郭金沂,王麗琴,任宇華,彭鎂漫,趙 星,吳 晨,郭 郎

[1. 西北大學(xué)文化遺產(chǎn)學(xué)院,陜西西安 710027; 2. 文化遺產(chǎn)研究與保護(hù)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西北大學(xué)),陜西西安 710027; 3. 西安市文物保護(hù)考古研究院,陜西西安 710068]

0 引 言

青霉、曲霉、枝孢菌和鏈格孢菌是彩繪文物常見的霉菌,其生長(zhǎng)代謝會(huì)引起彩繪的變色、褪色及脫落等病害,對(duì)彩繪文物造成嚴(yán)重破壞[1-2],例如:日本高松冢曾為原址保護(hù)的國(guó)際典范,但因滋生霉菌使彩繪文物表面產(chǎn)生了難以去除的生物黑斑,從而被迫解體搬遷至異地保護(hù)[3-4];法國(guó)拉斯科洞穴巖畫因表面彩繪產(chǎn)生腐生真菌使有機(jī)物分解,為藻類和其他微生物提供營(yíng)養(yǎng)物,促進(jìn)藻類生物膜的二次定植,增加了微生物的多樣性,由此長(zhǎng)期處于關(guān)閉狀態(tài)[5];青霉、曲霉、枝孢菌和鏈格孢菌還廣泛存在于羅馬尼亞木質(zhì)教堂繪畫[6]、基輔圣索菲亞大教堂中世紀(jì)壁畫[7]、西安韓休墓壁畫[8]和古埃及壁畫[9]等多處彩繪文物上。

防止霉菌生長(zhǎng)的重要手段是使用抑菌劑。克霉唑[10]、異噻唑啉酮、苯扎氯銨[11]、鏈霉屬抗生素[12]、雙氯酚[13]、苯并咪唑類藥物、戊唑醇[14]、羅勒[15]、丁香[16]、肉桂[17]和百里香精油[18-19]、納米銀[20-21]等常常作為文物抑菌劑使用,其中辛基異噻唑啉酮是控制真菌生長(zhǎng)的最有效抑菌劑[22]。以往研究發(fā)現(xiàn),不同菌種對(duì)特定抑菌劑的敏感性不同,抑菌劑的使用濃度也不盡相同,如苯扎氯銨和異噻唑啉酮是文物上最常使用的抑菌劑,但苯扎氯銨的實(shí)際使用濃度卻往往高于異噻唑啉酮[23]。施加過量抑菌劑會(huì)造成環(huán)境污染,并使微生物過早產(chǎn)生抗藥性。目前,在多種評(píng)價(jià)抑菌劑抑菌效果的方法中,抑菌圈是最常見的一種[13],還有最小抑菌濃度值(MIC)[14-15]、抑菌率[20]、毒力[24]、平板計(jì)數(shù)和ATP熒光法計(jì)算有效菌含量[13]等方法。使用上述方法評(píng)價(jià)抑菌劑抑菌效果各有優(yōu)劣:MIC代表短時(shí)間內(nèi)抑菌劑擁有抑菌活性的最小濃度,實(shí)際藥劑使用濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過該值;抑菌率和毒力表征了抑菌劑在固定濃度時(shí)的抑菌效果,這兩者都無法表征抑菌的長(zhǎng)效性;有效菌落數(shù)檢驗(yàn)?zāi)鼙碚饕志拈L(zhǎng)效性,但用時(shí)長(zhǎng)、誤差較大。綜上:使用單一方法篩選抑菌劑,其評(píng)價(jià)指標(biāo)不夠全面和系統(tǒng);使用兩種或多種方法評(píng)價(jià)抑菌效果時(shí),各方法的選擇缺乏科學(xué)性和邏輯性。截至目前仍缺乏科學(xué)的評(píng)價(jià)彩繪文物抑菌劑的方法體系——面對(duì)復(fù)雜多樣的霉菌,如何在眾多的抑菌劑中選擇出有效的抑菌劑,并采用適宜的濃度進(jìn)行抑菌處理,成為利用抑菌劑防止文物霉變的瓶頸問題。因此,構(gòu)建一套合理的抑菌劑評(píng)價(jià)體系具有重要意義。本研究以五種彩繪文物上常見霉菌和12種抑菌劑為研究對(duì)象,通過對(duì)抑菌劑活性、色度變化、抑菌效果及其長(zhǎng)效性的評(píng)估,旨在構(gòu)建一套彩繪文物抑菌劑綜合性能的評(píng)價(jià)體系,為彩繪文物抑菌劑的合理選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 霉菌材料

