陳浩，李蕊，易菲，周麗，陳嘉琪，朱璠，管城艷，吳娜，5△

類器官技術已經(jīng)實現(xiàn)了各種類型的上皮細胞體外自我更新，同時自組裝成類似于其親本組織的3D結構，它成功復刻了原始組織的體內(nèi)結構、功能和遺傳特征，在研究器官發(fā)育、生物學和病理生理學方面，類器官代表了一種比傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)更具有生理相關性的體外模型，同時也為臨床提供器官移植供體的替代療法帶來了巨大潛能［1］。人源類器官的新進展使得疾病建模更加精確，現(xiàn)已應用于炎癥［2］、感染［3］、代謝［4-5］和腫瘤［6］等疾病的研究。模擬疾病的類器官可用作藥物測試的替代系統(tǒng)，既能測試藥物的效力和毒性，又能更好地詮釋臨床療效［7］。相對于傳統(tǒng)的動物模型，類器官技術可用于模擬多種不易或者無法在動物體內(nèi)模擬的神經(jīng)發(fā)育障礙、肝臟代謝障礙和退行性疾病等，顯著減少了用于藥物毒性和功效測試的動物研究［8-9］。為進一步探究炎癥與腸道疾病的關系，本實驗構建了小鼠小腸類器官并以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導，旨在建立合適的以體外類器官為基礎的腸損傷炎癥模型，為腸道醫(yī)學研究和臨床新療法的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級6～8 周齡雄性C57BL/6 小鼠6 只，體質(zhì)量18～22 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010］，飼養(yǎng)環(huán)境的溫度約24 ℃，相對濕度為40%～70%。動物飼養(yǎng)、實驗操作均在江西中醫(yī)藥大學進行［動物使用許可證號：SYXK（贛）2022-0002］。

1.2 試劑與儀器 LPS 購自Sigma-Aldrich 公司；不含Ca2+、Mg2+的磷酸鹽緩沖液（DPBS）購自Biosharp；上皮類器官基礎培養(yǎng)基、類器官基質(zhì)膠（organoid culture ECM）、乙二胺四乙酸（EDTA）、小腸類器官完全培養(yǎng)基（在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加N-乙酰半胱氨酸、B+補充劑、GlutaMAX、60 U/mL 青霉素、0.1 g/L 鏈霉素、5 μg/L EGF、250 μg/L R-spondin-1、100 μg/L Noggin、500 nmol/L A83-01、5μmol/L Y-27632和5 mmol/L 煙酰胺）均購自伯楨生物（bioGenous）；24、48、96孔板購自蘭杰柯生物科技有限公司；70μm細胞過濾器購自比克曼生物科技有限公司；CCK-8 檢測試劑盒購自美侖生物技術有限公司；倒置顯微鏡購自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購自上海潤度生物科技有限公司；臺式低速離心機購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司；超凈工作臺購自力康精密科技（上海）有限公司；酶標儀購自美國賽默飛公司；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、白細胞介素（IL）-1α、IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自江蘇酶免生物科技有限公司。

