劉國(guó)旗，李程程，劉聲菊，朱麗英△

肝細(xì)胞癌死亡率居惡性腫瘤排名的第4 位［1］。肝癌患者的治療以手術(shù)結(jié)合放、化療為主，系統(tǒng)性全身治療是晚期肝癌患者治療的唯一選擇，但療效有限，亟需開發(fā)更多有效的治療方案來(lái)改善晚期患者的生存狀況。大黃素屬蒽醌類化合物，具有抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛等功效［2］。大黃素還能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期，抑制腫瘤增殖、遷移、侵襲［3］和耐藥［4］。組蛋白乙?；芡ㄟ^(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的螺旋程度，參與和調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等多種過(guò)程，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；揎椏烧{(diào)控關(guān)鍵代謝酶的功能［6］，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的快速增殖［7］。大黃素能有效降低由糖尿病所致的組蛋白乙?；皆龈撸?］，據(jù)此推測(cè)大黃素有調(diào)控組蛋白乙?；墓δ?。本研究圍繞大黃素抗肝癌的作用展開，利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)手段，探究大黃素是否參與肝癌細(xì)胞組蛋白乙酰化調(diào)控過(guò)程，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞及人正常肝細(xì)胞系L02 細(xì)胞由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室保存；大黃素購(gòu)于Merck 公司，相對(duì)分子質(zhì)量270.24，純度≥97%。DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；凋亡試劑盒（南京凱基公司）；CCK-8試劑盒（日本東仁公司）；組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）、組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（日本TAKARA 公司）；引物及總RNA 提取試劑盒（上海生工公司）；胎牛血清（以色列BI 公司）；2.5%胰酶（美國(guó)Gibco 公司）；鼠源B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、兔源β-actin、Bcl-2-相關(guān)X 蛋白質(zhì)（Bax）、賴氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶2A（lysine Acetyltransferase，KAT2A）一抗（武漢三鷹）；兔源NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、胱天蛋白酶1（Caspase-1）、Gasdermin家族成員D N 端（Gasdermin-D N terminal，GSDMD-N）一抗（美國(guó)CST 公司）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的羊抗兔及羊抗鼠IgG 二抗（武漢三鷹）；細(xì)胞蛋白提取試劑盒（北京索萊寶公司）。倒置顯微鏡（日本佳能公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)賽默飛公司）；ECL曝光儀、蛋白電泳儀、酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼公司）；熒光PCR儀、普通PCR儀（上海宏石公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中選擇傳代數(shù)較少的HepG2細(xì)胞及L02細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基。選擇生長(zhǎng)周期為指數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)操作，經(jīng)2.5%胰蛋白酶消化后，以1.0×105個(gè)/mL 密度均勻鋪到培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到90%融合度進(jìn)行傳代處理。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 提前將HepG2 細(xì)胞以2.0×105個(gè)/mL 密度均勻鋪到96 孔板中，將大黃素終濃度設(shè)置為0、10、20、30、40、50、60、70、80、100μmol/L，檢測(cè)24 h 的細(xì)胞活性，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔以降低實(shí)驗(yàn)誤差。各組細(xì)胞到達(dá)作用時(shí)間后，按照細(xì)胞活力試劑盒操作說(shuō)明，將CCK-8 溶液加入96 孔中（每孔10μL），隨后置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，放置于酶標(biāo)儀中，以450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔細(xì)胞光密度（OD）值，計(jì)算得到細(xì)胞活力情況。

1.4 細(xì)胞分組及干預(yù) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞分為對(duì)照組和大黃素干預(yù)組，對(duì)照組細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)，不進(jìn)行干預(yù)處理；大黃素干預(yù)組細(xì)胞采用含60μmol/L大黃素的DMEM培養(yǎng)基處理24 h。

