雷敏，蔡春泉

類器官是干細胞在體外3D 培養(yǎng)條件下進行擴增并定向分化形成的多細胞團，具有類似其來源組織的生理結(jié)構(gòu)和功能特點，同時具有自我組織和更新能力［1］。目前，類器官已在模擬正常生理模型、疾病病理模型、藥物篩選及再生醫(yī)學等方面展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。類器官技術經(jīng)歷了十余年的發(fā)展，尤其自2015年以來，類器官專利數(shù)目呈指數(shù)性增長。類器官技術的出現(xiàn)，為兒童遺傳性疾病的研究開辟了新的道路。但現(xiàn)有類器官培養(yǎng)體系仍然存在一些局限性，如何擺脫局限，優(yōu)化方案，實現(xiàn)標準化構(gòu)建及評價，并將其應用于遺傳性疾病的研究和臨床應用中，仍需大量的實踐與探索。本文將圍繞類器官技術，著重介紹其在兒童遺傳性疾病中的應用，并對其面臨的挑戰(zhàn)和未來發(fā)展趨勢予以展望。

1 類器官簡介

類器官是指將成體干細胞、胚胎干細胞、誘導多能干細胞（iPSCs）以及腫瘤組織細胞接種于基底膜提取物或基質(zhì)膠中，再經(jīng)過特定細胞因子復合物作用，形成的高度保留來源組織器官特性的3D球狀復合物模型［1］。在既往生物醫(yī)學研究中，模擬人體生理發(fā)育及疾病病理的模型主要是2D 細胞模型和動物模型，盡管它們一直廣泛應用于臨床研究中，但細胞系的來源單一、缺乏信號轉(zhuǎn)導因子；動物模型培養(yǎng)周期長、效率低、成本高。因此，這兩種模型不能完全滿足生物醫(yī)學研究的需要［2］。類器官培養(yǎng)周期短、效率高，能更加準確地反映生理發(fā)育和疾病病理狀態(tài)。目前，類器官已廣泛應用于人體生理發(fā)育和疾病模型的模擬、藥物篩選及個性化治療等方面［3］。

Sato等［4］將成體腸道干細胞包埋在基質(zhì)膠中，首次形成了3D培養(yǎng)的腸道類器官，目前已經(jīng)有很多類型的特異性類器官被培育出來。在生理模型中，肝臟、大腦及腸道類器官占據(jù)前3 位；在疾病模型中，腫瘤模型占總數(shù)的76.30%［5］。此外，類器官可優(yōu)選應用于藥物篩選，揭示了類器官技術在精準醫(yī)療和臨床前藥物篩選中的巨大商業(yè)價值［5］。

2 類器官在兒童遺傳性疾病中的應用

2.1 作為疾病的模型 類器官與來源的組織器官保持高度的相似性，可以極好地平衡建模時間與成本，可用于模擬兒童遺傳性疾病。類器官模型的獲取通常采用兩種方法：（1）通過患者的活檢組織建立類器官。（2）在野生型類器官中引入特異的基因變異。第2種方法極大地受益于成簇規(guī)則間隔短回文重復序列/相關蛋白9（CRISPR/Cas9）技術的出現(xiàn)，該技術可以靶向切割被特定RNA引導識別的基因座。由于一些基因變異在發(fā)育早期即可致命，從而很難獲得該類患者的活檢組織，因而將類器官和CRISPR/Cas9 技術結(jié)合作為一種研究基因變異的方法，具有里程碑式的意義［6］。