選擇產(chǎn)黃青霉、雜色曲霉、枝孢菌、交鏈孢霉和日本曲霉五種霉菌為研究對(duì)象,它們分別屬于彩繪文物常見菌屬——青霉屬、曲霉屬、枝孢菌屬和鏈格孢菌屬,其中前三種霉菌也是課題組在高濕環(huán)境下彩繪顏料中分離出的優(yōu)勢(shì)菌種[25],后兩種霉菌是唐代彩繪陶器上分離的優(yōu)勢(shì)菌種。在麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基(MEA)中,五種霉菌均生長(zhǎng)良好,形貌清晰。

1.2 抑菌劑材料

文物保護(hù)中使用抑菌劑可分為三類:人工有機(jī)抑菌劑、人工無機(jī)抑菌劑和生物抑菌材料。本研究選擇如下:人工有機(jī)抑菌劑應(yīng)用廣泛、種類眾多,化學(xué)成分各不相同,實(shí)驗(yàn)為了較為全面地評(píng)價(jià)抑菌劑,根據(jù)化學(xué)成分選擇五類六種人工有機(jī)抑菌劑(異噻唑啉酮、戊唑醇、克霉唑、苯并咪唑、苯扎氯銨、雙氯酚);一種人工無機(jī)抑菌劑(納米銀);兩類五種生物抑菌材料(納他霉素、肉桂精油、丁香精油、百里香精油和羅勒精油)。這12種抑菌劑的基本信息見表1。

表1 12種抑菌劑的基本信息Table 1 Basic information on 12 kinds of fungicides

1.3 測(cè)量方法

1.3.1抑菌劑活性測(cè)量方法 以最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)表征抑菌劑的活性,其測(cè)量方法如下:將液體麥芽浸膏培養(yǎng)液(每升水含30 g麥芽浸粉和3 g大豆蛋白胨)加入96孔板后,在其中繼續(xù)加入以水為稀釋溶劑的抑菌劑-無菌水混合液(部分抑菌劑溶解性差,實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行3 h超聲波震蕩使抑菌劑-水體系混勻)以2倍梯度稀釋法連續(xù)稀釋,混合均勻后在每個(gè)孔中加入等量霉菌孢子液。在30℃下培養(yǎng)2 d,肉眼觀察真菌的生長(zhǎng)狀況,將培養(yǎng)液保持澄清的抑菌劑最低濃度定義為MIC。將96孔板中澄清培養(yǎng)液20 μL涂布于MEA上,30℃下培養(yǎng)3 d,培養(yǎng)基上未出現(xiàn)真菌生長(zhǎng)的抑菌劑最低濃度定義為MBC,如果MBC≥32MIC,說明霉菌已經(jīng)出現(xiàn)抗藥性[26]。

1.3.2色度變化測(cè)量方法 選取朱砂、土紅、群青、石綠和鉛白五種顏料,加3%明膠水溶液研細(xì)后涂刷在載玻片上作為彩繪模擬樣品,實(shí)驗(yàn)全程保持無菌。將抑菌劑施加于彩繪模擬樣品表面,自然晾干后,重復(fù)三次操作。采用非接觸式色度計(jì)測(cè)定抑菌劑施加前后樣品的L*(亮度)、a*(紅綠色品坐標(biāo))、b*(黃藍(lán)色品坐標(biāo)),根據(jù)式1計(jì)算色差值(ΔE),以ΔE表征顏色的變化,肉眼可見的顏色變化極值為ΔE=3.0。由于彩繪文物的色彩是其重要的外貌特征,施加抑菌劑后ΔE不宜超過3.0。

