劉恒洋，尹玉鑫，郭曉徐，宋紹奇，劉美玉

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2.邯鄲市天然產(chǎn)物與功能性食品開發(fā)重點室驗室，河北邯鄲 056038）

0 引言

隨著人們生活水平的提高，禽蛋產(chǎn)品在世界范圍內(nèi)的消費量也不斷增多，大量廢棄蛋殼隨之產(chǎn)出，從而造成了極大的環(huán)境污染和資源浪費[1]，事實上，蛋殼中含有大量可利用資源，其中含有的鈣類物質(zhì)、活性肽、蛋白質(zhì)等成分，具有很高的利用價值[2]。近年來，對于廢棄雞蛋殼的研究逐漸加深，人們逐漸重視對此資源的開發(fā)與利用[3]，此項研究的開展不但能改善日益嚴(yán)重的環(huán)境問題，而且變廢為寶，提高了雞蛋的附加值，推動了雞蛋殼深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，可謂一舉兩得。

硫酸軟骨素呈白色粉末，無臭、有引濕性、遇水有粘黏性，廣泛存在于動物組織、細(xì)胞表面與細(xì)胞基質(zhì)之間[4]。硫酸軟骨素的用途廣泛，可作為膳食保護(hù)劑，起到保護(hù)關(guān)節(jié)等軟骨組織的效果，可以很好地緩解關(guān)節(jié)不適等癥狀，治療骨關(guān)節(jié)炎等疾病。同時，硫酸軟骨素具有抗凝血、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等功能，因此硫酸軟骨素被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化妝品等行業(yè)中。近年來，對于硫酸軟骨素的需求量不斷增加[5-7]，以硫酸軟骨素作為研究對象的產(chǎn)品市場前景廣闊。

目前，我國硫酸軟骨素主要提取工藝為從動物軟骨組織中進(jìn)行提取，通過高溫蒸煮的辦法，使動物結(jié)締組織破壞，通過堿解法或酶解法從中進(jìn)行硫酸軟骨素的提取，也可以通過微生物發(fā)酵進(jìn)行硫酸軟骨素的提取。除此之外，硫酸軟骨素也可以從蛋殼膜中進(jìn)行提取，相比與從動物軟骨組織中提取，蛋殼膜中提取硫酸軟骨素不僅可以有效地利用我國的蛋殼資源，達(dá)到真正意義上的廢物利用，蛋殼膜獲取方式簡單，且原材料產(chǎn)量極大，也能直接增加硫酸軟骨素的產(chǎn)量。目前，從蛋殼中提取硫酸軟骨素的方法很多，常見的方法有堿提取法、堿酶法、堿鹽法。這些工藝提取的硫酸軟骨素，在提取率上相差不大。劉濤等人[8]通過堿鹽法從蛋殼膜中提取硫酸軟骨素，提取率為74%。劉寧等人[9]通過酶提取法硫酸軟骨素，利用木瓜蛋白酶水解蛋殼質(zhì)的性質(zhì)，將硫酸軟骨素從糖蛋白中分離出來，從而進(jìn)行硫酸軟骨素的提取，該工藝的提取率為75.31%，略高于堿鹽法提取率。劉國慶等人[10]利用稀堿法處理蛋殼膜，并通過雙酶法進(jìn)行提取，采用胰蛋白酶和胃蛋白酶相結(jié)合的提取工藝，該工藝下硫酸軟骨素的提取率為76%。對比其他提取工藝，堿鹽法提取硫酸軟骨素工藝相對簡單，且提取率并不低，與酶法提取硫酸軟骨素相比，在提取成本上要大大減少，較適合批量生產(chǎn)使用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋殼，收集于河北省邯鄲市美食林工業(yè)園；氯化鈉、氯化鈣、鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖標(biāo)品、碳酸鈣、無水碳酸鈉等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；80 目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩，浙江上虞市道墟張興紗篩廠產(chǎn)品；搖擺式中藥粉碎機(jī)，新昌縣德科機(jī)械有限公司產(chǎn)品；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博珍儀器設(shè)備制造廠產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)，廣東佛衡儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 硫酸軟骨素提取率測定方法

（1） 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。用電子天平準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg，將稱取好的葡萄糖加入到的蒸餾水中，裝入到500 mL 的容量瓶中，用膠頭滴管滴至刻度線，定容搖勻好備用。采用移液槍分別吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液至試管中，并用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL。依次加入苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL。另做一個2 mL 的蒸餾水重復(fù)上述顯色操作做空白對照試驗；將上述制得結(jié)束試管進(jìn)行搖勻，靜置30 min后，放入紫外分光光度儀中，于波長490 nm 處測得吸光度。以多糖質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2） 硫酸軟骨素含量測定。采用移液槍定量吸取250 μL 待測液體，用蒸餾水補(bǔ)至2 mL，加入1 mL 的苯酚及5 mL 的濃硫酸，并進(jìn)行充分搖勻，將其靜置30 min，移至紫外分光光度儀中，于波長490 nm 處測其吸光度，將所測得的吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，通過換算便可得到硫酸軟骨素的含量。