1.5 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析肝癌患者組蛋白乙?；?371例肝癌患者樣本與50 例健康人肝組織樣本的RNAseq 數(shù)據(jù)分別從TCGA（The Cancer Genome Atlas Program）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.com）及GTEx（Genotype-Tissue Expression）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://gtexportal.org/home/）獲取，R 軟件Limma 包用于研究mRNA 的差異表達(dá)。在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)pathway 中以“Histone acetylation”為搜索詞條，收集與組蛋白乙?；嚓P(guān)的基因。比較371例肝癌樣本與50例癌旁樣本中92個(gè)組蛋白乙?；嚓P(guān)基因mRNA的表達(dá)，以AdjustedP＜0.01且|log2（Fold change）|＞1為篩選條件使用R軟件ggVolcano包繪制火山圖。在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)pathway 中以“Apoptosis”為搜索詞條，收集與細(xì)胞凋亡通路相關(guān)的基因，通過(guò)R軟件GSVA包進(jìn)行分析，選擇參數(shù)method='ssgsea'，最后通過(guò)Spearman 法分析KAT2A mRNA與凋亡通路得分的相關(guān)性。

1.6 qPCR 驗(yàn)證KAT2A 基因轉(zhuǎn)錄水平 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞與L02細(xì)胞，提取RNA后立即進(jìn)行普通PCR逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 保存。使用2×iQ SYBR Green SuperMix 進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系：2×iQ SYBR Green SuperMix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA2 μL，ddH2O 7 μL，總體積20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40 次。KAT2A 引物：上游5'-CTAGGGGTCTTCTCGGCTTG-3'，下游5'-CTCTTCTCGCCTGGCATAGG-3'；GAPDH 引物：上游5'-TGTGGGCATCAATG-GATTTGG-3'，下游5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。按照2-ΔΔCt法計(jì)算不同細(xì)胞組KAT2A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 ELISA 法檢測(cè)HAT、HDAC、IL-1β、IL-18 水平 待大黃素達(dá)到作用細(xì)胞的時(shí)間后，利用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，隨后收集細(xì)胞液，按照ELISA 試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，加入HPR 標(biāo)記的山羊抗兔抗體100μL，經(jīng)孵育、洗滌處理后，再加入顯色劑100μL，室溫避光反應(yīng)20 min，最后加入終止液50μL。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組細(xì)胞OD值。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 待大黃素達(dá)到作用細(xì)胞的時(shí)間后，采用無(wú)EDTA 的胰酶消化收集細(xì)胞置EP 管中，利用無(wú)菌PBS 漂洗3 次，隨后按照凱基雙染凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，加入500 μL Buffer 重懸細(xì)胞，分別加入5 μL PI 和5μL FITC 反應(yīng)液，隨后震蕩混勻后避光保存，1 h 內(nèi)上機(jī)完成檢測(cè)，每組重復(fù)3次。

1.9 Western blot 檢測(cè)KAT2A、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá) 收集到達(dá)作用時(shí)間的細(xì)胞，利用細(xì)胞強(qiáng)力裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）破碎細(xì)胞膜獲得細(xì)胞蛋白。采用BCA法定量各組細(xì)胞蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后金屬浴10 min 使蛋白變性。按照蛋白檢測(cè)的方法進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜后，放置于提前配制好的KAT2A（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）、NLRP3（1∶1 000）、Caspase-1（1∶2 000）、GSDMD-N（1∶2 000）和β-actin（1∶5 000）一抗溶液中，于4 ℃冷庫(kù)搖床孵育過(guò)夜。第2天TBST漂洗3次后，室溫放置在羊抗鼠（1∶5 000）或羊抗兔（1∶5 000）二抗溶液中孵育2 h，TBST中漂洗3次，每次15 min，采用ECL法顯色，曝光儀收集圖像，Image J軟件分析目的蛋白灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graphpad Prism 9.0 軟件及SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素作用肝癌細(xì)胞最適濃度 CCK-8 結(jié)果顯示，大黃素干預(yù)半抑制濃度（IC50）的95%置信區(qū)間為58.12～66.52μmol/L，見(jiàn)圖1。取60μmol/L的大黃素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig.1 Emodin affected IC50 of hepatocellular carcinoma cells圖1 大黃素作用肝癌細(xì)胞IC50值