1.3.3抑菌效果評(píng)價(jià)方法 抑菌效果評(píng)價(jià)內(nèi)容包括抑制霉菌孢子萌發(fā)效果和抑制霉菌菌絲體生長(zhǎng)效果兩個(gè)方面。

1) 抑制霉菌孢子萌發(fā)效果的評(píng)價(jià)方法。以半最大效應(yīng)濃度(EC50)表征抑制霉菌孢子萌發(fā)效果。EC50是指在特定暴露時(shí)間后,能達(dá)到50%最大生物效應(yīng)對(duì)應(yīng)的藥物、抗體或者毒素等的濃度。本實(shí)驗(yàn)中,EC50代表抑制一半孢子萌發(fā)所需的抑菌劑濃度。其測(cè)量方法如下:將培養(yǎng)好的霉菌孢子用去離子水從MEA上洗脫、過濾、兩次離心(1 000 r/min)5 min后用去離子水將孢子重懸浮,以0.5%葡萄糖無菌水溶液調(diào)節(jié)孢子濃度至6×106個(gè)/mL(A液)。根據(jù)選擇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度對(duì)抑菌劑進(jìn)行稀釋:水溶性抑菌劑直接用水溶解稀釋;難溶于水的抑菌劑用乙醇溶解后用0.1%吐溫80水溶液稀釋,確保最終乙醇體積分?jǐn)?shù)<2%。

將0.5 mL A液和0.5 mL抑菌劑溶液混勻后滴到凹玻片上,放于帶有淺層水的培養(yǎng)皿中加蓋保濕培養(yǎng),并設(shè)不加抑菌劑組作空白對(duì)照。在30℃下培養(yǎng)2 d,當(dāng)空白對(duì)照孢子萌發(fā)率(R0)達(dá)到95%以上時(shí),觀察孢子萌發(fā)狀況,保證觀察孢子總數(shù)為200～300。根據(jù)式2～式4計(jì)算孢子萌發(fā)率(R)、校正孢子萌發(fā)率(Re)和孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率(I)。采用SPSS軟件建立I值與抑菌劑質(zhì)量濃度間的毒力回歸方程,由此計(jì)算出當(dāng)I值為50%時(shí),抑菌劑的質(zhì)量濃度,即EC50。

(2)

(3)

(4)

式中:Ng為孢子萌發(fā)數(shù);Nt為調(diào)查孢子總數(shù)。

2) 抑制霉菌菌絲體生長(zhǎng)效果的評(píng)價(jià)方法。利用抑菌圈法表征抑菌劑抑制霉菌菌絲體生長(zhǎng)效果以評(píng)價(jià)抑菌劑的敏感性。通常抑菌圈直徑越大,藥劑敏感性越強(qiáng),其抑制霉菌菌絲體生長(zhǎng)的效果越好。測(cè)量方法如下:將直徑6 mm、厚1 mm的濾紙?jiān)谝志鷦┲薪? h后取出自然晾干12 h,置于涂布有50 μL 106個(gè)/mL待測(cè)霉菌孢子的MEA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)4 d,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑制圈直徑。

1.3.4長(zhǎng)效性評(píng)估方法 以可培養(yǎng)真菌濃度表征抑菌劑在彩繪顏料上抑菌的長(zhǎng)效性,參考文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行測(cè)量:于施加抑菌劑后的90 d時(shí),用無菌解剖刀對(duì)殺滅實(shí)驗(yàn)區(qū)及未做處理的霉變對(duì)照區(qū)內(nèi)彩繪模擬樣品表層采樣,置于無菌水中混勻后,涂布于MEA培養(yǎng)基上,30℃下培養(yǎng)4 d后計(jì)算可培養(yǎng)真菌濃度C(CFU/g)并進(jìn)行差異性ANOVA分析,式5為計(jì)算公式。

(5)