（3） 硫酸軟骨素提取率的計算。

式中：W——硫酸軟骨素的提取率，%；

C——將待測樣品代入吸光值中測得的多糖含量，g；

V1——定容液體的體積，mL；

V2——測量時所取液體的體積，mL；

M——蛋殼膜中總糖含量，g。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

定量稱取1 g 蛋殼膜（精確到0.01 g）。在多組預(yù)試驗的基礎(chǔ)上選取料液比、提取溫度、堿鹽比、提取時間4 個因素進(jìn)行單因素試驗。探究不同因素對蛋殼膜中硫酸軟骨素提取率的影響。先設(shè)置料液比為1∶13，反應(yīng)溫度為50 ℃，堿鹽比為3∶1，反應(yīng)時間為5 h 作為每個因素除自身外的固定值，再設(shè)計料液比、反應(yīng)溫度、堿鹽比和反應(yīng)時間。

單因素與水平設(shè)計見表1。

表1 單因素與水平設(shè)計

1.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗，將料液比、反應(yīng)溫度、堿液濃度、反應(yīng)時間4 個影響因素較大的因子，利用響應(yīng)面試驗優(yōu)化從蛋殼膜中提取透明質(zhì)酸的最佳工藝參數(shù)，以透明質(zhì)酸的提取量作為參考指標(biāo)進(jìn)行分析。

響應(yīng)面分析因子水平編碼見表2。

表2 響應(yīng)面分析因子水平編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同料液比對硫酸軟骨素脫鈣率的影響

暫定堿鹽比為3∶1，提取溫度為50 ℃，提取時間為6 h，探究不同料液比對硫酸軟骨素提取率的影響。

料液比對硫酸軟骨素提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對硫酸軟骨素提取率的影響

由圖1 可知，在料液比為1∶13～1∶15 時，隨著料液比的上漲，硫酸軟骨素的提取率也在不斷升高；在料液比為1∶15 時，硫酸軟骨素的提取率達(dá)到最高點，此時的提取率為46%，因為隨著料液比的增加，蛋殼膜中的水分也不斷增多，堿試劑與鹽試劑對蛋殼膜的接觸面積增大，從而加速了硫酸軟骨素的提??；料液比為大于1∶15，硫酸軟骨素的提取率趨勢趨于平緩，并無顯著的提升，分析其原因，1∶15 的料液比基本可使蛋殼膜中的硫酸軟骨素的提取進(jìn)行反應(yīng)完全，因此料液比為1∶15 之后，再次提高料液比對硫酸軟骨素的提取率影響不大。綜合考慮，選擇最佳料液比為1∶15 即可滿足試驗需要。

2.1.2 不同提取溫度對硫酸軟骨素提取率的影響

固定料液為1∶15，暫定堿鹽比為3∶1，提取時間為6 h，探究不同提取溫度對硫酸軟骨素提取率的影響。

提取溫度對硫酸軟骨素提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對硫酸軟骨素提取率的影響

由圖2 可知，隨著提取溫度從30 ℃升高到60 ℃，硫酸軟骨素的提取率也隨著溫度的升高而增長，在提取溫度為60 ℃時，此時硫酸軟骨素的提取率達(dá)到最高，為46.5%。因為隨著溫度的提升，溶液中的反應(yīng)速率也在加快；提取溫度為60 ℃為最佳反應(yīng)溫度，此時硫酸軟骨素的提取率最高；提取溫度60 ℃之后，再次升高溫度，硫酸軟骨素的提取率趨于平緩，并略有降低態(tài)勢。這是由于過高的提取溫度可能會導(dǎo)致蛋殼膜的性質(zhì)發(fā)生變化，從而不利于硫酸軟骨素的提取。綜合考慮，選擇提取溫度為60 ℃作為蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的最佳溫度。

2.1.3 不同堿鹽比對硫酸軟骨素提取率的影響

固定料液比為1∶15，提取溫度為60 ℃，暫定反應(yīng)時間為6 h，探究不同堿鹽比對硫酸軟骨素提取率的影響。

堿鹽比對硫酸軟骨素提取率的影響見圖3。

圖3 堿鹽比對硫酸軟骨素提取率的影響

由圖3 可知，隨著堿鹽比的升高，硫酸軟骨素的提取率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。堿鹽比從4∶1增加到6：1，硫酸軟骨素的提取率逐漸升高，在堿鹽比為6∶1 時硫酸軟骨素提取率達(dá)到最高值為53.5%，因為適當(dāng)?shù)奶岣邏A濃度會促進(jìn)堿解的迅速進(jìn)行，加速硫酸軟骨素的提??；當(dāng)堿鹽比達(dá)到7∶1后，硫酸軟骨素的提取率升高不顯著，且有降低的趨勢，過高的堿鹽比的加入，會對蛋殼膜造成一定程度的破壞，導(dǎo)致蛋殼膜的性質(zhì)發(fā)生變化，從而影響硫酸軟骨素的提取。綜合考慮，選擇堿鹽比6∶1為最佳堿鹽比。