2.1.1 作為囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）的研究模型 CF 是一種常染色體隱性遺傳疾病，由CFTR基因變異引起，主要累及患者的消化系統(tǒng)。CFTR蛋白功能障礙可導致液體運輸和黏液形成異常，從而累及多個系統(tǒng)［7］。Dekkers 等［8］首次使用CF 患者的直腸類器官模型進行了毛喉素誘導腫脹試驗（forskolin induced swelling test，F(xiàn)IS），定量分析了CFTR功能讀數(shù)并描述了CFTR調(diào)節(jié)劑在腸類器官中的作用機制，F(xiàn)IS開始用于測試攜帶不同CFTR變異的患者形成類器官的藥物反應。Bijvelds 等［9］成功培養(yǎng)了CF 的腸道及膽道類器官模型，并通過FIS證實了兩種類器官模型在不同藥物作用下轉(zhuǎn)運碳酸氫鹽和氯離子的區(qū)別。CF同樣易累及呼吸系統(tǒng)，患者肺部分泌大量黏液，為病原體提供了良好的繁殖環(huán)境，最終可導致呼吸衰竭。CF的氣道類器官可以從患者來源的iPSCs 獲得。Rodenburg 等［10］通過CF患者的鼻腔氣道上皮細胞形成類器官模型，同時利用CRISPR/Cas9技術進行TMEM16A基因敲除，用于研究TMEM16A和CFTR在呼吸道上皮細胞中的調(diào)節(jié)機制。Hirai等［11］利用基因編輯技術，形成了攜帶delF508純合變異以及攜帶delF508和G551D雜合復合變異的肺類器官模型，并評估了不同變異模型對CFTR調(diào)節(jié)劑的反應。因此，氣道上皮類器官可結(jié)合基因編輯技術形成攜帶不同CFTR突變的類器官模型，同時為CF藥物開發(fā)提供平臺。

2.1.2 作為神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病的研究模型 人腦類器官首次由Lancaster 等［12］開發(fā)，用于模擬胚胎時期大腦的組織結(jié)構(gòu)和發(fā)育軌跡，腦類器官可發(fā)育出各種離散但相互依賴的大腦區(qū)域。腦類器官的出現(xiàn)為研究神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病提供了機會，一些基因突變利用類器官技術已被確定可導致遺傳性小頭畸形，如WDR62基因［13］、CPAP基因［14］、AUTS2基因［15］等。An等［14］使用CRISPR/Cas9 技術形成攜帶編碼中心體CPAP-E1235V變異的大腦類器官模型，用于研究中心體功能障礙導致的常染色體隱性遺傳性小頭畸形，彌補了中心體基因突變小鼠模型在模擬疾病上的缺陷；結(jié)果表明，CPAP-E1235V 突變體干擾了參與中心粒延伸的幾種中心粒蛋白，引發(fā)神經(jīng)元過早分化并誘導p53 依賴性神經(jīng)元死亡。Fair 等［15］成功構(gòu)建了攜帶AUTS2基因錯義變異的大腦類器官模型，發(fā)現(xiàn)其與正常大腦類器官相比，表現(xiàn)出生長受損以及神經(jīng)祖細胞增殖缺陷、極性消失的現(xiàn)象，同時利用基因編輯技術糾正變異，達到對生長受損及神經(jīng)祖細胞增殖缺陷的挽救效果，該研究闡明了AUTS2基因變異在先天性腦畸形中的病理生理機制。此外，還有LIS1基因變異導致的無腦回畸形［16］，RAB39b基因變異導致的大頭畸形［17］。

2.1.3 作為消化系統(tǒng)遺傳病的研究模型 Bigorgne等［18］成功構(gòu)建了攜帶TTC7A變異的腸道類器官，用于多發(fā)性腸道閉鎖的研究。該研究發(fā)現(xiàn)TTC7A變異可以導致Rho 激酶活性增加，破壞腸上皮細胞的極性，從而引發(fā)多發(fā)性腸道閉鎖，為了解多發(fā)性腸道閉鎖的機制及其與RhoA信號通路的關系提供了見解。在一項針對先天性腸上皮疾病—微絨毛包涵體病的研究中，Duclaux-Loras 等［19］通過CRISPR/Cas9 技術生成了UNC45A缺陷的Caco-2 細胞，隨后將野生型和突變型UNC45A基因分別導入Caco-2細胞中形成類器官模型進行互補實驗，以研究UNC45A缺陷與微絨毛包涵體病表型之間的關系，結(jié)果表明，UNC45A缺陷型類器官表現(xiàn)出頂端運輸受損、微絨毛形成異常以及轉(zhuǎn)運蛋白定位錯誤，進而引發(fā)腹瀉、膽汁淤積等癥狀。在一項針對Alagille 綜合征的研究中，Guan 等［20］利用iPSCs 成功構(gòu)建攜帶不同JAG1變異的肝臟類器官，發(fā)現(xiàn)JAG1變異中的C829X會損害類器官的發(fā)育，而G274D不會影響類器官發(fā)育，證明了JAG1基因的不同變異類型可能對Alagille 綜合征的發(fā)展產(chǎn)生影響。綜上，類器官模型的建立與基因編輯技術的結(jié)合為深入研究兒童的各種遺傳病的發(fā)病機制及開發(fā)新的治療方法提供了重要見解。

