徐曉潔,孟曉麗,任麗宏,丁勃,2

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心,山東 濟(jì)南 250101;2.山東大學(xué)藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250012)

克拉霉素(clarithromycin)是14元環(huán)的半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,屬紅霉素的衍生物,通過阻礙核糖體50S亞基的聯(lián)結(jié),抑制蛋白質(zhì)的合成而產(chǎn)生抑菌作用。對革蘭陽性菌如葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌等均有抑制作用,對革蘭陰性菌如流感嗜血桿菌、百日咳桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌等也有抑制作用[1-3]。克拉霉素在臨床上常用于呼吸、泌尿、生殖、皮膚軟組織、幽門螺桿菌感染的治療[4-7]?？死顾氐淖畹鸵志鷿舛?MIC)為紅霉素最低抑菌濃度的對數(shù)稀釋濃度,低于或等于0.25 mg·L-1[8]?？死顾仉y溶于水,在微生物限度檢查過程中,其抗菌活性的消除或滅活存在很大的困難,常規(guī)的平皿法和薄膜過濾法均不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對試驗(yàn)菌回收率的要求[9-10]。大環(huán)內(nèi)酯酶用于微生物限度檢查方法研究時,酶解時間、酶使用量等均沒有文獻(xiàn)參考。大環(huán)內(nèi)酯酶價格高,從試驗(yàn)成本控制的角度,應(yīng)考察酶使用量在方法建立時的效果。同時,酶解時間較短,不利于抗菌活性的消除,而酶解時間長,會對產(chǎn)品中污染微生物的活性產(chǎn)生影響。因此,探索最佳的酶解時間和用量對指導(dǎo)大環(huán)內(nèi)酯酶在微生物限度檢查試驗(yàn)中的應(yīng)用具有重要意義。

本文采用高效液相色譜法,以克拉霉素片和克拉霉素顆粒為研究對象,測定經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯酶滅活后的產(chǎn)品中的克拉霉素含量變化,確定開展微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)中最佳的酶解條件,以建立更為高效、經(jīng)濟(jì)、合理的適用于克拉霉素口服制劑的微生物限度檢查方法及微生物質(zhì)量評價體系。

1 材料

1.1 儀器Waters Acquity ARC高效液相色譜儀(美國沃特世公司);MS105DU電子天平(梅特勒-托利多公司);BP211D電子天平(梅特勒-托利多公司);NU-543-600S生物潔凈安全柜(美國Nuaire公司);IF260plus恒溫培養(yǎng)箱(德國美墨爾特公司);IPP260低溫培養(yǎng)箱(德國美墨爾特公司);Equninox集菌儀(默克公司)。

1.2 菌種大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003],以上菌種均購自中國食品藥品檢定研究院醫(yī)學(xué)菌種保藏中心,工作菌種為第3代。

1.3 培養(yǎng)基和試劑胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB,批號：230107 )購自北京三藥科技有限公司;胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA,批號：1105271)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA,批號：1113621)、pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH 7.0 SCPB,批號：1104851)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC,批號：1105451)購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB,批號：20210923)、麥康凱液體培養(yǎng)基(MB,批號：20210805)購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。上述培養(yǎng)基均通過驗(yàn)收和適用性檢查。

磷酸二氫鉀(批號：20191030)、吐溫80 (批號：20210107)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;磷酸(批號： 20210303)、三乙胺(批號：20180320) 購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;乙腈(批號：UBYA2H) 購自霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司。

大環(huán)內(nèi)酯酶(批號：20220121,規(guī)格：10 U/支)購自杭州俊豐生物工程技術(shù)有限公司。

1.4 樣品克拉霉素片(批號：2201037,規(guī)格：0.25 g)來自廠家A;克拉霉素顆粒(批號：2107002、2107004、2108019,規(guī)格：0.125 g)來自廠家B。

2 方法和結(jié)果

2.1 克拉霉素酶解試驗(yàn)克拉霉素不溶于水,其含量測定供試品所用溶劑為磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀9.11 g,加水溶解并稀釋至1 000 mL,加三乙胺2 mL,用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.5)-乙腈(6∶4)。本文按《中國藥典》2020年版收載的方法,分別測定大環(huán)內(nèi)酯酶在藥典克拉霉素含量測定濃度下和微生物限度檢查相應(yīng)濃度下作用一定時間后克拉霉素的含量,以比較兩種條件下大環(huán)內(nèi)酯酶的酶解作用。

