李 婕，曹學(xué)思，楊愛(ài)君，何 瑛，紀(jì)坤發(fā)，羅少杰

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 510000

0 引言

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是迄今發(fā)現(xiàn)污染農(nóng)產(chǎn)品毒力最強(qiáng)的一類生物毒素[1]。常見(jiàn)的有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，其中AFB1的含量與毒力最大[2]。黃曲霉毒素B1通常存在于花生、玉米、堅(jiān)果等農(nóng)副產(chǎn)品中[3]。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1的4-羥基衍生物[2]。它是動(dòng)物在攝入被黃曲霉毒素B1污染的飼料和食品后在體內(nèi)產(chǎn)生的代謝物[4]，可致癌、致畸、致突變，其結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，溶于多種有機(jī)試劑，如氯仿、乙腈和甲醇等[5，6]，存在于動(dòng)物分泌的乳汁和尿液中。牛乳是受黃曲霉毒素M1污染風(fēng)險(xiǎn)程度較高的食品之一。為保證安全衛(wèi)生，各國(guó)都制定了嚴(yán)格限量標(biāo)準(zhǔn)：美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）規(guī)定牛乳中黃曲霉毒素M1的限量水平為0.5 μg/kg，我國(guó)也規(guī)定牛乳中黃曲霉毒素M1含量不得超過(guò)0.5 μg/kg[7]。運(yùn)用簡(jiǎn)易、便捷、快速、準(zhǔn)確且適用的檢測(cè)方法，測(cè)定牛生乳中黃曲霉毒素M1的污染狀況，對(duì)乳品企業(yè)在日常生乳驗(yàn)收、乳品生產(chǎn)制造的過(guò)程中，能更好維護(hù)產(chǎn)品質(zhì)量，保障消費(fèi)者食品安全，具有重要意義。

目前測(cè)定牛乳中黃曲霉毒素M1殘留量的方法有：色譜法、免疫化學(xué)法、光電化學(xué)法、光電發(fā)光法等。這些方法操作復(fù)雜繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，或所需檢測(cè)設(shè)備昂貴，均不利于乳品企業(yè)快節(jié)奏的生乳驗(yàn)收。而黃曲霉毒素M1膠體金快速檢測(cè)試紙條法是一種利用膠體金免疫層析技術(shù)的新型檢測(cè)方法，操作過(guò)程簡(jiǎn)易、耗時(shí)短、成本低、檢出限符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，且特異性、靈敏度強(qiáng)，干擾性小，能較好滿足乳品企業(yè)快節(jié)奏的生乳驗(yàn)收及成品奶檢測(cè)需求。本文采用黃曲霉毒素M1膠體金快速檢測(cè)試紙條法和ELISA檢測(cè)試劑盒法做比對(duì)試驗(yàn)，驗(yàn)證膠體金快速檢測(cè)試紙條法對(duì)不同加標(biāo)濃度檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性，驗(yàn)證該法的結(jié)果穩(wěn)定性，并檢驗(yàn)該法結(jié)果報(bào)陽(yáng)的樣品濃度。同時(shí)，檢測(cè)ELISA檢測(cè)試劑盒法檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性、回收率和RSD值，驗(yàn)證該法檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和精密度，并驗(yàn)證2 種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性，證實(shí)2 種方法聯(lián)合使用測(cè)定生乳中黃曲霉毒素M1殘留量的可行性，為乳品企業(yè)進(jìn)行快速生乳驗(yàn)收提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

RomerLabs黃曲霉毒素M1ELISA檢測(cè)試劑盒，易瑞黃曲霉毒素M1膠體金快速檢測(cè)試紙條。

1.2 儀器和設(shè)備

SIGMA離心機(jī)、Thermo酶標(biāo)儀、BIOEASY金屬浴熱器、BIOEASY-SAFF Reader 02型膠體金試紙條讀數(shù)儀、BRAND 8道移液器、BRAND單道移液器、CRYSTAL漩渦振蕩器等。

2 檢測(cè)原理

黃曲霉毒素M1膠體金快速檢測(cè)試紙條法的檢測(cè)原理：樣品溶液中黃曲霉毒素M1與膠體金標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗體相結(jié)合，封閉膠體金標(biāo)記黃曲霉毒素M1抗體上的黃曲霉毒素M1抗原結(jié)合位點(diǎn)，阻止膠體金標(biāo)記黃曲霉毒素M1抗體與纖維素膜上檢驗(yàn)區(qū)中黃曲霉毒素M1蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，使之顯色較弱，甚至不顯色；反之，如樣品溶液中沒(méi)有黃曲霉毒素M1，則不能阻止膠體金標(biāo)記黃曲霉毒素M1抗體與纖維素膜上檢測(cè)區(qū)中黃曲霉毒素M1蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，顯色較強(qiáng)。