式中:T表示平板上有效菌落數(shù)(CFU);A表示稀釋質(zhì)量濃度(g/mL);B表示涂布平板時(shí)的用量(mL)。

2 結(jié)果和討論

2.1 抑菌劑活性與耐藥性判別

以MIC和MBC值表征抑菌劑的活性,其數(shù)值越小,抑菌劑活性越高。表2為12種抑菌劑對(duì)五種霉菌的MIC和MBC值,由該表可以看出:

表2 12種抑菌劑對(duì)五種霉菌的MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of 12 kinds of fungicides on five molds (mg/L)

1) 同一種抑菌劑對(duì)五種霉菌的抑菌活性存在差異。以肉桂精油為例,對(duì)雜色曲霉的MIC為125 mg/L,而對(duì)日本曲霉的MIC為500 mg/L。

2) 對(duì)同一種霉菌,不同抑菌劑的MIC和MBC數(shù)值可能極其相近,也可能相差較大,但MIC≤MBC。以日本曲霉為例,戊唑醇的MIC和MBC均為31.25 mg/L,而肉桂精油的MIC和MBC分別為500 mg/L和1 000 mg/L。本研究的12種抑菌劑對(duì)五種霉菌未出現(xiàn)抗藥性(MBC<32MIC)。如果出現(xiàn)霉菌對(duì)特定種類藥劑產(chǎn)生抗藥性,建議放棄此種藥劑,更換其他抑菌劑;否則,不但抑菌效果差,還會(huì)因藥劑濫用污染環(huán)境。

3) 異噻唑啉酮、戊唑醇和納他霉素在31.25～250 mg/L范圍,對(duì)五種霉菌有抑菌活性;克霉唑、苯扎氯銨、雙氯酚、肉桂精油和丁香精油在125～2 000 mg/L范圍,對(duì)五種霉菌有抑菌活性;百里香精油、羅勒精油、苯并咪唑和納米銀>1000～8 000 mg/L才出現(xiàn)良好的抑菌活性。因此,通過MIC和MBC值可獲取抑菌劑活性及其耐藥性信息,為抑菌劑種類及其濃度的合理選擇提供科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)舍棄抑菌活性較差的百里香精油、羅勒精油、苯并咪唑和納米銀,選擇其余八種抑菌劑繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

在彩繪文物保護(hù)中,常使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示藥劑濃度,MIC和MBC的傳統(tǒng)單位為mg/L,兩者轉(zhuǎn)換關(guān)系如下:體積分?jǐn)?shù)75%的酒精溶液作為溶劑時(shí),250 mg/L約為0.029 6%,其余以此類推。根據(jù)以上八種抑菌劑的MIC和MBC值,設(shè)置5組質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度C1～C5。設(shè)置濃度梯度的原則是:C1處于最小MIC和最大MBC之間;C2略大于最大MBC;C3、C4和C5分別為2倍、3倍和4倍的C2。綜上,異噻唑啉酮、戊唑醇、納他霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為C1:0.01%、C2:0.05%、C3:0.1%、C4:0.15%和C5:0.2%?？嗣惯?、苯扎氯銨、雙氯酚、肉桂精油和丁香精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為C1:0.1%、C2:0.5%、C3:1%、C4:1.5%和C5:2%。

2.2 顏色變化

由圖1可知,施加0.2%(C5)納他霉素能引起群青、鉛白和朱砂顏色的明顯變化(ΔE>3.0),不宜使用。

圖1 抑菌劑(C5)對(duì)彩繪顏色的影響Fig.1 Effects of the fungicides at C5 concentration on pigment colors

2.3 抑菌效果評(píng)估

2.3.1孢子萌發(fā)的抑制效果 EC50值越小,藥劑的毒性越強(qiáng)、對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果越好。經(jīng)計(jì)算處理,求出孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率Y(%)與抑菌劑質(zhì)量濃度X(mg/L)間的毒力回歸方程和EC50,結(jié)果見表3,從中可以看出:

表3 七種抑菌劑對(duì)五種霉菌的毒力測(cè)定Table 3 Toxicities of seven kinds of fungicides on five molds

