性增菌液，其含有的選擇性抑制劑對不同沙門氏菌的選擇效果不同，因此在檢測過程中TTB和SC兩種增菌液需要同時(shí)使用，避免漏檢[3]。BS瓊脂選擇性比較強(qiáng)，對樣品中的雜菌有抑制作用，能更好地分離出目標(biāo)菌[4]。XLD瓊脂選擇性較低，在日常檢驗(yàn)中常遇到一些樣品在XLD瓊脂上為黃色菌落且不帶黑色中心，符合GB 4789.4—2016中沙門氏菌在XLD瓊脂上的菌落特征，但最終經(jīng)生化試驗(yàn)或Vitek生化鑒定儀鑒定并不是沙門氏菌屬。與BS瓊脂和XLD瓊脂不同的是，沙門顯色培養(yǎng)基在觀察菌落時(shí)更加直觀、容易辨認(rèn)。對于本次能力驗(yàn)證所采用的沙門顯色培養(yǎng)基，說明書上明確沙門氏菌典型菌落為紫紅色，其他為藍(lán)綠色、無色或不生長。也有研究表明科馬嘉顯色培養(yǎng)基比SS、XLD和HE的假陽性更少[5]。當(dāng)然沙門顯色培養(yǎng)基單瓶凈含量小，且單價(jià)比其他幾種選擇性培養(yǎng)基要高。許多實(shí)驗(yàn)室通常選擇性培養(yǎng)基選用BS瓊脂和XLD瓊脂，在必要時(shí)如高風(fēng)險(xiǎn)食品或能力驗(yàn)證時(shí)再加入沙門顯色培養(yǎng)基。

基于本次試驗(yàn)，將乳粉中沙門氏菌能力驗(yàn)證中操作關(guān)鍵點(diǎn)總結(jié)如下。①準(zhǔn)備工作。先確定檢驗(yàn)人員，提前準(zhǔn)備和檢查相關(guān)試劑、器具和設(shè)備。②樣品確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)室收到FAPAS樣品時(shí)，應(yīng)先對樣品進(jìn)行確認(rèn)，如仔細(xì)核對樣品信息、檢查樣品的外包裝是否完整、樣品性狀是否正常（顏色、有無結(jié)塊等）。③作業(yè)指導(dǎo)書和檢驗(yàn)方案。收到樣品后，應(yīng)先制定作業(yè)指導(dǎo)書和確定檢驗(yàn)方法。檢驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)應(yīng)包括檢驗(yàn)人員、檢驗(yàn)地點(diǎn)、時(shí)間安排、試劑配制、樣品前處理、預(yù)增菌、選擇性增菌、分離及鑒定等操作關(guān)鍵點(diǎn)，以及突發(fā)狀況的應(yīng)對預(yù)案。④試劑配制。TTB增菌液經(jīng)121 ℃、20 min高壓滅菌后，應(yīng)立即放入冷水中冷卻，在臨用前以無菌操作加入碘液和煌綠，然后進(jìn)行分裝。BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板及沙門顯色平板均不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，否則會降低其選擇性，BS和XLD兩種瓊脂平板應(yīng)于使用的前一天配制。兩種瓊脂平板應(yīng)貯于室溫暗處，BS瓊脂平板應(yīng)在48 h內(nèi)使用，否則容易影響分離鑒定結(jié)果。制備好的沙門顯色平板應(yīng)于2～

8 ℃冰箱冷藏保存一周。⑤混勻的重要性和必要性。在所有食品微生物檢驗(yàn)過程中，每個(gè)步驟應(yīng)使用均質(zhì)機(jī)和混勻器進(jìn)行均質(zhì)混勻。⑥樣品的前處理過程控制。整個(gè)檢測過程應(yīng)在P2生物安全實(shí)驗(yàn)室中的生物安全柜中進(jìn)行。樣品由冷藏室中取出后應(yīng)先在室溫下靜置30 min使其復(fù)蘇；兩名檢驗(yàn)員共同確認(rèn)樣品的性狀正常后，以無菌操作開啟樣品。⑦檢驗(yàn)過程控制。每個(gè)步驟務(wù)必做好樣品標(biāo)識避免混淆，且應(yīng)有實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量監(jiān)督員在旁指導(dǎo)監(jiān)督。操作完成后，應(yīng)對生物安全柜和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行徹底清理消毒，避免造成陽性污染。⑧結(jié)果分析。每個(gè)步驟樣品和陽性對照培養(yǎng)好后，注意觀察反應(yīng)現(xiàn)象。

參考文獻(xiàn)

[1]中國合格評定國家認(rèn)可委員會.能力驗(yàn)證規(guī)則：CNAS—RL02：2016[EB/OL].（2016-04-15）[2023-08-21].https：//www.docin.com/p-1699040362.html.

[2]陳萬勝，馬莉，亓瀟.國際FAPAS乳粉中沙門菌屬能力驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2020，31（12）：900-903.

[3]王萍，董貴軍，喬勇升，等.顯色培養(yǎng)基上沙門氏菌及干擾菌的分離鑒定[J].食品研究與開發(fā)，2017，38（12）：158-161.

[4]徐秀梅，張曉軍.幾種選擇性培養(yǎng)基檢測沙門氏菌的效果比較[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2017，28（10）：764-766.

[5]陳茂義，胡婕，劉建昭，等.科瑪嘉顯色培養(yǎng)基和XLD?SS?HE分離食品中沙門菌效果比較[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，19（4）：12-14.