1.3 小鼠小腸隱窩分離與小腸類器官原代培養(yǎng) 腹腔麻醉后采取頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下開腹取15 cm 左右的小腸組織，放入預冷的DPBS中清洗，去除小腸外層的薄膜和周圍的脂肪組織。沿長軸將小腸剪開，在DPBS 中清洗小腸內(nèi)容物后將小腸分成5～8 cm若干段。用載玻片輕輕刮去腸腔表面的腸絨毛，將清洗后的小腸組織剪至3 mm 的組織碎片，用預冷的DPBS 清洗后將組織碎片轉移到15 mL 含5 mmol/L EDTA 的冷DPBS 中，在4 ℃冰箱中消化20 min。將消化好的小腸碎片轉移至50 mL 離心管中，加入25 mL DPBS，上下適當搖晃（切記不要劇烈搖晃以避免破壞隱窩結構，力度不要過輕以免隱窩搖不下來），使隱窩與基底層分離，用70 μm 的細胞過濾器過濾混懸液。將濾液經(jīng)過室溫300×g離心5 min，吸去上清液后，加入1 mL基礎培養(yǎng)基重新吹打重懸沉淀，吸取適量隱窩懸液通過顯微鏡觀察隱窩形態(tài)并計數(shù)（最佳隱窩數(shù)量為5～10 個/μL）。再經(jīng)室溫300×g離心5 min，去除上清液。將事先在冰上預冷的基質(zhì)膠重懸細胞沉淀，取出提前放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱中預熱的24孔板，吸取基質(zhì)膠-隱窩混合懸液，先滴在培養(yǎng)孔底部中央位置，再以畫圈的方式往周圍鋪開形成穹頂狀進行接種（30μL/孔）。接種后將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱（5%CO2、37 ℃）15～20 min，待基質(zhì)膠完全固化后，加入500μL完全培養(yǎng)基，剩余空白孔加入500μL無菌DPBS，以保證培養(yǎng)板的濕化。將24孔板放入細胞培養(yǎng)箱（5%CO2、37 ℃）中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察生長狀態(tài)，培養(yǎng)期間每周更換完全培養(yǎng)基3次，5～7 d進行傳代。

1.4 小腸類器官的傳代培養(yǎng) 培養(yǎng)5～7 d或類器官中央?yún)^(qū)域變黑時進行傳代。吸去待傳代孔中的培養(yǎng)液，每孔加入預冷的500μL基礎培養(yǎng)基，用移液槍吹打30～50次，避免產(chǎn)生氣泡，將孔中的基質(zhì)膠和類器官吹散。將混懸液轉移至1.5 mL離心管中，室溫300×g離心5 min，棄去上清液，取出提前放入細胞培養(yǎng)箱中預熱的24孔板，將基質(zhì)膠與小腸隱窩細胞團混勻成混懸液，接種到24 孔板中，放于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～20 min，待基質(zhì)膠自然凝固后，每孔再加500μL完全培養(yǎng)基，放置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 建立體外小腸類器官炎癥模型并行增殖活力測定 參照文獻［10］構建炎癥模型的方法并適當改進，通過LPS處理小腸類器官，建立體外小腸類器官炎癥模型，篩選LPS 的適宜濃度和作用時間。將傳代后的小腸類器官接種到96孔板中進行培養(yǎng)，當類器官生長匯合度達到50%以上或培養(yǎng)3 d時，棄去舊培養(yǎng)基，使用完全培養(yǎng)基配制0、150、175、200、225、250、275、300 mg/L LPS，分別置于相應孔中，放入37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中分別孵育24 h和48 h，在倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄LPS 誘導炎癥后小腸類器官的生長及形態(tài)特征變化。每孔加入10μL CCK-8 溶液，放于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，使用酶標儀在450 nm 波長下檢測各孔的光密度（OD）值，以檢測小腸類器官增殖活力。

1.6 ELISA 法檢測IL-1α、IL-6、IL-10、GM-CSF 的水平 分別收集LPS 作用24 h 和48 h 后的類器官培養(yǎng)上清液并儲存在-80 ℃，根據(jù)上述形態(tài)學觀察和CCK-8檢測的增殖活力結果綜合篩選出4 個質(zhì)量濃度LPS 行進一步的炎性因子檢測。按照ELISA試劑盒說明書中的操作方法進行處理，在450 nm波長處測量各孔的OD 值，繪制標準曲線計算IL-1α、IL-6、IL-10、GM-CSF炎性因子的濃度。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠小腸類器官體外培養(yǎng)體系的建立 接種在24孔板后，新分離的成活小腸隱窩呈現(xiàn)U型發(fā)夾樣結構。培養(yǎng)數(shù)小時至1 d 內(nèi)開始自動閉合形成輪廓較清晰的囊狀圓球體結構，中心有單個內(nèi)腔。培養(yǎng)2～3 d 可見圓球狀結構逐漸變大，內(nèi)部開始呈現(xiàn)類似腸腔的中空結構。小腸干細胞在不斷進行自我更新和復制，第4 天可觀察到圓球狀結構外側周圍開始出現(xiàn)出芽并向外突出生長。隨著培養(yǎng)時間的增加，出芽數(shù)量逐漸增多，管腔結構更加明顯，管腔壁也明顯增厚，形成小腸類器官。第5 天逐漸形成圍繞中央管腔周圍的類似花環(huán)狀結構，管腔中央有脫落的細胞開始出現(xiàn)凋亡，顏色變深，此時要盡快完成傳代。傳代后的小腸類器官被切割成了小腸類器官碎片，隨著培養(yǎng)時間的增加，傳代培養(yǎng)3 d 會重新長成成熟的小腸類器官結構，此時的小腸類器官可用于進行后續(xù)實驗。見圖1。

