黃中強 代 娣 侯鐵英 林發(fā)全 盧志明 劉小琦 沈敏娜 吳 潔 張平安 周 軍0 肖艷群 王華梁

（1.上海市臨床檢驗中心 上海市實驗醫(yī)學研究院，上海 200126；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧 沈陽 110001；3.廣東省人民醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510030；4.廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣西 南寧 530021；5.山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院臨床醫(yī)學檢驗部，山東 濟南 250021；6.四川省人民醫(yī)院醫(yī)學遺傳中心，四川 成都 610031；7.復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032；8.北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100140；9.武漢大學人民醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430060；10.海軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院檢驗科，上海 201805）

微小RNA（microRNA，miRNA）是穩(wěn)定存在于血漿中的內源性非編碼單鏈小RNA，可調控細胞增殖、分化和凋亡等生物學功能，其表達異常與惡性腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[1-2]。有研究結果顯示，循環(huán)游離miRNA在肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）癌前和腫瘤負荷極低狀態(tài)等早期階段即可表達異常，但單一的miRNA檢測不足以為腫瘤的早期診斷提供證據，因此針對多個miRNA的高靈敏和高特異性的檢測，對了解miRNA的生物學功能、腫瘤的早期診斷和發(fā)現新的藥物靶點具有重要意義[3-4]。2011年，7種miRNA特定數學模型被建立[5]，使多個miRNA的組合檢測在輔助判斷肝癌疾病進程和治療效果方面起到了至關重要的作用，在《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》[6]中，miRNA首次被提出作為肝癌的新型分子標志物，特別是對于血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）陰性人群。當前，多個miRNA的檢測通?；趯崟r熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術[7-8]，該方法操作相對簡單，分析便捷，且檢測成本較低，同時具有較高的靈敏度和特異性。2017年，國產某品牌基于PCR技術的“7種微小核糖核酸（miRNA）檢測試劑盒”獲得國家藥品監(jiān)督管理局三類醫(yī)療器械注冊證，可用于檢測7種miRNA（miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-122、miR-192、miR-223和miR-801），被廣泛應用于臨床。為了全面、客觀地評價該試劑盒的檢測性能，本研究采用多中心性能評估模式評價該試劑盒性能。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取我國不同地區(qū)的10家檢測中心，分別為上海市臨床檢驗中心、中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科、廣東省人民醫(yī)院檢驗科、廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科、山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院臨床醫(yī)學檢驗部、四川省人民醫(yī)院醫(yī)學遺傳中心、復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科、北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科、武漢大學人民醫(yī)院檢驗科、海軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院檢驗科，在2021年9月13日—9月17日使用同一批樣本，對同一批號試劑進行性能評估，評估參數包括精密度、符合率、檢出限和抗干擾能力。10家檢測中心分別以A、B、C、D、E、F、G、H、I、J編號，各檢測中心環(huán)境溫度為19 ℃～25 ℃，濕度為38%～70%。

1.2 試劑與儀器

駿實生物科技（上海）有限公司“7種微小核糖核酸（miRNA）檢測試劑盒”（PCR熒光探針法，批號21071555），試劑盒內包含核酸提取試劑和核酸擴增試劑。10家檢測中心所用的檢測儀器包括：ABI 7500熒光定量PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司）、ABI QuantStudio 5熒光定量PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司）、Roche Z480Ⅱ熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）。

用于精密度評估的陰性和陽性樣本均為美國Integrated DNA Technologies公司合成的寡核苷酸對照參考品，共10套樣本，每套含陰性樣本和陽性樣本各3支，每支5.00 mL。收集2021年1—3月復旦大學附屬中山醫(yī)院HCC患者臨床血漿樣本10份，作為用于符合率評估的陽性樣本；收集健康人群血漿樣本10份，作為陰性樣本。每份樣本分裝為10支，共200支樣本，分裝為10套，每套含陰性樣本和陽性樣本各10支，每支500 μL。用于檢出限評估的樣本為Integrated DNA Technologies公司合成的1份寡核苷酸標準參考品，濃度為5×105拷貝/μL，使用超純水梯度稀釋至50拷貝/μL并分裝為10套，每套1支，每支5.00 mL。用于抗干擾能力評估的干擾物分別為血紅蛋白、膽紅素和甘油三酯。血紅蛋白購自德國Sigma-Aldrich公司（批號SLCJ0443），膽紅素購自美國Frontier Scientific公司（批號JH21-14583），三酰甘油購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司（批號F17060801）?？垢蓴_能力評估的樣本為1份弱陽性臨床混合血漿樣本，由駿實生物科技（上海）有限公司提供，樣本分裝為10套，每套1支，每支3.00 mL。以上評估所需的樣本和干擾物均-20 ℃冷鏈保存，24 h內運送至10家檢測中心。