2.2 肝癌患者組蛋白乙?；?TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，健康人肝組織與肝癌組織中組蛋白乙?；町惐磉_(dá)的基因共有22 個(gè)，均表達(dá)上調(diào)，且KAT2A 表達(dá)變化倍數(shù)最高［log2（Fold Change）=2.010，P＜0.01］，見(jiàn)圖2。KAT2A mRNA 在肝癌組織中表達(dá)量明顯增高（Z=17.780，P＜0.01），見(jiàn)圖3。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，肝癌患者中KAT2A mRNA的表達(dá)與細(xì)胞凋亡通路得分呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.230，P＜0.01），見(jiàn)圖4。

Fig.3 Comparison of mRNA expression of KAT2A between hepatocellular carcinoma tissue and normal tissue圖3 KAT2A在肝癌組織及健康人肝組織mRNA表達(dá)量比較

Fig.4 Spearman analysis of the correlation between KAT2A mRNA and the apoptotic pathway圖4 Spearman分析KAT2A mRNA與細(xì)胞凋亡通路的相關(guān)性

2.3 肝癌細(xì)胞中KAT2A mRNA表達(dá)情況 qPCR結(jié)果顯示，與L02細(xì)胞相比，KAT2A mRNA在HepG2中表達(dá)更高（26.97±4.45vs.1.00±0.25，t=13.045，P＜0.05）。

2.4 大黃素對(duì)細(xì)胞HAT、HDAC、IL-18、IL-1β 水平的影響 ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，大黃素干預(yù)組HAT和HDAC的表達(dá)水平下降，IL-18和IL-1β表達(dá)水平增高（P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.5 大黃素對(duì)細(xì)胞凋亡影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，大黃素干預(yù)組細(xì)胞凋亡率（%）升高（15.30±3.36vs.4.24±2.00，n=3，t=4.898，P＜0.05），見(jiàn)圖5。

Tab.1 Comparison of HAT,HDAC,IL-18 and IL-1β levels between the control group and the 60 μmol/L emodin intervention group表1 對(duì)照組與大黃素干預(yù)組HAT、HDAC、IL-18、IL-1β水平的比較（n=5，OD450，）

＊＊P＜0.01。

組別對(duì)照組大黃素干預(yù)組t HAT 1.37±0.20 0.69±0.13 6.043＊＊HDAC 1.29±0.12 0.89±0.07 6.386＊＊IL-18 0.14±0.01 0.31±0.05 7.077＊＊IL-1β 0.18±0.04 0.40±0.05 6.753＊＊

2.6 大黃素對(duì)HepG2 細(xì)胞KAT2A、Bcl-2、BAX、NLRP3、GSDMD-N 及Caspase-1 蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，大黃素干預(yù)組KAT2A 蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 表達(dá)水平增高，BAX 表達(dá)水平降低，細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD-N 及Caspase-1 表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖6—8，表2。

Tab.2 Comparison of KAT2A,Bcl-2,BAX,NLRP3,GSDMD-N and Caspase-1 protein expression levels between the control group and the 60 μmol/L emodin intervention group表2 對(duì)照組和60 μmol/L大黃素干預(yù)組KAT2A等各種蛋白表達(dá)水平的比較（n=3，）

Tab.2 Comparison of KAT2A,Bcl-2,BAX,NLRP3,GSDMD-N and Caspase-1 protein expression levels between the control group and the 60 μmol/L emodin intervention group表2 對(duì)照組和60 μmol/L大黃素干預(yù)組KAT2A等各種蛋白表達(dá)水平的比較（n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對(duì)照組大黃素干預(yù)組t KAT2A 0.91±0.26 0.35±0.12 3.426＊Bcl-2 0.26±0.06 1.08±0.17 7.909＊＊BAX 1.04±0.04 0.65±0.12 5.211＊＊組別對(duì)照組大黃素干預(yù)組t NLRP3 0.57±0.02 0.97±0.16 4.392＊GSDMD-N 0.58±0.13 1.03±0.18 3.632＊Caspase-1 0.52±0.07 0.98±0.04 10.507＊＊

