■ 劉堯君 雷 劍 趙小剛 譙仕彥 卞國志*

（1.廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心，廣東廣州 511400；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193；3.清遠(yuǎn)海貝生物技術(shù)有限公司，廣東清遠(yuǎn) 511853）

支鏈氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。支鏈氨基酸可以通過改善腸道發(fā)育[1-2]以及提高動物采食量[3]、營養(yǎng)物質(zhì)消化率[4]、氨基酸利用率[5]和肌肉蛋白的合成[6]來促進(jìn)動物的快速生長。

異亮氨酸是人和動物的一種必需氨基酸。因其具有支鏈結(jié)構(gòu)的中性脂肪族氨基酸，故可以參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)營養(yǎng)代謝和生長發(fā)育等重要的生理功能[7-8]。飼料中添加1%的異亮氨酸可通過改善斷奶仔豬回腸屏障來預(yù)防腹瀉的發(fā)生[9]。Goodarzi 等[2]發(fā)現(xiàn)異亮氨酸通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)來促進(jìn)斷奶仔豬的生長。但當(dāng)飼料中缺乏異亮氨酸時，會對育肥豬生長性能、胴體性狀造成負(fù)面影響[10]。但關(guān)于異亮氨酸對斷奶仔豬階段的影響研究報道較少。因此，本試驗通過在斷奶仔豬飼糧中添加不同水平的異亮氨酸，研究其對斷奶仔豬生長性能、血清生化指標(biāo)和腸道微生物的影響，為提高斷奶仔豬生長性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗選用（28±2） d 斷奶的杜×長×大健康仔豬180 頭，初始體重（7.82±0.52） g，按照體重隨機(jī)分為6 個處理，每個處理6個重復(fù)，每個重復(fù)5頭仔豬，分別采食6 種添加不同水平異亮氨酸的試驗飼糧。試驗期為21 d。

1.2 試驗設(shè)計及試驗飼糧

飼糧參考NRC（2012）豬營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，試驗飼組成及營養(yǎng)水平見表1，其中對照組飼糧粗蛋白水平18.50%，異亮氨酸水平為0.78%，其他各組飼糧蛋白水平均為18.50%，異亮氨酸水平依次為0.87%、0.94%、1.01%、1.09%、1.16%。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在廣東海大集團(tuán)高州豬場（中國廣東）進(jìn)行。試驗采用全封閉豬舍，豬舍溫度控制在（25±1） ℃、濕度維持在58%～74%。顆粒料飼喂，自由采食和飲水。按豬場常規(guī)管理程序進(jìn)行驅(qū)蟲和免疫，并觀察、記錄動物的健康狀況。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能

分別于試驗開始和試驗結(jié)束時以重復(fù)為單位對仔豬空腹稱重，以重復(fù)為單位記錄采食量，并計算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）、飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）。

平均日采食量（ADFI，kg）=（給料量-余料量）/（試驗天數(shù)×仔豬頭數(shù)）

平均日增重（ADG，kg）=（末重-初重）/（試驗天數(shù)×仔豬頭數(shù)）

飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）=ADFI/ADG

1.4.2 糞樣收集及處理

在試驗第21天，每個處理組挑選6頭體重一致的仔豬，收集新鮮的糞樣，立刻置于液氮中冷凍。將收集的樣品儲存在-80 ℃冰箱。

1.4.3 血清采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束時，試驗豬禁食12 h，每個處理選取接近平均體重的豬，前腔靜脈采血，靜置0.5 h 后3 500 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，置于-20 ℃保存，用于檢測血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL8）、白細(xì)胞介素-22（IL-22）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、干擾素-γ（INF-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、葡萄糖（GLU）、乳酸脫氫酶（LDH）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、α-淀粉酶（α-AMY）、三酰甘油（TG）、膽固醇（CHO）。所用試劑盒均為南京建成生物工程研究所有限公司，檢測方法均按照說明書要求操作和計算。

1.4.4 糞便微生物16S rRNA測定與分析

飼養(yǎng)試驗結(jié)束時，用無菌防爆試管收集每只豬的新鮮糞便后迅速放于液氮中，用于微生物16S rRNA測定與分析。具體操作步驟如下。

① 新鮮糞便基因組DNA 的提取：吸取1 mL CABT 裂解液和1 g 樣品置于2 mL 無菌EP 管，加入適量溶菌酶，渦旋1 min 使樣品充分混合，65 ℃水浴10 min；12 000 r/min、4 ℃離心10 min 取上清，加入酚（pH 為8.0）∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）50 μL 上述條件離心10 min；取上清至1.5 mL 離心管，加入氯仿∶異戊醇（24∶1）50 μL上述條件離心10 min；取上清至1.5 mL 離心管，加入異丙醇，-20 ℃沉淀，上述條件離心10 min；棄上清，使用1 ml 75%乙醇洗滌2次，小心吸取上層液體，室溫晾干；加入ddH2O溶解DNA；

