薛亞澤 何 勁 唐紹軍

（義烏復(fù)元私立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 金華 322000）

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是腦組織血液供應(yīng)不足引起的局部缺血和缺氧所導(dǎo)致的一系列神經(jīng)功能障礙癥狀，其致殘和致死率較高[1]。目前，ACI常用的診斷方法為電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI），但對(duì)于早期有缺血病灶和體內(nèi)有金屬支架的患者存在一定的局限性，因此有必要尋找更有效的檢測(cè)指標(biāo)。另外，ACI的病情復(fù)雜多變，臨床亟需可有效監(jiān)測(cè)病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）可通過(guò)結(jié)合mRNA的3'-非翻譯區(qū)來(lái)參與調(diào)控靶基因的表達(dá)，其在血清等體液中以穩(wěn)定形式存在，因此可通過(guò)檢測(cè)其表達(dá)來(lái)評(píng)估機(jī)體的生理病理狀態(tài)。有研究結(jié)果顯示，老年急性缺血性腦卒中患者血清miR-150-5p水平異常降低，且與神經(jīng)功能缺損程度有關(guān)[3-4]。潛伏轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（latent transforming growth factor-beta binding protein，LTBP）2作為L(zhǎng)TBP家族成員之一，在機(jī)體動(dòng)脈損傷、彈性纖維凝聚和細(xì)胞黏附中具有重要作用。有研究結(jié)果顯示，冠心病患者血清LTBP2水平顯著升高，可能參與了冠心病的發(fā)生[5]。冠心病具有和ACI相似的發(fā)病機(jī)制，均是由血流受阻造成細(xì)胞缺血、缺氧，最終導(dǎo)致組織器官壞死。LTBP2與ACI發(fā)生的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬探討ACI患者血清miR-150-5p和LTBP2水平與ACI病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，以期為ACI的臨床監(jiān)測(cè)提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年5月—2021年2月義烏復(fù)元私立醫(yī)院確診的ACI患者121例（ACI組），其中男67例、女54例，年齡（62.01±7.36）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合ACI臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；2）經(jīng)CT或MRI確診；3）初次發(fā)病。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）有惡性腫瘤史；2）合并意識(shí)障礙；3）近期進(jìn)行過(guò)手術(shù)或有創(chuàng)傷史。根據(jù)ACI患者發(fā)病48～72 h內(nèi)的腦梗死體積，分為小梗死（梗死體積≤4 cm3）組（38例）、中梗死（梗死體積為＞4～≤10 cm3）組（43例）、大梗死（梗死體積＞10 cm3）組（40例）；采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（the National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）[7]評(píng)估ACI患者神經(jīng)功能缺損程度，將ACI患者分為輕度（NIHSS評(píng)分＜5分）組（40例）、中度（NIHSS評(píng)分5～20分）組（42例）、重度（NIHSS評(píng)分＞20分）組（39例）。選取同期義烏復(fù)元私立醫(yī)院體檢健康者128名（正常對(duì)照組），其中男70名、女58名，年齡（60.27±8.49）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)基礎(chǔ)疾病，體格檢查和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提示身體健康。2個(gè)組之間年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)義烏復(fù)元私立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021042912），所有研究對(duì)象及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)638314）購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司。熒光定量PCR試劑盒（貨號(hào)T427S/L）購(gòu)自廣州英贊生物科技有限公司。總RNA提取試劑盒（貨號(hào)AR1200-50T）購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司。Lepgen-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自北京樂(lè)普診斷科股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 一般資料收集和樣本采集

收集所有研究對(duì)象的一般資料，包括年齡、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、飲酒史、吸煙史、高血壓史。采集ACI患者入院6 h內(nèi)和正常對(duì)照組體檢當(dāng)日清晨空腹靜脈血5 mL，1 007×g離心15 min，分離血清，-80 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 血清miR-150-5p及LTBP-2 mRNA檢測(cè)

采用總RNA提取試劑盒提取血清樣本中的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。引物由深圳華大基因公司設(shè)計(jì)、合成，引物序列見(jiàn)表1。分別以U6和β-actin作為miR-150-5p和LTBP-2的內(nèi)參。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性15 s，65 ℃退火延伸45 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：cDNA（50 ng/μL）2 μL，SYBR Green Master Mix（2×）10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，加ddH2O至20 μL。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.3 Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)

采用Targetscan在線軟件（http：//www.targetscan.org/vert_72/）預(yù)測(cè)miR-150-5p與LTBP-2之間的結(jié)合位點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估ACI患者miR-150-5p與LTBP-2的相關(guān)性。采用Logistic回歸分析評(píng)估ACI發(fā)生的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACI組與正常對(duì)照組一般資料比較

ACI 組與正常對(duì)照組BMI、飲酒史、吸煙史、高血壓史差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 ACI組與正常對(duì)照組一般資料比較

2.2 ACI組與正常對(duì)照組血清miR-150-5p和LTBP-2相對(duì)表達(dá)量比較

與正常對(duì)照組比較，ACI組血清miR-150-5p相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.001），LTBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.001）。見(jiàn)表3。