2.2 用于遺傳缺陷的矯正 通過人體分離的干細胞進行體外擴增形成的類器官可以保持基因組穩(wěn)定性，利用CRISPR/Cas9技術，可以從患有某種遺傳性單基因疾病的患者中分離出類器官，并對類器官進行基因組編輯以糾正變異，CRISPR/Cas9 技術和類器官的結(jié)合使得再生醫(yī)學治療具有了理論支持。

Schwank 等［21］利用CRISPR/Cas9 基因組編輯系統(tǒng)，對培養(yǎng)的2 例CF 患者腸道干細胞進行同源重組，以矯正CF 變異，首次從原理上證明了類器官進行基因組編輯可糾正遺傳缺陷。Geurts等［22］建立了1 個包含664 例CF 患者的直腸類器官生物庫，同時利用基于CRISPR 的腺嘌呤堿基編輯技術成功修復了4個選定樣品的無義突變，證明了CRISPR技術在基因矯正中的潛力。

視網(wǎng)膜色素變性是一種不可逆的遺傳性視網(wǎng)膜病變，由于其遺傳異質(zhì)性和復雜的發(fā)病機制，目前仍無法治愈。RPGR基因變異是導致該疾病最常見的原因。Deng 等［23］從3例RPGR基因變異的患者身上獲得了iPSCs，將其分化衍生為視網(wǎng)膜類器官后，利用CRISPR/Cas9技術糾正RPGR變異，使得部分光感受器結(jié)構(gòu)和電生理特性得到恢復，逆轉(zhuǎn)纖毛病變，在培養(yǎng)皿中實現(xiàn)了RPGR變異的靶向基因治療。

Zhao 等［24］使用患者iPSCs 衍生的人類心臟類器官對家族性心肌病進行研究，發(fā)現(xiàn)攜帶E848G變異的心臟類器官的收縮功能顯著降低，而對舒張功能的影響很??；最后使用CRISPR/Cas9 技術與心臟類器官相結(jié)合以糾正E848G致病變異，成功改善了心肌收縮功能。

通過基因組工程在人類類器官中矯正遺傳缺陷的成功案例仍然很少，仍需不斷地探索和優(yōu)化。傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9基因組編輯技術利用Cas9核酸酶與RNA結(jié)合后靶向誘導雙鏈DNA斷裂，通過同源定向修復實現(xiàn)基因矯正，但這種類型的矯正往往是低效的。研究人員開發(fā)了一類新的腺嘌呤堿基編輯器，可以在基因組DNA中將A·T堿基對轉(zhuǎn)化為G·C堿基對，擴大了堿基編輯的范圍；這些堿基編輯器無需雙鏈DNA斷裂或提供供體DNA模板，使其成為更有效、更精確的基因組編輯方法，進一步擴大該技術安全性和實用性；隨著對基因組編輯技術的進一步研究，將為未來遺傳性疾病的矯正提供更多可能［25］。