② PCR擴(kuò)增：提取的DNA使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。使用引物341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）對V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)展，擴(kuò)展體系如下。

模板：稀釋后的基因組DNA（1 ng/μL）10 μL；引物：341F、806R（0.2 μmol/L），各1 μL；酶和緩沖液：Phusion Master Mix，15 μL；水：超純水，2 μL；

PCR 反應(yīng)程序為：98 ℃預(yù)變性1 min；30 個循環(huán)（包括98 ℃，10 sec；50 ℃，30 sec；72 ℃，30 sec）；72 ℃，5 min。擴(kuò)展的PCR 產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測并割膠回收目標(biāo)條帶。

③ Illumina Novaseq 測序平臺：使用Nova Seq 6000 PE250進(jìn)行上機(jī)測序。

1.4.5 新鮮糞便微生物16S rRNA信息分析

將原始的fastq文件使用QIIME2處理，使用dada 2插件進(jìn)行質(zhì)控、修剪、去噪和拼接。去除嵌合體后，得到最后的特征序列表格；隨后使用QIIME2-featureclassifier 將該特征序列比對到預(yù)先訓(xùn)練好的13.8 版本的GREENGENE 數(shù)據(jù)庫，得到物種分類信息表；使用QIIME2-feature-table插件去除線粒體序列。

1.5 試驗數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.4 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，LSD 多重比較，結(jié)果以平均值表示，P＜0.05 表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，與0.78% Ile水平相比，0.87%、0.94%、1.01%、1.09%、1.16% Ile 水平對斷奶仔豬的末重、平均日采食量、平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率均無顯著影響（P＞0.05）。當(dāng)飼糧Ile 水平為1.01%時，仔豬末重最高，高于0.78% Ile 水平2.89%，但差異不顯著（P＞0.05）。且飼糧Ile 水平為1.01%時，其飼料轉(zhuǎn)化率為所有試驗組中最低，但與其余各組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表3 可知，與0.78% Ile 水平相比，0.87%、0.94%、1.01%、1.09%、1.16% Ile 水平對斷奶仔豬血清T-AOC、SOD、GSH-Px 和MDA 均 無顯著 差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明不同飼糧Ile水平對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)均無負(fù)面影響。

表3 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響（n=6）

2.3 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

由表4可知，當(dāng)飼糧Ile水平為1.01%時，血清IgA水平顯著高于0.87%、0.94%、1.09%、1.16 Ile 水平（P＜0.05），但與0.78% Ile 水平無顯著差異（P＞0.05）。飼糧Ile 水平為1.01%時血清IgA 水平高于其他各水平，表明飼糧中Ile 水平為1.01%時有利于提高斷奶仔豬的免疫力。但飼糧Ile 水平對斷奶仔豬血清中促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α、INF-γ、IL-22 均無顯著影響（P＞0.05）。以上結(jié)果表明飼糧Ile 水平為1.01%可以改善斷奶仔豬的免疫功能。

表4 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響（n=6）

2.4 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，飼糧Ile水平為0.94%時，UREA水平顯 著 高 于0.78% Ile 水 平（P＜0.05），但 與0.87%、1.01%、1.09%、1.16% Ile 水平無顯著差異（P＞0.05）。飼糧Ile 水平對機(jī)體氮代謝和糖類代謝指標(biāo)均無顯著影響（P＞0.05），表明飼糧Ile 水平對機(jī)體的氮代謝和糖類代謝均無作用。

表5 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響（n=6）

2.5 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬腸道菌群的影響

由圖1 可知，在門水平，斷奶仔豬糞便菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）和厚壁菌門（Firmicutes）這四種的菌群組成，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢菌群，共占糞便菌群的90%以上。由圖2 可知，在屬水平，Ile 水平為0.94%時，富集到較多的羧酸菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1），norank_f_Muribaculaceae，螺旋體屬（Treponema）；Ile 水平為1.01%時，與0.78% Ile 組相比，提高了有益菌Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014的豐度。