1) 對(duì)于枝孢菌和日本曲霉,戊唑醇的EC50最小、藥劑毒性最強(qiáng)、對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果最好;對(duì)于產(chǎn)黃青霉、雜色曲霉和交鏈孢霉,異噻唑啉酮對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果最好。對(duì)于五種霉菌:丁香精油的EC50>10 000 mg/L或無法測(cè)出,其毒性弱、抑菌效果差,不宜使用;雙氯酚的EC50值也相對(duì)較高,抑菌效果較差。

2) 藥劑毒力與其抑菌活性密切相關(guān)。一般說來,抑菌劑毒性越強(qiáng),產(chǎn)生抑菌活性所需藥劑的濃度越低,但兩者不是線性關(guān)系,例如:雙氯酚、苯扎氯銨對(duì)枝孢霉和雜色曲霉的抑菌活性(MIC和MBC)在同一區(qū)間(表2),但雙氯酚對(duì)這兩種菌的EC50是苯扎氯銨的兩倍。同樣,對(duì)日本曲霉,肉桂精油與雙氯酚的抑菌活性相同,但雙氯酚的EC50約是肉桂的四倍。在文物保護(hù)中,尤其是露天文物,往往受限于原位環(huán)境,環(huán)境中的霉菌孢子數(shù)量眾多,因此抑菌更傾向于在孢子萌發(fā)階段進(jìn)行,即推薦選擇EC50小的抑菌劑。

3) 在復(fù)雜的彩繪文物保護(hù)中,可能多種優(yōu)勢(shì)霉菌共存,應(yīng)根據(jù)優(yōu)勢(shì)菌種的實(shí)際情況,有針對(duì)性地選擇兩種或者兩種以上抑菌劑混合使用。判斷抑菌劑混合使用是起到促進(jìn)作用還是拮抗作用,SR(協(xié)同比)具有重要參考價(jià)值[27]。SR為混劑的理論EC50[EC50(th),mg/L,式6]與混劑的實(shí)測(cè)EC50[EC50(AB),mg/L]的比值(如式7所示)。

(6)

(7)

式中:A、B分別代表兩種抑菌劑;a和b分別代表混劑中A、B的質(zhì)量分?jǐn)?shù);EC50(A)和EC50(B)分別代表A和B的EC50(mg/L)。

依據(jù)混劑的SR值,可合理選擇混劑中各抑菌劑的種類及其配比。一般認(rèn)為:當(dāng)SR值<0.5時(shí),兩種藥物之間存在拮抗作用;SR值>1.5時(shí),兩種藥物具有協(xié)同交互作用。

2.3.2霉菌生長(zhǎng)的抑制效果 抑菌圈是判定抑菌劑敏感性的重要指標(biāo):當(dāng)抑菌圈直徑≥20 mm,抑菌劑對(duì)該霉菌的抑菌性到達(dá)高敏;10～20 mm時(shí)為中敏;7～10 mm時(shí)為鈍敏;<7 mm時(shí)不敏感。一般抑菌圈直徑達(dá)到18～22 mm,即中敏到高敏之間時(shí),認(rèn)為抑菌效果良好。抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2,從中可知:

圖2 六種抑菌劑對(duì)五種霉菌的抑菌圈Fig.2 Inhibition zones of six kinds of fungicides on five molds

1) 六種抑菌劑的抑制圈直徑通常隨著抑菌劑濃度的增加而變大。

2) 在95%置信區(qū)間內(nèi),0.15%異噻唑啉酮和2%苯扎氯銨對(duì)五種霉菌都達(dá)到了高敏,0.15%戊唑醇、2%肉桂精油和克霉唑?qū)Σ糠置咕m然無法達(dá)到高敏,但抑菌圈直徑區(qū)間處于18～22 mm,抑菌效果良好;然而,苯扎氯銨、肉桂精油和克霉唑的適宜濃度是異噻唑啉酮、戊唑醇的十余倍;雙氯酚在測(cè)試濃度范圍內(nèi)無法使任何一種霉菌的抑制效果達(dá)到高敏,抑菌效果最差,不宜使用。