2.3 用于遺傳性疾病的個性化治療 傳統(tǒng)的細胞系模型與3D類器官模型存在著明顯的基因差異，使用傳統(tǒng)的細胞系模型可能會忽略一些關鍵的靶點，類器官與來源的組織器官保持高度的相似性，可以極好地平衡建模時間與成本。使用類器官模型有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點。Amarachintha 等［26］在膽道閉鎖患兒的組織中培養(yǎng)出膽道類器官，通過激活成纖維細胞生長因子-2和表皮生長因子途徑，可以逆轉(zhuǎn)許多缺陷，改善極性，降低類器官的滲透性，最終開發(fā)出一種可以抑制纖維化并避免肝臟移植的治療方法。Kaji等［27］利用體外構(gòu)建的MY05B敲除空腸類器官對微絨毛包涵體病進行研究，發(fā)現(xiàn)MYO5B缺失會影響Wnt/Notch 信號通路的平衡以及影響小腸中的祖細胞分化，Notch抑制劑苯二氮改善了腸上皮細胞的分泌和細胞分化，可能是微絨毛包涵體病的潛在治療方法。SERPINA1基因變異可導致A1AT 蛋白錯誤折疊并在肝細胞內(nèi)積累，致肝臟損傷，使用抑瘤素M 可以使肝臟類器官上SERPINA1的表達增加，從而為A1AT缺乏癥的治療提供了可能［28］。

通過類器官技術已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多CF 的潛在治療靶點。Ramalho 等［29］對97 例CF 患者的腸道類器官進行了FIS，結(jié)果表明FIS有助于對CF患者的嚴重程度進行分類，CFTR功能讀數(shù)可用于指導CF 患者的個性化治療。CFTR調(diào)節(jié)劑療法顯著提高了患者的生活質(zhì)量，降低了病死率。類器官能夠以個性化的方式進行CF 疾病分類、開發(fā)藥物和優(yōu)化治療［30］。Hirai 等［11］發(fā)現(xiàn)在CF 患者的肺類器官中SGLT1 的表達水平較高，并測試了SGLT1/2 靶向藥物對類器官模型的影響，表明SGLTs可能是治療CF的潛在治療靶點。Rodenburg 等［10］使用TMEM16A基因敲除技術，證明了TMEM16A和CFTR在呼吸道上皮細胞中可能具有不同的調(diào)節(jié)機制，同時對CF患者的鼻腔氣道上皮類器官進行了中等通量的藥物篩選，它們可誘導不依賴于CFTR和TMEM16A的上皮細胞液分泌，可能為CFTR調(diào)節(jié)劑無效的患者提供替代療法。類器官為CF患者提供了藥物篩選模型，尤其是針對氯離子轉(zhuǎn)運體TMEM16A的藥物，已被證明為CF 患者的可替代治療方法。

類器官不僅可用于研究不同突變類型的遺傳性疾病，還可以通過培養(yǎng)不同疾病階段的類器官來持續(xù)評估治療效果以及個體耐藥性。利用藥物開發(fā)、細胞治療、免疫治療、基因校正或幾種治療方法的組合達到個性化治療的目的。

3 類器官在遺傳性疾病中的前景

雖然類器官在醫(yī)學研究中具有諸多優(yōu)勢，但也存在一些局限性，如培養(yǎng)體系的不穩(wěn)定導致類器官產(chǎn)生的可重復性和統(tǒng)一性差；復現(xiàn)來源器官動態(tài)微環(huán)境的能力有限；營養(yǎng)物質(zhì)交換受限于被動運輸而出現(xiàn)中心細胞壞死現(xiàn)象；培養(yǎng)過程中無法進行高通量分析、手工操作繁瑣等［31］。目前科研工作者正努力嘗試通過調(diào)整培養(yǎng)基和基質(zhì)膠、細胞因子、培養(yǎng)方法及體系等來建立更加高效可靠的類器官模型。

3.1 類器官芯片技術 類器官芯片作為一種新興前沿交叉技術，利用醫(yī)學與現(xiàn)代工程技術交叉融合極大地彌補了類器官在應用上的局限性，不僅具有類器官重現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)和功能上的優(yōu)勢，還實現(xiàn)了利用微流控在微米尺度上操控流體以及生物傳感器對參數(shù)變化的動態(tài)捕捉，進一步提高了對實驗參數(shù)變化的靈敏度以及生物模型的仿真度［2］。