黃曲霉毒素M1E L I S A 檢測(cè)試劑盒法的檢測(cè)原理：試劑盒應(yīng)用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附原理。樣品中黃曲霉毒素M1或標(biāo)準(zhǔn)品與酶-黃曲霉毒素M1偶合物中黃曲霉毒素M1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合微孔中特異抗體，經(jīng)洗板去除未參加抗原-抗體反應(yīng)的黃曲霉毒素M1，加入底物液，顏色變藍(lán)。再加入反應(yīng)終止液，反應(yīng)液顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)黃。在450 nm（OD450 nm）濾鏡及630 nm示差濾鏡下使用酶標(biāo)儀對(duì)微孔板進(jìn)行吸光度值測(cè)量。利用標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較判讀結(jié)果。

本文對(duì)生乳樣品進(jìn)行0.1 、0.2 、0.3 、0.4和0.5 μg/kg加標(biāo)，用膠體金快速檢測(cè)試紙條做平行檢測(cè)，查看檢測(cè)結(jié)果，以及試紙條在哪個(gè)殘留濃度會(huì)報(bào)陽(yáng)反應(yīng)，再用ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)各加標(biāo)樣進(jìn)行平行定量試驗(yàn)，查看檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性，驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，并計(jì)算結(jié)果的回收率與RSD值，驗(yàn)證其檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，比較2 種方法檢測(cè)結(jié)果的呼應(yīng)程度，驗(yàn)證兩法聯(lián)用模式是否可行。

3 試驗(yàn)步驟

3.1 黃曲霉毒素M1 膠體金快速檢測(cè)試紙條法檢測(cè)步驟

（1）取200 μL奶樣加入紅色試劑微孔中，抽吸5～10 次直至微孔試劑混合均勻；

（2）（40±2）℃溫育3 min；

（3）將試紙條插入紅色試劑微孔中；

（4）（40±2）℃溫育4 min；

（5）結(jié)果判讀見(jiàn)圖1，即陰性結(jié)果R＞1.1；弱陽(yáng)性結(jié)果0.9≤R≤1.1；陽(yáng)性結(jié)果R＜0.9；R值＝T/C。

圖1 儀器結(jié)果判讀示意圖

3.2 黃曲霉毒素M1 ELISA 檢測(cè)試劑盒使用方法

3.2.1 樣品前處理

（1）移液器吸取10 mL生乳到試管中，4 ℃靜置30 min；

（2）3 000 r/min加速度下將樣品離心10 min；

（3）離心樣品脂肪層下取0.4 mL去脂樣品，與0.1 mL 100%甲醇混合；

（4）準(zhǔn)備用于ELISA檢測(cè)。

3.2.2 檢測(cè)步驟

使用前，所有試劑及試劑盒內(nèi)材料需恢復(fù)至室溫。

（1）將適量標(biāo)記顏色的稀釋孔條放入微孔板架，使每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品對(duì)應(yīng)一個(gè)稀釋孔。

（2）將等量有抗體包被的微孔條放入微孔板架。

（3）按240 μL/孔或2 mL/條用量體積，從酶聯(lián)偶合物試劑瓶中量取所需試劑至試劑槽。使用8 道移液器移取200 μL酶聯(lián)偶合物至每個(gè)稀釋孔中。

（4）使用單道移液器，分別移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，至已裝200 μL酶聯(lián)偶合物的稀釋孔中，反復(fù)吹吸3 次以上混勻溶液，最后將吸頭中液體排空。每移取1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時(shí)，必須換上新吸頭。使用換有全新吸頭的8 道移液器，快速移取每個(gè)稀釋孔中液體各1 0 0 μ L，至相應(yīng)有抗體包被的微孔中。室溫下放置6 0 min。過(guò)程中不可搖動(dòng)微孔板，以免引起孔與孔之間液體污染。

（5）60 min后，將孔中液體甩入水槽，用稀釋后的沖洗緩沖液沖洗各孔，然后將微孔中的水甩入水槽中，重復(fù)5 次。沖洗后，將吸水紙巾放置在桌面上，使微孔板倒置扣擊紙面，盡可能將殘留水分排出。擦干微孔板底反面的水珠。

（6）按120 μL/孔或1 mL/條用量體積，從底物試劑瓶?jī)?nèi)量取所需底物液至試劑槽，使用8 道移液器移取100 μL底物至每個(gè)微孔中，避光室溫下放置20 min。