1.3 方法

采用手工磁珠法提取核酸，所有評估實驗所需的核酸均重新提取。采用“7種微小核糖核酸（miRNA）檢測試劑盒”檢測miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-122、miR-192、miR-223和miR-801的相對表達量，以miR-1228為內參。循環(huán)擴增反應條件：42 ℃逆轉錄60 min→85 ℃預變性5 min→95 ℃變性15 s→60 ℃退火/延伸60 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算各miRNA的相對表達量。

1.3.1 精密度

參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A2[9]文件計算精密度。批內精密度：對1個陰性和1個弱陽性樣本各重復檢測10次；批間精密度：對1個陰性和1個弱陽性樣本每天各重復檢測3次，連續(xù)檢測5 d。根據檢測結果計算不同miRNA循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）的變異系數（coefficient of variation，CV），用于評估精密度。

1.3.2 符合率

參考CNAS GL039-2019文件[10]中符合率的驗證方法，對10例HCC患者和10名健康者的臨床血漿樣本進行檢測，比較檢測結果與靶值，并計算總符合率。

1.3.3 檢出限

參考CLSI EP 17-A文件[11]中檢出限的評估方法，對標準參考品（50拷貝/μL）在不同檢測批次中進行20次重復檢測，根據檢測結果計算檢出率。

1.3.4 抗干擾能力

參考CNAS GL039-2019文件[10]中的抗干擾能力驗證方法和《WS/T 416—2013 干擾實驗指南》[12]，結合試劑盒說明書中的性能指標，以在弱陽性樣本中加入干擾物質溶液（血紅蛋白、膽紅素、三酰甘油）為實驗組，使干擾物的最終濃度分別為血紅蛋白200 g/L、膽紅素1 000 μmol/L和三酰甘油100 mmol/L；以加入等量的0.9%NaCl溶液為對照組。各組重復檢測3次，比較實驗組和對照組檢測結果的差異。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Excel 2016軟件進行統(tǒng)計分析。計算計量資料的均值和CV，計數資料以率表示。采用Logistic回歸分析評價各miRNA聯合檢測的診斷效能。試劑說明書中的計算公式為：Logit=-1.944 9+0.106 33×dCt miR21+0.102 19×dCt miR26a-0.0124 41×dCt miR27a-0.289 02×dC tmiR122-0.327 79×dCt miR192+0.258 55×dCt miR223-0.029 515×dCt miR801。根據試劑說明書要求，當樣本Logit≥-0.5時，判定為該樣本檢測結果為陽性。

2 結果

2.1 精密度

2.1.1 批內精密度

10家檢測中心對1個陰性和1個弱陽性樣本各重復檢測10次，均能全部檢出；10家檢測中心檢測8個miRNA的Ct值的CV均＜5.00%，其中最大值為4.79%，最小值為0.20%。見表1。

表1 批內精密度（CV）評估結果 %

2.1.2 批間精密度

10家檢測中心對1個陰性和1個弱陽性樣本每天各重復檢測3次，連續(xù)檢測5 d，均能全部檢出；10家檢測中心檢測8個miRNA的Ct值的CV均＜6.50%，其中最大值為6.38%，最小值為0.45%。見表2。