Fig.6 Western blot detection of KAT2A expression圖6 Western blot檢測(cè)KAT2A表達(dá)情況

Fig.7 Western blot detection of apoptosis-associated proteins圖7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

Fig.8 Western blot detection of pyroptosis related proteins圖8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白

3 討論

大黃素廣泛存在于常見(jiàn)的中草藥中，如大黃、虎杖、生何首烏、制何首烏等。大黃素可通過(guò)多途徑抑制肝癌發(fā)展［9］。組蛋白乙?；瘏⑴c癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移［10］。多種癌癥患者癌組織HDAC 顯著增加，但不同類型的癌癥增加程度不同，HDAC 在不同腫瘤中的表達(dá)差異可以被用來(lái)開發(fā)更有針對(duì)性的治療方法。Yuan 等［11］在肝癌中發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；Ｊ疆惓?，與肝癌細(xì)胞的增殖與遷移功能相關(guān)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，組蛋白乙?；揎椣嚓P(guān)基因的表達(dá)水平均上調(diào)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了5種組蛋白脫乙酰酶抑制劑（HDACi）用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤［12］，且靶向HDACs 聯(lián)合索拉菲尼能夠讓肝癌患者獲益［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃素干預(yù)能夠下調(diào)肝癌細(xì)胞HATs 和HDACs的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞組蛋白乙?；健?/p>

進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中賴氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶KAT2A mRNA水平上調(diào)，且與細(xì)胞凋亡存在負(fù)相關(guān)。作為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的賴氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶，KAT2A可將乙?；D(zhuǎn)移到賴氨酸殘基的游離氨基上，催化組蛋白多個(gè)位點(diǎn)的乙?；揎?，廣泛參與到包括基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化、DNA 修復(fù)、核小體組裝等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程［14］。Guo 等［15］發(fā)現(xiàn)KAT2A在腎癌組織中的表達(dá)高于正常組織，高KAT2A表達(dá)可以作為一個(gè)獨(dú)立的生物標(biāo)志物，與腎癌患者不良的生存結(jié)局相關(guān)。Ma等［16］發(fā)現(xiàn)，KAT2A通過(guò)將長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）GCAWKR 作為連接支架，結(jié)合WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白5（WD40 repeat-containing protein 5，WDR5），介導(dǎo)胃癌的發(fā)生。Domingues等［17］發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的KAT2A通過(guò)保存白血病干細(xì)胞樣細(xì)胞促進(jìn)了白血病細(xì)胞的增殖，而KAT2A的缺失會(huì)影響轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)變白血病細(xì)胞的分化狀態(tài)。Wu 等［18］發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元中，KAT2A 的缺失將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究也發(fā)現(xiàn)大黃素干預(yù)能在抑制肝癌細(xì)胞KAT2A 的表達(dá)的同時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3，GSDMD-N，Caspase-1的表達(dá)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中組蛋白乙?；嚓P(guān)基因表達(dá)上調(diào)，KAT2A 表達(dá)增高；當(dāng)大黃素干預(yù)后，KAT2A表達(dá)下調(diào)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，上調(diào)細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD-N 和Caspase-1 的表達(dá)。這提示大黃素可能靶向作用于組蛋白去乙?；窴AT2A，但仍需后續(xù)采用酶活實(shí)驗(yàn)、分子對(duì)接預(yù)測(cè)、表面等離子共振技術(shù)證明大黃素與KAT2A的直接結(jié)合作用。盡管大黃素具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡與焦亡的能力，但其IC50值較高。因此，對(duì)大黃素進(jìn)行基于酶活的小分子藥物改造，提高其口服利用度和生物活性是下一步的研究重點(diǎn)。