（7）20 min后，按照120 μL/孔或1 mL/條用量體積，從終止液試劑瓶?jī)?nèi)量取所需終止液至1 個(gè)試劑槽中，使用8 道移液器依序向每個(gè)微孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)。微孔顏色應(yīng)由藍(lán)變黃。

（8）用酶標(biāo)儀在450 nm濾鏡及示差濾鏡630 nm下讀取結(jié)果，記錄每個(gè)微孔的吸光度OD值。

（9）結(jié)果判讀：通過(guò)計(jì)算軟件快速得檢測(cè)結(jié)果，0 ng/kg標(biāo)準(zhǔn)品OD值需＞0.5，否則說(shuō)明試劑失效。使用軟件計(jì)算結(jié)果時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)品曲線的線性相關(guān)系數(shù)（R）需為-1.000～-0.990。

4 儀器預(yù)熱及校準(zhǔn)

4.1 儀器預(yù)熱

開(kāi)啟酶標(biāo)儀、金屬浴熱器、膠體金試劑條讀數(shù)儀，預(yù)熱30 min。

4.2 膠體金試劑條讀數(shù)儀校準(zhǔn)

讀取校準(zhǔn)紙條得讀數(shù)0.9 3 及0.9 5，符合0.90±0.10的儀器校準(zhǔn)要求，讀數(shù)儀性能正常。

5 結(jié)果與分析

5.1 膠體金快速檢測(cè)試紙條對(duì)不同濃度黃曲霉毒素M1 奶樣的檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，膠體金快速檢測(cè)試紙條在樣品加標(biāo)濃度為0.2 μg/kg時(shí)開(kāi)始報(bào)陽(yáng)，遠(yuǎn)低于GB/T2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中0.5 μg/kg的要求，具有較好的初篩價(jià)值。

表1 膠體金快速檢測(cè)試紙條對(duì)不同濃度黃曲霉毒素M1 奶樣的檢測(cè)結(jié)果

5.2 ELISA 檢測(cè)試劑盒對(duì)不同濃度黃曲霉毒素M1 奶樣的檢測(cè)結(jié)果

黃曲霉毒素M1ELISA檢測(cè)試劑盒標(biāo)樣曲線線性相關(guān)系數(shù)R=-0.997 0。標(biāo)準(zhǔn)品0 μg/kg的OD值讀數(shù)1.992，符合說(shuō)明書(shū)-1.000≤R≤-0.990范圍、標(biāo)準(zhǔn)品（0 μg/kg）吸光度值不低于0.5的檢測(cè)要求。具體曲線見(jiàn)圖2。該法檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性與穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表2，其檢測(cè)回收率在94.83%～100.53%之間，滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》中要求的60%～120%范圍，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度較高。RSD值在1.11%～3.01%之間，檢測(cè)結(jié)果的精密度較好。

表2 樣品重現(xiàn)性及回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

圖2 黃曲霉毒素M1 ELISA 檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)曲線結(jié)果（R ＝-0.997 0）

6 結(jié)論

本文采用ELISA檢測(cè)試劑盒法和膠體金快速檢測(cè)試紙條法對(duì)添加了不同濃度黃曲霉素M1的生乳樣品進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)。結(jié)果表明：膠體金快速檢測(cè)試紙條法對(duì)含有不同濃度黃曲霉毒素M1生乳樣品的測(cè)定結(jié)果呈現(xiàn)出一定梯度效應(yīng)，并在殘留量0.2 μg/kg時(shí)顯示R＜0.9陽(yáng)性結(jié)果，遠(yuǎn)低于GB/T 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中要求0.5 μg/kg水平，有較好的重現(xiàn)性。其操作方便，檢測(cè)所需設(shè)備投入少，能耗低，耗時(shí)短（7 min），具有較好定性初篩檢測(cè)價(jià)值。

黃曲霉毒素M1ELISA檢測(cè)試劑盒在比對(duì)試驗(yàn)中，能與膠體金快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)結(jié)果呼應(yīng)，且結(jié)果的重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度和精密度高，具有較好定量檢測(cè)價(jià)值。

本文討論的2 種黃曲霉毒素M1檢測(cè)法操作方便快捷，耗時(shí)短，結(jié)果有一定的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性。使用膠體金快速檢測(cè)試紙條對(duì)生乳中黃曲霉毒素M1殘留量定性初篩，發(fā)現(xiàn)試紙條結(jié)果報(bào)陽(yáng)時(shí)，再利用ELISA檢測(cè)試劑盒定量試驗(yàn)的聯(lián)合檢測(cè)模式，對(duì)乳品企業(yè)進(jìn)行生乳中黃曲霉毒素M1殘留量的快速篩查，有一定基礎(chǔ)參考價(jià)值。