3) 部分抑菌劑當(dāng)其濃度達(dá)到一定值后,抑菌圈直徑隨濃度增加緩慢增大,甚至可能出現(xiàn)小幅度減小,例如:對(duì)產(chǎn)黃青霉,0.15%和0.2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊唑醇其抑菌圈直徑差距很小;而2%雙氯酚的抑菌圈直徑略小于1.5%。說明在達(dá)到一定濃度后,繼續(xù)提高濃度對(duì)抑菌效果的提升作用影響甚微,甚至?xí)霈F(xiàn)負(fù)作用。因此,如果使用這些抑菌劑,應(yīng)將濃度控制在合理的范圍,杜絕因藥劑使用濃度過大造成濫用。

2.4 抑制效果的長(zhǎng)效性

根據(jù)文物保護(hù)原則,理想的抑菌劑在彩繪文物上應(yīng)能長(zhǎng)期起到良好的抑菌作用,而2.1、2.3部分是從藥理學(xué)角度出發(fā),測(cè)試短時(shí)間內(nèi)抑菌劑的抑菌效果,這些指標(biāo)的測(cè)試與評(píng)估對(duì)于抑菌劑的篩選是十分必要的,但短期抑菌效果好的藥劑未必能夠長(zhǎng)期有效。因此,評(píng)估抑菌劑抑菌效果的長(zhǎng)期保持性是非常重要的,為此引入抑制效果的長(zhǎng)效性指標(biāo),通過測(cè)量施加抑菌劑殺滅霉菌一段時(shí)間后霉菌重新生長(zhǎng)量的濃度來表征。

表4為彩繪模擬樣品在施加抑菌劑90 d后測(cè)得的可培養(yǎng)微生物濃度,可培養(yǎng)微生物濃度越大抑菌效果越差。表中數(shù)據(jù)進(jìn)行同列比較,數(shù)據(jù)后有相同字母者表示差異不顯著(P>0.05),數(shù)據(jù)由大到小標(biāo)注為a、b、c等。由表4可知:

表4 施加抑菌劑90 d后可培養(yǎng)微生物濃度Table 4 Concentrations of cultivable fungi after 90 days of fungicide application (103 CFU/g)

1) 任意彩繪顏料上的任意一種霉菌,空白對(duì)照組的可培養(yǎng)微生物濃度均大于五個(gè)施藥組,如在群青顏料上產(chǎn)黃青霉的空白對(duì)照組為838 000 CFU/g,是施藥組最大值(戊唑醇)的20倍。且根據(jù)差異性分析做abc分類標(biāo)注,所有空白對(duì)照組均為a,與施藥組差異性顯著,因此所有抑菌劑對(duì)五種霉菌在測(cè)試時(shí)間90 d內(nèi)均有明顯抑菌效果。

2) 不同抑菌劑抑菌效果的長(zhǎng)效性存在差異,這種差異不僅與抑菌劑有關(guān),還與霉菌種類有關(guān)。對(duì)于產(chǎn)黃青霉、雜色曲霉、枝孢菌和交鏈孢霉,多數(shù)顏料上abc標(biāo)記法能分出a、b和c這三個(gè)字母,筆者認(rèn)為每種顏料條件的標(biāo)注均含b時(shí),抑菌劑抑菌效果長(zhǎng)效性較差。對(duì)于產(chǎn)黃青霉,戊唑醇和肉桂精油的差異性均包含b,長(zhǎng)效性較差;同理對(duì)于雜色曲霉,異噻唑啉酮和克霉唑較差;對(duì)于枝孢菌,克霉唑和苯扎氯銨較差;對(duì)于交鏈孢霉,肉桂精油、克霉唑較差。

