馬雪，吳婧，張紅麗，李勇，宋娟，李源麗，魯亮，朱海振△

在我國(guó)肺癌發(fā)病率及病死率處于惡性腫瘤之首［1］，早期診斷是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。微小RNA（microRNA，miRNA）在促進(jìn)腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，其中miR-155 在肺癌患者癌組織及血清中均高表達(dá)并參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，可能成為肺癌早期診斷的分子靶標(biāo)［2］。分子信標(biāo)（molecular beacon，MB）技術(shù)對(duì)檢測(cè)DNA、RNA和miRNA具有高度敏感性［3］。但MB需要合適的載體才能進(jìn)入細(xì)胞，殼聚糖（chitosan，CS）納米已被作為理想的基因載體廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［4］?，F(xiàn)有研究表明癌細(xì)胞表面存在著多種特異性抗原或受體，可被用來(lái)精準(zhǔn)識(shí)別癌細(xì)胞［5］。其中典型的有生長(zhǎng)抑素受體（somatostatin receptor，SSTR），在肺癌中SSTR2 廣泛高表達(dá)［6］。奧曲肽（octreotide，OCT）是一種人工合成的生長(zhǎng)抑素，可以和SSTR2進(jìn)行特異性牢固結(jié)合。本團(tuán)隊(duì)前期已合成了OCT修飾的CS MB 納米（CS-MB-OCT），在A549、SPC-A1 等肺癌細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)腫瘤中的miR-155并成像肺癌細(xì)胞［7］。本研究擬采用CS-MB-OCT 在動(dòng)物水平上識(shí)別miR-155 并成像肺癌，以期為肺癌早診提供新思路，并為臨床前驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 28只8周齡雌性SPF級(jí)裸鼠購(gòu)自北京維通利華公司，體質(zhì)量18～20 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0020，63 只8 周齡Lox-Stop-lox K-rasG12D（LSL K-rasG12D）轉(zhuǎn)基因雌性SPF 級(jí)小鼠由陸軍軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所贈(zèng)予，體質(zhì)量20～24 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2021-0052。裸鼠和小鼠均飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物中心［動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2021-0005］，溫度21～24 ℃，濕度55%～60%，動(dòng)物自由獲取食物和水。本研究經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：2021 倫審第032號(hào)），均按照倫理委員會(huì)要求進(jìn)行動(dòng)物研究。

1.1.2 主要試劑與儀器 人肺腺癌A549細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心；SSTR2 兔單克隆抗體（美國(guó)santa cruz 公司）；OCT（上海吉爾生化有限公司），miR-155 MB（上海生工生物工程股份有限公司）；Cre 腺病毒（深圳百恩維公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）；CS 納米（四川廣漢恒宇新材料有限公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；U6、miR-155 引物套裝（廣州銳博生物有限公司）。SP5 激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM，德國(guó)萊卡公司）；小動(dòng)物活體體內(nèi)成像系統(tǒng)（in vivo imaging system spectrum，IVIS spectrum，美國(guó)Caliper Life Sciences公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型構(gòu)建 人肺腺癌A549細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)裸鼠及轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行分組。隨機(jī)抽取7只裸鼠使用戊巴比妥鈉麻醉后，通過(guò)尾靜脈注入1×106個(gè)A549細(xì)胞建立裸鼠肺移植瘤模型。4 周后脫頸處死小鼠，取肺組織，經(jīng)4%甲醛固定后制作4 μm 石蠟切片，行HE 染色觀察及SSTR2表達(dá)檢測(cè)。LSL K-rasG12D轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)鼻腔滴入分泌Cre酶的腺病毒后，根據(jù)滴入腺病毒后作用時(shí)間的不同，可動(dòng)態(tài)展示從正常肺組織到肺的非典型增生、腺瘤、原位癌、肺腺癌的不同病變階段［8］。隨機(jī)抽取28只轉(zhuǎn)基因小鼠，鼻腔緩慢滴入5×109PFU 的腺病毒，在滴入腺病毒后4、6、8、12 周分別處死7只小鼠，建立不同病變時(shí)期肺腺癌模型；取一側(cè)肺組織制作石蠟切片，行HE染色及SSTR2表達(dá)檢測(cè)，另一側(cè)肺組織液氮凍存后檢測(cè)miR-155表達(dá)。