Fig.1 Changes of growth morphology of small intestinal organs in mice after primary and post-passage圖1 小鼠小腸類器官原代及傳代后的生長形態(tài)變化

2.2 不同時間和質(zhì)量濃度LPS 對小腸類器官生長和分化狀態(tài)的影響 隨著LPS質(zhì)量濃度和時間的增加，小腸類器官有不同程度膨脹趨勢和內(nèi)腔逐漸呈黑色凋亡狀態(tài)，受損的腸上皮中隱窩或腸干細胞的增殖分化能力和出芽數(shù)量也受到不同程度的抑制。與0 mg/L LPS 作用24 h 和48 h 相比，不同質(zhì)量濃度LPS對誘導不同時間的小腸類器官的生長出現(xiàn)不同程度的抑制作用。其中175、200、225、250和275 mg/L LPS在24 h和48 h作用下膨脹程度和48 h內(nèi)腔凋亡狀態(tài)最為明顯，但150 mg/L 和300 mg/L LPS 作用后膨脹趨勢不明顯。見圖2。

Fig.2 Effects of different time points and concentrations of LPS on the growth and differentiation of intestinal organoids圖2 不同時間和質(zhì)量濃度LPS對小腸類器官生長和分化狀態(tài)的影響

2.3 不同時間和質(zhì)量濃度LPS 對小腸類器官增殖活力的影響 與0 mg/L LPS相比，175～300 mg/L LPS誘導小腸類器官炎癥后24 h和48 h增殖活力出現(xiàn)不同程度的降低（P＜0.05），并且175～225 mg/L LPS 誘導小腸類器官炎癥后24 h和48 h的細胞活力仍大于50%，見圖3，故選擇該濃度范圍進行后續(xù)實驗。

Fig.3 Effects of different time points and concentrations of LPS on the proliferation activity of small intestinal organoids圖3 不同時間和質(zhì)量濃度LPS對小腸類器官增殖活力的影響

2.4 不同質(zhì)量濃度LPS 誘導對小腸類器官GMCSF、IL-1α、IL-6、IL-10 水平的影響 小腸類器官在給予0、175、200和225 mg/L LPS誘導后，與0 mg/L LPS 相比，200 mg/L 的LPS 誘導24 h后，IL-1α和IL-6 水平升高，IL-10 水平降低（P＜0.05）；200 mg/L 的LPS誘導48 h后，GM-CSF水平升高，IL-10水平降低（P＜0.05）；225 mg/L 的LPS 誘導24 h 后，IL-6 水平升高（P＜0.05）；225 mg/L 的LPS 誘導48 h 后，IL-1α、IL-6、GM-CSF水平升高（P＜0.05），見圖4。

Fig.4 The expression of inflammatory factors in small intestinal organoids treated by four concentrations of LPS圖4 4種質(zhì)量濃度LPS對小腸類器官炎性因子水平的表達