表3 ACI組與正常對(duì)照組血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 不同梗死體積ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

小梗死組、中梗死組和大梗死組血清miR-150-5p相對(duì)表達(dá)量依次降低（P＜0.001），LTBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量依次升高（P＜0.001）。見(jiàn)表4。

表4 不同梗死體積ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 不同NIHSS評(píng)分ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

輕度組、中度組和重度組血清miR-150-5p相對(duì)表達(dá)量依次降低（P＜0.001），LTBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量依次升高（P＜0.001）。見(jiàn)表5。

表5 不同NIHSS評(píng)分ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 ACI患者血清miR-150-5p與LTBP-2的相關(guān)性

Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：miR-150-5p和LTBP-2之間存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。LTBP-2是miR-150-5p潛在的靶基因。

圖1 miR-150-5p與LTBP-2的結(jié)合位點(diǎn)

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，ACI組血清miR-150-5p表達(dá)與LTBP-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.346，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 ACI患者血清miR-150-5p與LTBP-2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.6 ACI發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

將是否發(fā)生ACI作為因變量（未發(fā)生=0，發(fā)生=1），miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量作為自變量（賦值均為實(shí)測(cè)值）。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-150-5p表達(dá)降低、LTBP-2 mRNA表達(dá)升高是ACI發(fā)生的危險(xiǎn)因素[比值比（odds ratio，OR）值分別為0.563、1.698，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為0.445～0.712、1.342～2.148]。見(jiàn)表6。

表6 ACI發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，促進(jìn)血管生成有助于恢復(fù)血液供應(yīng)，促進(jìn)大腦恢復(fù)，改善小鼠腦缺血情況[8-9]。miR-150-5p是一個(gè)相對(duì)保守的miRNA，在調(diào)節(jié)血管生成中具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，中風(fēng)模型大鼠腦組織和血清中miR-150相對(duì)表達(dá)量異常降低[10]。大鼠骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞可分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞，并分泌多種促血管生成因子，以此促進(jìn)缺血組織中血管新生，miR-150過(guò)表達(dá)可提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的成管能力，除此之外，內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移至深靜脈血栓中還可促進(jìn)血栓再通，而miR-150高表達(dá)能顯著提高細(xì)胞的遷移能力[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者外周血miR-150-5p相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.001），與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，ACI組血清miR-150-5p相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.001），且隨梗死體積和NIHSS評(píng)分的增加而降低（P＜0.001），表明miR-150-5p參與了ACI的發(fā)生，并隨疾病嚴(yán)重程度增加而顯著降低，有作為ACI監(jiān)測(cè)指標(biāo)的潛能，連續(xù)監(jiān)測(cè)或可用于判斷疾病進(jìn)展程度。

LTBP-2作為細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，在心臟、大腦中均有表達(dá)，其在血管內(nèi)皮損傷和彈性纖維凝聚等方面具有重要作用[13]。冠心病患者血清LTBP-2相對(duì)表達(dá)量隨疾病嚴(yán)重程度加重而升高[14-15]。冠心病和ACI作為心腦血管疾病中的兩大主要疾病，均是由細(xì)胞缺血、缺氧造成組織壞死所導(dǎo)致的，因此本研究檢測(cè)了ACI患者血清LTBP-2的表達(dá)情況。本研究結(jié)果顯示，相較于正常對(duì)照組，ACI組血清LTBP-2相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.001），并隨梗死體積和NIHSS評(píng)分的增加而升高（P＜0.001）。表明LTBP-2同樣參與了ACI的發(fā)生、發(fā)展，其相對(duì)表達(dá)量與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，這為ACI的發(fā)生和治療的機(jī)制研究提供了一個(gè)新的研究方向。

本研究通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LTBP-2是miR-150-5p潛在的靶基因，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.346，P＜0.001）。提示miR-150-5p與LTBP-2可能共同參與了ACI的發(fā)生。因此，miR-150-5p參與ACI的發(fā)生可能與調(diào)控LTBP-2表達(dá)有關(guān)。本研究多因素Logisitc回歸分析結(jié)果顯示，miR-150-5p低表達(dá)和LTBP-2高表達(dá)均是ACI發(fā)生的危險(xiǎn)因素（OR值分別為0.563、1.698，95%CI分別為0.445～0.712、1.342～2.148）。提示miR-150-5p和LTBP-2與ACI的發(fā)生密切相關(guān)，因此，miR-150-5p和LTBP-2或可作為ACI臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，ACI患者血清miR-150-5p呈低表達(dá)，LTBP-2呈高表達(dá)，二者與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，或可作為ACI病情監(jiān)測(cè)的參考指標(biāo)。本研究為尋找ACI臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)提供了一個(gè)新的方向，但還需對(duì)ACI患者進(jìn)行隨訪，觀察患者預(yù)后和轉(zhuǎn)歸情況，以期為ACI患者的預(yù)后評(píng)估提供更全面的參考。