1.2.2 免疫組化染色檢測(cè)SSTR2 表達(dá) 肺移植瘤模型及轉(zhuǎn)基因小鼠的不同病變時(shí)期肺組織蠟塊切片脫蠟，過(guò)氧化氫封閉，高壓修復(fù)，滴加1∶200 的STRR2 一抗，4 ℃過(guò)夜，滴加二抗，DAB 顯色，封片。免疫組化染色檢測(cè)SSTR2 在肺移植瘤組織及不同病變時(shí)期肺腫瘤組織的表達(dá)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-155的表達(dá) 使用Trizol試劑提取不同病變時(shí)期轉(zhuǎn)基因小鼠模型肺組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)miR-155 的表達(dá)變化。反應(yīng)體系：cDNA模板2μL，熒光染料0.4μL，上、下游引物各0.8 μL，Taq Ⅱ聚合酶10 μL，滅菌水6 μL，共20 μL。95 ℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)：95 ℃5 s，60 ℃34 s，40個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算不同病變時(shí)期轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中miR-155的表達(dá)變化。

1.2.4 CS-MB-OCT合成 根據(jù)人及小鼠miR-155序列（http：//www.mirbase.org/）設(shè)計(jì)并合成Hsa-miR-155 MB（5'-Cy5-CCAGCG-ACC+CCT+ATCA+CGAT+TAGCATTAA-CGCTGGBHQ2-3'）和Mmu-miR-155 MB（5'-Cy5-CCAGCG-ACC+CCT+ATCA+CAAT+TAGCATTAA-CGCTGG-BHQ2-3'），Cy5表示熒光基團(tuán)，BHQ2表示淬滅基團(tuán)，+N表示堿基進(jìn)行了鎖核酸修飾，下劃線處為莖干結(jié)構(gòu)。同時(shí)根據(jù)前期研究方法，制備CS-MBOCT［7］。

1.2.5 肺移植瘤裸鼠模型活體成像 剩余21只裸鼠隨機(jī)抽取14 只，再次建立肺移植瘤模型后戊巴比妥鈉麻醉，7 只裸鼠尾靜脈內(nèi)注射100μL未經(jīng)OCT修飾的CS-miR-155-MB，7只裸鼠注射OCT修飾的CS-miR-155-MB-OCT。7只未造模裸鼠作為對(duì)照組，尾靜脈注射100 μL CS-miR-155-MBOCT。MB 終濃度為2μmol/L。2 h 后置于IVIS 平臺(tái)，活體成像儀檢測(cè)肺部熒光信號(hào)及熒光強(qiáng)度?；铙w成像后，脫頸處死裸鼠并取肺組織再次成像，成像后制成肺部冰凍切片，多聚甲醛固定，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染細(xì)胞核，CLSM檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)源。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因小鼠模型活體成像 隨機(jī)選取剩余的35只轉(zhuǎn)基因小鼠，再次建立4、6、8、12周組不同病變時(shí)期轉(zhuǎn)基因小鼠模型，每組7 只，同時(shí)取未滴入Cre 酶的正常7 只轉(zhuǎn)基因小鼠為對(duì)照組，戊巴比妥鈉麻醉各組小鼠后，脫毛膏胸部體毛脫毛，尾靜脈分別注射100μL CS-miR-155-MB-OCT，MB終濃度為2μmol/L。2 h 后置于IVIS 平臺(tái)，活體成像儀檢測(cè)肺部熒光信號(hào)及熒光強(qiáng)度。活體成像后，脫頸處死轉(zhuǎn)基因小鼠并取肺組織再次成像，成像后制成肺部冰凍切片，多聚甲醛固定，DAPI染細(xì)胞核，CLSM檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)源。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變 HE 染色結(jié)果顯示，在裸鼠肺移植瘤模型中可見大小不等的肺腺癌腫瘤細(xì)胞種植結(jié)節(jié)；轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，在滴入腺病毒后的4、6、8、12 周的肺組織內(nèi)可觀察到非典型增生、腺瘤、原位癌、肺腺癌的不同病理學(xué)表現(xiàn)，見圖1。

2.2 SSTR2 的表達(dá) 免疫組化染色發(fā)現(xiàn)在肺移植瘤組織及轉(zhuǎn)基因小鼠肺癌模型不同病變時(shí)期肺組織的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿均表達(dá)SSTR2，見圖2。

Fig.2 Expression of SSTR2 in lung transplanted tumor and different pathological stages(IHC staining，×400)圖2 肺移植瘤及不同病變時(shí)期SSTR2的表達(dá)（免疫組化染色，×400）

2.3 miR-155 在不同病變時(shí)期轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá) 對(duì)照組、4周組、6周組、8周組、12周組miR-155的相對(duì)表達(dá)量分別為1.08±0.04、11.11±1.69、17.40±1.56、24.37±1.58、32.76±2.16，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=7，F(xiàn)=414.829，P＜0.05），隨著疾病進(jìn)展，miR-155表達(dá)逐漸增加（P＜0.05）。