目前已有類器官芯片模型用于遺傳性疾病的研究。Hiratsuka等［32］開發(fā)了常染色體隱性遺傳性多囊腎病的類器官芯片模型，以動態(tài)研究疾病病理學并確定潛在的治療靶點。研究人員使用3D 打印的微流控芯片將PKHD1變異類器官置于流體環(huán)境中，通過機械應力激活RAC1 和FOS 的表達，誘導遠端腎單位形成囊腫，并利用患者腎臟樣本的類器官芯片模型測試了靶向RAC1 和FOS 的藥物，發(fā)現(xiàn)它們抑制了囊腫的形成。Li等［33］使用類器官芯片模型探討了多囊腎病代謝、線粒體功能以及囊腫發(fā)生機制。發(fā)現(xiàn)流體剪切應力可以影響葡萄糖代謝進而促進類器官中的囊腫擴張，通過達格列凈等藥物可以調(diào)節(jié)葡萄糖代謝從而抑制囊腫生長。目前類器官芯片仍處于探索階段，有著廣闊的發(fā)展前景。

3.2 高通量篩選 研發(fā)藥物需要考慮藥物的臨床不良反應和藥代動力學等，但因為臨床模型的缺乏使得藥物研發(fā)過程變得成本高且周期長［34］。分子生物學時代的到來使得現(xiàn)代藥物研發(fā)模式逐漸過渡到靶向藥物的高通量篩選，藥物研發(fā)領域也由此展現(xiàn)出巨大的發(fā)展前景。目前已有自動進行干細胞分離培養(yǎng)類器官并進行藥敏試驗的一體化機器成功應用于類器官藥物篩選。Renner等［35］將自動化中腦類器官工作流與人工智能相結(jié)合用于帕金森病的高通量篩查分析，人工智能可以充分利用龐大的數(shù)據(jù)庫，并關聯(lián)跨學科的結(jié)果驅(qū)動數(shù)據(jù)分析，為創(chuàng)建下一代3D神經(jīng)疾病的模型奠定了基礎。Tran等［36］開發(fā)出一種改良的腎臟類器官平臺，可以有效地生成數(shù)千個腎臟類器官小單位，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析和免疫熒光驗證發(fā)現(xiàn)該腎類器官與人體腎臟有極高相似性，隨后通過滅活PKD1和PKD2基因形成了常染色體顯性多囊腎病的囊腫模型，因此該平臺可用于腎臟遺傳性疾病的建模；同時，該平臺制定了一個小分子篩選流程鑒定潛在的治療常染色體顯性多囊腎病的小分子化合物，利用圖像分析系統(tǒng)對類器官進行實時分析，并評估藥物對類器官生長和囊腫形成的影響，因此該平臺為腎臟遺傳性疾病進行高通量藥物篩選提供了更經(jīng)濟高效的途徑。

4 小結(jié)與展望

類器官的發(fā)展為醫(yī)學研究提供了新的技術手段，可用于構(gòu)建各種遺傳性疾病模型，幫助臨床醫(yī)生深入了解病理機制及潛在的治療策略。盡管類器官技術發(fā)展十分迅速，但未來類器官領域的主要的挑戰(zhàn)將是盡可能彌補與天然器官之間的差距，這就要求類器官模型在可復性、成熟度及培養(yǎng)結(jié)構(gòu)上有所提升。利用測序技術及RNA 斷層掃描技術有助于提高類器官培養(yǎng)的可復性，利用生物反應器及激光消融、生物打印法構(gòu)建血管化有利于提高類器官培養(yǎng)的成熟度，開發(fā)新的類器官相容性材料或與特定組織結(jié)構(gòu)相匹配的干細胞培養(yǎng)支架可用于改善類器官結(jié)構(gòu)，克服這些挑戰(zhàn)需要多學科尤其是與生物工程學領域的交流合作。目前，類器官技術仍存在一些缺陷，如未能完全復原細胞微環(huán)境、存在培養(yǎng)條件的優(yōu)化問題以及類器官庫的規(guī)范化建設等問題，但隨著技術本身及配套技術的進展，未來類器官模型的應用可能會徹底改變昂貴漫長的藥物研發(fā)過程，提高個體治療的精準性，并更廣泛地應用于遺傳性疾病的治療中。