對(duì)于日本曲霉,疏松的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其在施藥后極易從彩繪上分離,因此對(duì)于群青、朱砂和土紅這三種日本曲霉能旺盛生長(zhǎng)的顏料條件下,空白組和施藥組差距非常大,而各施藥組間的差異性遠(yuǎn)不如其與對(duì)照組的差距。以土紅為例,施藥組最大值與空白對(duì)照組差距超過了26倍,而施藥組最大值與最小值的差距僅為五倍,這導(dǎo)致差異性分析中的分組過少,因此對(duì)日本曲霉的抑菌長(zhǎng)效性,以各施藥組的可培養(yǎng)濃度具體數(shù)值結(jié)合石綠顏料上的顯著性標(biāo)記進(jìn)行分析。石綠上日本曲霉生長(zhǎng)受到明顯的抑制,空白對(duì)照組的可培養(yǎng)微生物濃度僅為11 200 CFU/g,這說明能生長(zhǎng)出來的日本曲霉經(jīng)過了選擇,具有一定的毒性抵抗能力,因此,石綠上施藥組和空白對(duì)照組的差距遠(yuǎn)小于其他顏料,這使差異性分析中字母標(biāo)注的變多,出現(xiàn)了d和e字母。綜合四種顏料的可培養(yǎng)微生物濃度和字母分類,筆者認(rèn)為石綠顏料上包含b和c的異噻唑啉酮和肉桂精油長(zhǎng)效性較差?？傮w而言,苯扎氯銨對(duì)多數(shù)霉菌的抑菌效果長(zhǎng)效性相對(duì)較好。

3) 霉菌在不同彩繪顏料上的生長(zhǎng)存在差異性。在群青上,五種霉菌都能良好生長(zhǎng),幾種抑菌劑抑菌效果的長(zhǎng)效性皆不佳。在朱砂、土紅和石綠上,五種霉菌都能生長(zhǎng),但有效菌落數(shù)均小于群青,尤其是日本曲霉在石綠上生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。在鉛白上,日本曲霉無法生長(zhǎng),空白對(duì)照組和施藥組可培養(yǎng)微生物濃度均為0 CFU/g;其他四種霉菌生長(zhǎng)受限,其有效菌落數(shù)小于其他四種顏料。鉛白抑制霉菌生長(zhǎng)的機(jī)制與彩繪顏料的金屬離子毒性密切相關(guān)[24]。

綜上,本研究表明0.15%異噻唑啉酮和戊唑醇,2%苯扎氯銨、肉桂精油和克霉唑?qū)ΤＲ娒咕舾行詮?qiáng)、抑菌效果良好。結(jié)合文獻(xiàn)可知,篩選出的抑菌劑適宜濃度接近或小于實(shí)際文物保護(hù)濃度,例如:武發(fā)思等[13]研究表明0.2%霉敵(主要成分為異噻唑啉酮)對(duì)徐顯秀墓霉菌殺滅的中長(zhǎng)期效果最好;5%Preventol R-80(主要成分為苯扎氯銨)對(duì)枝孢菌的抑菌圈>30 mm[12];韓休墓使用3%克霉唑乙醇溶液進(jìn)行全墓室的噴灑,其抑菌效果良好[8]。說明該評(píng)價(jià)方法體系具有一定的科學(xué)性。

2.5 抑菌劑性能評(píng)價(jià)的程序與方法體系的初步構(gòu)建

按照以下程序與方法進(jìn)行抑菌劑性能評(píng)價(jià),初步構(gòu)建常見彩繪文物霉菌抑菌劑的評(píng)價(jià)體系。

1) 通過測(cè)量抑菌劑的MIC和MBC值以確定其活性,其值越小,抑菌活性越高;同時(shí),根據(jù)MBC≥32MIC判別藥劑產(chǎn)生抗藥性。由此獲取抑菌劑活性及其耐藥性信息,初步確定抑菌劑種類及其濃度梯度。

2) 通過測(cè)定施加抑菌劑前后彩繪顏料表面的色差值ΔE以獲取顏色變化信息,ΔE>3.0作為顏色改變的依據(jù)。

3) 基于對(duì)霉菌孢子萌發(fā)效果抑制和霉菌菌絲體生長(zhǎng)效果抑制兩個(gè)方面來評(píng)價(jià)抑菌劑的抑菌效果,分別以EC50和抑菌圈大小表征:EC50越小,對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果越好;抑菌圈直徑越大,對(duì)霉菌菌絲體生長(zhǎng)抑制效果越好。