2.1.4 不同提取時間對硫酸軟骨素提取率的影響

固定料液比為1∶15，提取溫度60 ℃，堿鹽比為6∶1，探究不同提取時間對硫酸軟骨素提取率的影響。

提取時間對硫酸軟骨素提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對硫酸軟骨素提取率的影響

由圖4 可知，隨著提取時間的增加，硫酸軟骨素的提取率呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢，提取時間從2 h 延長到8 h 的階段，硫酸軟骨素的提取率顯著提高，在提取時間為8 h 時，此時的提取率基本達(dá)到最高，為56.5%。分析其原因，適當(dāng)延長提取時間會使蛋殼膜中的硫酸軟骨素堿解更為完全，因此硫酸軟骨素的含量也是顯著提升，8 h 基本上可以使其完全提取，此時延長反應(yīng)時間對硫酸軟骨素的提取率影響不大，且過長的提取時間有可能會造成微生物的污染，且造成試驗時間的浪費。綜合考慮，確定提取時間為8 h 為硫酸軟骨素的最佳提取時間。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 10.0.8 響應(yīng)面軟件設(shè)計Box-behnken 試驗，測定硫酸軟骨素提取率（Y）。

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，選取料液比（A），提取溫度（B），堿鹽比（C），提取時間（D） 作為響應(yīng)因素，篩選蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的最佳工藝條件，利用響應(yīng)面法對其進(jìn)行優(yōu)化試驗，采用Design Expert 10 設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗。試驗結(jié)果對蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，結(jié)果表明各因素與響應(yīng)面的二次多項回歸模型為：

根據(jù)p 值大小進(jìn)行判斷是否顯著，當(dāng)p＜0.05 為顯著，p＜0.01 為極顯著。

響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析見表4。

表4 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析

由表4 可知，蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的提取率為響應(yīng)值時，該模型p＜0.01，表示該二次項方程為極顯著；失擬項p=0.145 4＞0.05，模型失擬項不顯著，失擬項不顯著表示該二次項模型擬合較好，模型決定系數(shù)R2為0.984 3，表示該二次項模型可以解釋98.43%的試驗數(shù)據(jù)，試驗擬合較好，且誤差較小，R2Adj為0.968 6，兩者數(shù)值較高，且較為接近，表明模型有較好的使用性和通用性，該模型可以很好地反映響應(yīng)值硫酸軟骨素提取量的變化，可采用該模型對蛋殼膜膜中提取硫酸骨素進(jìn)行實際分析；通過變異（CV） 可以反映出模型的可信度，變異系數(shù)的值越低，表示模型的可信度越高，該試驗的變異系數(shù)為1.58%，表示該模型較為可信。各因素對蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的影響由高到低分別是A＞D＞C＞B，即料液比＞提取時間＞堿鹽比＞提取溫度。

各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線圖見圖5。

由圖5 響應(yīng)面3D 圖可直觀描述回歸模型，等高線圖形越趨近與圓形表示2 個自變量的交互作用越弱，等高線越趨近與橢圓形表示2 個變量的交互作用越強(qiáng)。各個因素之間的交互作用對蛋殼膜中提取硫酸軟骨素影響強(qiáng)弱排序為AC＞CD＞BC＞AB＞BD＞AD，即料液比與堿鹽比之間的交互作用＞堿鹽比與提取時間之間的交互作用＞提取溫度與堿鹽比之間的交互作用＞料液比與提取溫度之間的交互作用＞提取溫度與提取時間之間的交互作用＞料液比與提取時間之間的交互作用。相對而言，試驗中料液比（A） 與堿鹽比（C） 交互作用曲面最為陡峭，表明在提取硫酸軟骨素試驗中，料液比的增加對堿鹽比的影響顯著（p＜0.01）。AC 的交互作用達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），CD 的交互影響達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。

由回歸模型預(yù)測和分析得出蛋殼膜中提取硫酸軟骨素最佳工藝為料液比1∶15.408，提取溫度59.476 ℃，堿鹽比6.014∶1，提取時間8.146 h，此時的硫酸軟骨素的提取率可達(dá)76.67%。

2.3 驗證試驗

考慮到實際情況，粗蛋殼膜為1 g 時，選取料液比為1∶15.5，提取溫度為60 ℃，堿鹽比為6∶1，提取時間為8 h，在此條件下，硫酸軟骨素的提取率可達(dá)76.5%，理論值與實際值相差不大，擬合較好，相對誤差＜0.5%，該驗證試驗結(jié)果表明采用此響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)真實可信。

3 結(jié)論

以蛋殼膜為原材料，采用堿鹽法進(jìn)行提取蛋殼膜中的硫酸軟骨素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗，優(yōu)化提取硫酸軟骨素的工藝參數(shù)，以硫酸軟骨素的提取量作為指標(biāo)，以苯酚硫酸法作為檢測方法，從而得到蛋殼膜中提取硫酸軟骨素的最佳工藝為蛋殼膜1 g，料液比1∶15.5，提取溫度60 ℃，堿鹽比6∶1，提取時間8 h，在最佳工藝的條件下提取硫酸軟骨素，提取率可達(dá)76.5%。該試驗為蛋殼膜的綜合利用提供了有效參考，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了試驗數(shù)據(jù)。