2.4 CS-MB 及CS-MB-OCT 對(duì)肺移植瘤裸鼠模型中miR-155 的識(shí)別成像功能 活體成像儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CS-miR-155-MB-OCT 組熒光信號(hào)更強(qiáng)，而對(duì)照組未檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖3A）。對(duì)照組、CS-miR-155-MB組、CS-miR-155-MB-OCT 組熒光強(qiáng)度分別為1.86±0.46、22.38±2.21、68.23±2.98，與CS-miR-155-MB組比較，CS-miR-155-MB-OCT 組熒光強(qiáng)度更強(qiáng)（n=7，F(xiàn)=32.693，P＜0.05）。分離肺組織后，活體成像儀檢測(cè)表明熒光信號(hào)來(lái)自肺組織，且CS-miR-155-MB-OCT 組信號(hào)更強(qiáng)，而對(duì)照組未檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖3B）。再次將肺組織制成冰凍切片，CLSM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)大部分來(lái)自腫瘤細(xì)胞，CS-miR-155-MB-OCT 組熒光信號(hào)最強(qiáng)，大部分定位在細(xì)胞漿，小部分定位在細(xì)胞核，見圖4。

Fig.3 Detection of nanoparticles for miR-155 recognition and fluorescence intensity analysis by living imaging system in lung xenograft models圖3 肺移植瘤模型中活體成像系統(tǒng)檢測(cè)納米粒對(duì)miR-155的識(shí)別及熒光強(qiáng)度分析

Fig.4 The source of fluorescence signals detected by confocal laser scanning microscope in lung xenograft models圖4 肺移植瘤模型中激光共聚焦檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)源

2.5 CS-miR-155-MB-OCT 對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中miR-155的識(shí)別 轉(zhuǎn)基因小鼠模型不同病變時(shí)期小鼠肺內(nèi)可檢測(cè)到不同強(qiáng)度的熒光信號(hào)，且隨著肺癌疾病的發(fā)展，信號(hào)逐漸增強(qiáng)，而對(duì)照組未檢測(cè)到熒光信號(hào)，4 周組未檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)（圖5A）。對(duì)照組，4、6、8、12 周組熒光強(qiáng)度分別為2.56±0.60、14.62±2.02、22.26±2.18、29.26±1.41、38.24±1.22，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=7，F(xiàn)=516.444，P＜0.05），而且熒光強(qiáng)度趨勢(shì)和miR-155表達(dá)趨勢(shì)一致。將肺組織體內(nèi)取出后再次成像后發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)來(lái)自肺組織（圖5B），將轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織制成冰凍切片，CLSM發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)來(lái)自腫瘤細(xì)胞及部分正常肺泡上皮細(xì)胞，見圖6。

Fig.5 Nanoparticles for miR-155 recognition imaging function and fluorescence intensity analysis detected by the living imaging system in transgenic mouse models圖5 轉(zhuǎn)基因小鼠模型中活體成像系統(tǒng)檢測(cè)納米粒對(duì)miR-155的識(shí)別成像功能及熒光強(qiáng)度分析

Fig.6 The source of fluorescence signals detected by confocal laser scanning microscope in transgenic mouse model圖6 轉(zhuǎn)基因小鼠模型中激光共聚焦檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)源

3 討論

肺癌的發(fā)病率和病死率近年來(lái)一直持續(xù)增長(zhǎng)，且患者生存期短，嚴(yán)重威脅人類健康［9］。肺癌早期診斷可大大提高患者總生存期［10］。目前肺癌早期診斷手段有呼吸氣體檢測(cè)、胸部CT、基因測(cè)序、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)等，但都有一定局限性［11-13］。肺癌早期診斷的研究需要建立合適的動(dòng)物模型。腫瘤細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射后，先通過(guò)肺部的毛細(xì)血管網(wǎng)進(jìn)入血液循環(huán)，由于腫瘤細(xì)胞黏稠并易聚團(tuán)，會(huì)首先積聚在小鼠肺部微血管，并形成肺轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)注射A549肺腺癌細(xì)胞后4周，HE染色結(jié)果表明肺內(nèi)可觀察到大小不等的肺移植瘤結(jié)節(jié)，表明肺移植瘤肺腺癌模型建模成功。本研究所使用的LSL K-rasG12D轉(zhuǎn)基因小鼠有一個(gè)K-rasG12D 突變位點(diǎn)，在無(wú)Cre 酶誘導(dǎo)的情況下不表達(dá)K-ras，不會(huì)產(chǎn)生腫瘤。一旦給予小鼠鼻腔吸入分泌Cre酶的腺病毒，表達(dá)的Cre酶將會(huì)在DNA 水平特異性切除LSL 元件并誘導(dǎo)突變的K-ras 基因持續(xù)表達(dá)，導(dǎo)致小鼠肺癌的發(fā)生，且肺癌發(fā)生率為100%［14］。通過(guò)控制滴入病毒的滴度及病變發(fā)展時(shí)間，可以動(dòng)態(tài)地研究肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，為肺癌的早期診斷提供了理想的生物平臺(tái)模式。本研究HE 染色發(fā)現(xiàn)在滴入分泌Cre 酶的腺病毒后的4、6、8、12周，轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織內(nèi)可觀察到非典型增生、腺瘤、原位癌、肺腺癌的不同病理學(xué)表現(xiàn)，表明成功建立了肺癌發(fā)生、發(fā)展的不同病變時(shí)期的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。