3 討論

膿毒癥是一種復雜且動態(tài)變化的綜合性疾病，其早期會由于腸道的缺血、缺氧引起腸道組織和細胞發(fā)生氧化應激損傷、腸功能障礙，導致腸道內(nèi)毒素、細菌等侵入體內(nèi)，引起大量炎性因子的釋放與分泌［11］。LPS 是革蘭陰性菌細胞壁衍生的炎癥毒素，其在免疫細胞激活的情況下，將導致多效性炎性細胞因子和趨化因子分泌，引起一系列炎癥反應。由于LPS 具有良好的熱穩(wěn)定性和廣泛的毒性反應，因此在與炎癥相關的研究中得到廣泛應用［12］。在正常生理情況下，腸道上皮細胞通過促進營養(yǎng)物質(zhì)、水和離子的跨細胞運動來保持適當?shù)钠琳瞎δ?，同時減少細菌或其產(chǎn)物進入系統(tǒng)循環(huán)的細胞旁運輸［13］。但在腸道通透性障礙中，緊密連接屏障缺陷可使LPS和其他炎性管腔抗原細胞旁通量增加，LPS 通過刺激Toll 樣受體導致細胞內(nèi)核轉錄因子κB 的重新激活，隨后釋放化學因子和炎性細胞因子，促進大量促炎因子如IL-1α、IL-6、GM-CSF的產(chǎn)生和釋放，抑制抗炎因子IL-10、IL-11 的產(chǎn)生和釋放，最終導致細胞壞死或凋亡，誘發(fā)全身性炎癥反應的發(fā)生發(fā)展［14-15］。以往研究表明，炎性因子的產(chǎn)生能夠對腸上皮細胞的增殖與分化等方面產(chǎn)生影響，如在小鼠小腸體外模型中，IL-6 能夠增加小腸中增殖細胞和干細胞數(shù)量，可顯著促進腸上皮細胞的增殖［16］。這種促炎因子的持續(xù)升高會使腸道炎癥難以消退，并且腸上皮的自我更新能力失調(diào)導致腸上皮損傷，進而引發(fā)一系列炎癥反應。本實驗成功分離出了小腸隱窩，在體外培養(yǎng)成了類器官，用于模擬各種腸道疾病的研究。筆者進一步采用不同質(zhì)量濃度LPS分別作用24 h 和48 h 后，小腸類器官形態(tài)出現(xiàn)不同程度的膨脹和內(nèi)腔變黑的凋亡現(xiàn)象，其中175、200、225、250 和275 mg/L LPS 在24 h 和48 h 作用下形態(tài)學變化相對明顯。本研究結果表明，200或225 mg/L LPS可能是誘導小腸類器官炎癥的適宜濃度。有學者以200 mg/L LPS 進行類器官誘導炎癥的體外實驗［17］，本研究結果也進一步證明了其可行性。需注意的是，不同炎性因子之間存在不同的分泌峰值的情況，這可能是因為TLR 受體亞型活化結果的不同所導致，也可能是因為細胞因子本身通過正反饋或負反饋來調(diào)節(jié)旁分泌，從而導致其他炎性因子分泌增加或減少［18］。本研究構建的小腸類器官經(jīng)LPS處理后符合腸上皮生長受限、屏障功能受損以及炎癥反應增強等腸上皮損傷模型的標準，但在體外-體內(nèi)相關性方面，仍需進行進一步的實驗研究，以充分了解LPS誘導的小腸炎癥系統(tǒng)的原理及其限制。

腸損傷炎癥模型的建立有望彌補目前的抗炎或免疫抑制等治療策略難以克服異質(zhì)性、多因素的炎癥性腸病的缺陷，體外構建炎癥模型的類器官代表了針對腸上皮功能障礙的炎癥性腸病建模的有效工具［19-20］。腸干細胞衍生的類器官在長期培養(yǎng)期間，其遺傳、表觀遺傳和表型趨于穩(wěn)定，對腸道疾病的發(fā)病機制研究具有重要意義［21］。目前人類疾病的治療存在患者個體差異大和個性化療效難以預測等局限性，而基于特定個體的3D類器官培養(yǎng)物有望發(fā)展成精準醫(yī)療的有力工具［22］。在初始體外篩選中建立仿生平臺以預測候選藥物的效力將極大降低高昂的研發(fā)成本，為藥物篩選和開發(fā)靶向療法提供了新型的有效平臺。