圖1 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響（門水平）

圖2 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響（屬水平）

3 討論

3.1 飼糧異亮氨酸對斷奶仔豬生長性能的影響

以玉米-豆粕型為基礎(chǔ)的飼料配方中，一般不會出現(xiàn)Ile 的缺乏。當(dāng)以血粉替代部分豆粕作為基礎(chǔ)飼糧的蛋白質(zhì)來源配制Ile 缺乏的飼糧時，隨著飼糧Ile水平的提高，斷奶仔豬和肥育豬的平均日增重、平均日采食量和肉料比顯著提高[11-13]。Lordelod 等[14]發(fā)現(xiàn)在以玉米-小麥-豆粕型低蛋白飼糧飼喂斷奶仔豬時，通過補(bǔ)充0.13% Ile 可以提高其生長速度。Ma 等[15]研究發(fā)現(xiàn)添加0.13% Ile 可以提高肉雞的平均日采食量和平均日增重。本試驗中，飼糧Ile 水平對保育仔豬的平均日采食量和平均日增重均沒有產(chǎn)生顯著影響。與羅燕紅等[10]和邱磊[16]的研究結(jié)果一致。這可能是由于本試驗采用的飼糧為玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，沒有設(shè)計出Ile缺乏的對照組。

3.2 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

劉恒晨[17]研究表明，飼糧中添加0.4% Ile 后顯著提高了AA 肉雞血清中GSH-Px 水平，增強(qiáng)了機(jī)體的抗氧化能力。宮碧霜等[18]發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.5% Ile后顯著提高了小鼠血清中T-GSH 活性并顯著降低了MDA 含量，提高了小鼠機(jī)體的抗氧化能力。但Dong等[19]研究發(fā)現(xiàn)，給28 周齡的羅曼褐蛋雞飼喂Ile 水平為0.56%、0.67%、0.78%、0.86%和0.96%飼糧12周，對其血液和肝臟中的T-AOC、SOD 和MDA 均無影響。本試驗中，不同水平的Ile 并未改善斷奶仔豬體內(nèi)抗氧化功能。

3.3 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

血液生理生化指標(biāo)可以反映機(jī)體生理機(jī)能及代謝狀況。血清中TP、ALB、UREA、ALT 等是衡量機(jī)體氮代謝的主要指標(biāo)。尤其是血清UREA 是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，其濃度可以準(zhǔn)確地反映動物體內(nèi)氨基酸合成蛋白質(zhì)效率的高低，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成和飼料轉(zhuǎn)化效率增加時，UREA 含量降低，反之則升高[20]。本試驗中，隨著飼糧中Ile水平的增加，UREA 含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，表明Ile水平為0.94%不利于斷奶仔豬蛋白質(zhì)的合成和代謝。GLU、α-AMY 和LDH 是衡量機(jī)體糖代謝的主要指標(biāo)。本試驗中，Ile 的添加并沒有引起這些指標(biāo)的差異，表明Ile 對斷奶仔豬糖代謝無顯著調(diào)節(jié)作用。

3.4 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

Ile 不僅是體內(nèi)糖、脂及蛋白代謝的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，同樣也是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要能源物質(zhì)和免疫分子合成底物。大量試驗研究了Ile 在多種疾病模型中發(fā)揮了重要的免疫功能。在本試驗中，當(dāng)飼糧中Ile水平為1.01% 時，仔豬血清中IgA 水平顯著高于0.87%、0.94%、1.09%、1.16% Ile 水 平，表 明 添加1.01% Ile可以提高斷奶仔豬的免疫功能，進(jìn)而促進(jìn)斷奶仔豬的生長發(fā)育。與本研究一致，任曼[21]研究發(fā)現(xiàn)，與飼糧Ile 水平為0.64%相比，飼糧Ile 水平為1.09%可顯著提高斷奶仔豬血液中IgA 的水平，進(jìn)而增強(qiáng)斷奶仔豬的免疫力。

3.5 飼糧異亮氨酸水平對斷奶仔豬腸道微生物的影響

腸道內(nèi)的微生物由細(xì)菌、真菌和原生體組成。腸道微生物具有促進(jìn)腸道成熟、調(diào)節(jié)免疫、提高生長性能的作用。正常情況下，腸道微生物維持著動態(tài)平衡。其中擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）和厚壁菌門（Firmicutes）是豬糞便微生物門水平中最主要四種菌群[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與0.78% Ile 水平相比，飼糧中Ile 水平為1.01%時，增加了斷奶仔豬腸道中有益菌Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014的豐度。有研究表明Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014豐度的提高，可以降低結(jié)腸炎的發(fā)生，提高腸道的健康[24]。

4 結(jié)論

在飼糧中添加不同水平的異亮氨酸對斷奶仔豬的生長性能和血清生化指標(biāo)無顯著影響，表明異亮氨酸對斷奶仔豬的生產(chǎn)性能無負(fù)面影響。此外，與0.87%異亮氨酸水平相比，含有1.01%異亮氨酸的飼糧顯著提高斷奶仔豬血清中IgA 水平，進(jìn)而提高斷奶仔豬的健康，這可能是由于異亮氨酸能夠改變腸道微生物組成，增加了腸道有益菌Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014的豐度。綜合考慮，在本試驗條件下，推薦在8～17 kg 斷奶仔豬飼糧中異亮氨酸水平為1.01%。