miR-155 高表達(dá)可促進(jìn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展及擴(kuò)散［15-16］。MB是一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列，在自然狀態(tài)下其本身不產(chǎn)生熒光，但當(dāng)有靶DNA、RNA或miRNA 存在時(shí)，MB 可與之雜交結(jié)合并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。MB非常靈敏，即使靶基因有一個(gè)堿基存在差異，MB 也不會(huì)與之雜交及產(chǎn)生熒光信號(hào)；且分子信標(biāo)與靶基因結(jié)合牢固，可用于檢測(cè)并成像miRNA［17］。MB中部分堿基經(jīng)過(guò)鎖核酸修飾，和靶基因結(jié)合后具有不可逆性，雜交能力更強(qiáng)，且耐高溫及抗核酸酶降解。MB 設(shè)計(jì)的原則為：環(huán)狀區(qū)一般由15～30個(gè)核苷酸組成，避免同源雜交，莖干區(qū)一般由5～8 個(gè)堿基對(duì)組成，G、C 含量在70%～80%，連接熒光基團(tuán)的末端最好不用G，熒光基團(tuán)需要能被淬滅基團(tuán)特異性淬滅［18］。但MB需要合適的載體才能夠進(jìn)入細(xì)胞。CS 為帶正電的天然多糖，而堿基帶負(fù)電，兩者可通過(guò)靜電作用自組裝形成穩(wěn)定的核殼結(jié)構(gòu)，已被廣泛用于介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，且具有較高的安全性和有效性［19］。SSTR 顯像技術(shù)因可利用OCT 和腫瘤表面的SSTR 發(fā)生特異性結(jié)合，已被用于檢測(cè)肺癌、前列腺癌、乳腺癌SSTR 表達(dá)［20-22］。本團(tuán)隊(duì)前期基于以上研究設(shè)計(jì)并合成了CS-MB-OCT［7］。本研究免疫組化染色結(jié)果表明，在肺移植瘤及不同病變時(shí)期的轉(zhuǎn)基因小鼠模型病變組織中均表達(dá)SSTR2，提示可利用OCT與SSTR2特異性結(jié)合達(dá)到識(shí)別成像腫瘤的目的。且隨著肺癌病變進(jìn)展，miR-155 表達(dá)依次增加，可作為分子靶標(biāo)進(jìn)行示蹤、成像。

因裸鼠可排除小鼠體毛對(duì)MB Cy5熒光的影響，故本研究先選用相對(duì)簡(jiǎn)單的裸鼠肺移植瘤模型進(jìn)行研究。在肺移植瘤模型中，活體成像儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組未檢測(cè)到熒光信號(hào)，和未經(jīng)OCT 修飾的CS-miR-155 MB 組相比，CS-miR-155-MB-OCT 組熒光信號(hào)更強(qiáng)，表明OCT可以和SSTR2特異性結(jié)合，促使更多的CS-miR-155-MB-OCT 進(jìn)入細(xì)胞，更易于早期識(shí)別成像肺癌細(xì)胞，且產(chǎn)生的熒光信號(hào)更強(qiáng)。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，因小鼠黑色體毛對(duì)Cy5 熒光有遮擋作用，故使用脫毛膏進(jìn)行胸部體毛脫毛?；铙w成像儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)尾靜脈注入CS-miR-155-MB-OCT后，未進(jìn)行腺病毒滴入的無(wú)肺部病變的轉(zhuǎn)基因小鼠肺內(nèi)未檢測(cè)到熒光信號(hào)，4 周組非典型增生階段未檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)，但可測(cè)量到明顯的熒光強(qiáng)度，仍需進(jìn)一步研究以增加成像靈敏性；其余不同病變時(shí)期轉(zhuǎn)基因小鼠肺內(nèi)可檢測(cè)到不同強(qiáng)度的熒光信號(hào)，且隨著肺癌的發(fā)展，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。且熒光強(qiáng)弱與miR-155的表達(dá)趨勢(shì)較一致。本研究實(shí)現(xiàn)了通過(guò)識(shí)別成像miR-155 進(jìn)而成像肺癌細(xì)胞，并可通過(guò)不同的熒光強(qiáng)度反映肺癌發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段。

綜上，本研究利用納米和MB技術(shù)合成CS-MBOCT，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上實(shí)現(xiàn)了根據(jù)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度變化觀察肺癌的發(fā)生、發(fā)展，為肺癌的早診提供新技術(shù)，并為后續(xù)可能的臨床前研究奠定基礎(chǔ)。