4) 通過測(cè)量在彩繪模擬樣品上(對(duì)實(shí)際文物,彩繪模擬樣品為原位環(huán)境下的文物彩繪)培養(yǎng)一段時(shí)間后培養(yǎng)基上的有效活菌落數(shù),換算得到可培養(yǎng)真菌濃度,以此表征抑菌劑在彩繪顏料上抑菌的長(zhǎng)效性。可培養(yǎng)真菌濃度越低,抑菌劑抑菌效果長(zhǎng)效性越好。

在初步構(gòu)建的抑菌劑評(píng)價(jià)方法體系中,前三點(diǎn)主要確定了單一霉菌的抑菌劑抑菌效果和濃度,是實(shí)驗(yàn)室初步篩選。在特定遺址中,面臨的優(yōu)勢(shì)霉菌具有特異性,受環(huán)境因素影響可能與本實(shí)驗(yàn)涉及的五種霉菌不完全相同。因此,在彩繪文物保護(hù)的實(shí)際中,要先確認(rèn)彩繪表面的是單一還是多種優(yōu)勢(shì)霉菌,存在多種優(yōu)勢(shì)霉菌時(shí)在第三點(diǎn)篩選結(jié)束后,可以根據(jù)各種霉菌的豐度,有針對(duì)性選擇多種抑菌劑進(jìn)行混劑的SR值測(cè)定,選擇后續(xù)進(jìn)行長(zhǎng)效性實(shí)驗(yàn)的組合抑菌劑配方。第四點(diǎn)長(zhǎng)效性實(shí)驗(yàn)是對(duì)于遺址原位篩選的試驗(yàn)及評(píng)價(jià),是抑菌劑性能評(píng)價(jià)中最為重要的一環(huán),本研究的長(zhǎng)效性實(shí)驗(yàn)對(duì)象是模擬彩繪樣品,環(huán)境較為穩(wěn)定,彩繪基體內(nèi)部無菌絲入侵,90 d后菌落數(shù)量就不再明顯變化。但原位環(huán)境中,抑菌劑的長(zhǎng)效性與優(yōu)勢(shì)菌株豐度和使用環(huán)境中微生物群落變遷有很大關(guān)系,每一處遺址面臨的微生物病害可能都不同,推薦延長(zhǎng)第四點(diǎn)的長(zhǎng)效性實(shí)驗(yàn)時(shí)間,能更客觀準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)抑菌劑。

3 結(jié) 論

1) 本研究初步構(gòu)建了彩繪文物抑菌劑評(píng)價(jià)程序與方法體系:通過測(cè)量抑菌劑的MIC和MBC值對(duì)其進(jìn)行初步篩選并判斷霉菌是否對(duì)抑菌劑產(chǎn)生抗藥性;依據(jù)色差值ΔE判斷抑菌劑是否會(huì)改變彩繪文物的顏色;測(cè)定抑菌劑的EC50和抑菌圈大小評(píng)估抑菌劑抑菌效果;通過彩繪模擬實(shí)驗(yàn)計(jì)算可培養(yǎng)真菌濃度從而監(jiān)測(cè)抑菌效果的長(zhǎng)效性。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2) 本研究發(fā)現(xiàn):0.15%異噻唑啉酮和戊唑醇,2%苯扎氯銨、肉桂精油和克霉唑?qū)ΤＲ娒咕舾行詮?qiáng)、抑菌效果良好;同時(shí),苯扎氯銨對(duì)五種霉菌抑菌效果的長(zhǎng)效性良好;0.2%納他霉素會(huì)引起部分顏料的顏色發(fā)生明顯變化。在實(shí)際彩繪文物保護(hù)中,面對(duì)多種優(yōu)勢(shì)霉菌,可篩選并使用具有良好協(xié)同作用的混合抑菌劑。