表2 批間精密度（CV）評估結果 %

2.2 符合率

10家檢測中心檢測10例HCC患者和10名健康者臨床血漿樣本的總符合率均為100.00%（20/20）。見表3。

表3 10家檢測中心Logit值結果

2.3 檢出限

10家檢測中心對50拷貝/μL標準參考品進行20次重復檢測，檢出率均為100.00%（20/20）。見表4。

表4 10家檢測中心檢出限樣本的Logit值結果

2.4 抗干擾能力

10家檢測中心對3個實驗組樣本的檢測結果均為陽性，與對照組檢測結果一致。進一步對Logit值進行分析，并計算實驗組與對照組的相對偏差，結果顯示，10家檢測中心的相對偏差均＜20.00%，其中檢測中心E檢測100 mmol/L三酰甘油干擾樣本的偏差最大，為19.93%。見表5。

表5 10家檢測中心抗干擾能力評估結果

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率高，患者5年整體生存率僅為14.1%，約70%的肝癌患者就診時已處于中晚期，因此肝癌的早期診斷和治療是提升肝癌患者存活率的關鍵[13-14]。

近年來，循環(huán)游離miRNA作為新型的肝癌基因檢測分子標志物，其組合檢測對于輔助肝癌早期診斷具有較高價值，如采用7種血漿miRNA聯合檢測可準確地診斷早期肝癌，敏感性較傳統(tǒng)肝癌標志物AFP提高約30%，對于血清AFP陰性人群也可準確診斷（敏感性為77.7%，特異性為84.5%）[5]。由于檢測結果會受到檢測系統(tǒng)、人員能力、實驗室環(huán)境等因素的影響，單一實驗室對試劑檢測性能的評價具有一定局限性，本研究采用多中心性能評估模式，選取10家檢測中心，實驗室環(huán)境、檢測系統(tǒng)和檢測人員均不相同，可代表我國臨床PCR實驗室的檢測能力。但10家檢測中心所用的擴增儀均為國外進口，缺乏國產主流品牌，因此在后續(xù)的評價中將加以完善。

精密度作為評估檢測系統(tǒng)的主要性能指標之一，可反映實驗室檢測系統(tǒng)的重復性，尤其是檢測人員的規(guī)范化操作水平。本研究精密度評估結果顯示，評估的試劑盒8個miRNA對應Ct值的批內CV＜5.00%，批間CV＜6.50%，均能達到試劑盒說明書中廠家聲明的指標，說明該試劑盒的檢測重復性較好；但10家檢測中心的CV范圍較寬（批內CV為0.22%～4.42%，批間CV為0.45%～6.38%），說明不同實驗室之間精密度差異較大。

本研究參考CNAS GL039-2019文件[10]的性能驗證方法，選取臨床確診肺癌患者和健康對照者的血漿樣本用于符合率評估，10家檢測中心的總符合率均為100.00%。檢出限是指能可靠檢出分析物的最低實際濃度，是體現檢測系統(tǒng)靈敏度的主要指標之一，CLSI EP17-A文件[11]指出，檢出限測定需在不同日期和不同批次內對樣本進行檢測，檢測數據不少于20個，由于目前缺乏miRNA相關的定值標準物質，本研究選用人工合成的寡核苷酸標準參考品作為檢出限評估樣本；結果顯示，10家檢測中心的檢出率均為100.00%（20/20），與廠家聲明的指標相符。在臨床檢驗過程中，檢測結果經常會受到異常樣本的影響，本研究評估了肝癌患者常見的溶血、脂血和黃疸樣本對miRNA檢測結果是否存在影響，結果顯示，含干擾物的樣本均能正常檢出，且與對照樣本的相對偏差＜20.00%，表明血紅蛋白200 g/L、膽紅素1 000 μmol/L和三酰甘油100 mmol/L對檢測無明顯影響。

綜上所述，7種miRNA檢測試劑的精密度、符合率、檢出限和抗干擾能力表現良好，可滿足不同地區(qū)、不同實驗室和不同檢測系統(tǒng)的使用需求和預期用途。但在臨床應用中，因檢測過程以手工法為主，應特別注意規(guī)范檢測人員操作，以降低隨機誤差對檢測結果的影響，在規(guī)范的質量管理體系下保證檢測結果的準確性和可靠性。

致謝：感謝武漢大學人民醫(yī)院、北京協(xié)和醫(yī)院、四川省人民醫(yī)院、復旦大學附屬中山醫(yī)院、中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、海軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院、廣東省人民醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院的配合和協(xié)助，感謝所有作者在實驗和數據處理等方面作出的支持和幫助。