2.1.1 色譜條件色譜柱：MCI GEL CK08EH 色譜柱(8 mm×300 mm,5 μm);流動相：以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀9.11 g,加水溶解并稀釋至1 000 mL,加三乙胺2 mL,用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.5)-乙腈(600∶400)為流動相;檢測波長：210 nm;柱溫：45 ℃;流速：1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量：20 μL[11]。

2.1.2 微生物限度檢查相應(yīng)濃度下的酶解試驗(yàn)按克拉霉素片微生物限度檢查方法要求,需制備1∶100供試液1 mL轉(zhuǎn)移稀釋至500 mL稀釋液中進(jìn)行檢查,根據(jù)克拉霉素片的規(guī)格計算,該稀釋液中每1 mL含克拉霉素0.02 mg。根據(jù)以上濃度,取克拉霉素對照品適量,精密稱定,加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.02 mg的溶液,過濾后作為供試溶液A;取5 mL供試溶液A,加入10 U大環(huán)內(nèi)酯酶溶解后過濾后作為供試溶液B;另取5 mL供試溶液A,加入20 U大環(huán)內(nèi)酯酶溶解后過濾后作為供試溶液C;另取5 mL供試溶液A,加入30 U大環(huán)內(nèi)酯酶溶解后過濾后作為供試溶液D;精密量取酶解0、10、20、30、60、90、120 min的供試液A、B、C、D注入液相色譜儀,測定含量,結(jié)果見圖1。

圖1 微生物限度檢查相應(yīng)濃度下的酶解試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 藥典克拉霉素含量測定濃度下的酶解試驗(yàn)按照《中國藥典》2020年版克拉霉素含量測定,取克拉霉素對照品適量,精密稱定,加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.35 mg的溶液,過濾后作為供試溶液A;取5 mL供試溶液A,加入10 U大環(huán)內(nèi)酯酶溶解后過濾后作為供試溶液B;另取5 mL供試溶液A,加入20 U大環(huán)內(nèi)酯酶溶解后過濾后作為供試溶液C;精密量取酶解0、10、20、30、60、90、120 min 的供試液A、B、C 注入液相色譜儀,測定含量,結(jié)果見圖2。

圖2 藥典含量測定相應(yīng)濃度下的酶試驗(yàn)結(jié)果

由圖1和圖2可知,10 U和20 U大環(huán)內(nèi)酯酶用于0.02 mg·min-1和0.35 mg·min-1的克拉霉素溶液的酶解試驗(yàn),克拉霉素含量的變化趨勢基本一致。酶解反應(yīng)的前30 min克拉霉素快速酶解,呈類指數(shù)變化,30 min后酶解反應(yīng)達(dá)到平衡。同時觀察發(fā)現(xiàn)30 U大環(huán)內(nèi)酯酶用于0.02 mg·min-1供試品時,與10 U和20 U濃度大環(huán)內(nèi)酯酶相比無顯著差異。使用30 U大環(huán)內(nèi)酯酶酶解供試品溶液時,溶液渾濁,過濾困難。從酶解效果和試驗(yàn)經(jīng)濟(jì)性的角度出發(fā),不再比對30 U大環(huán)內(nèi)酯酶用于微生物限度檢查的試驗(yàn)。

10 U和20 U大環(huán)內(nèi)酯酶用于克拉霉素酶解試驗(yàn)時,克拉霉素的剩余量在酶解時間30 min 和120 min沒有顯著差異,但酶解時間為30 min時,大環(huán)內(nèi)酯酶20 U對克拉霉素的酶解率好于大環(huán)內(nèi)酯酶10 U。而在微生物限度檢查所對應(yīng)的0.02 mg·min-1克拉霉素濃度體系下,克拉霉素在10 U和20 U大環(huán)內(nèi)酯酶酶解30 min后,剩余含量沒有顯著性差異。同時,由于藥品微生物限度檢查要求從供試品制備到加入培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程不能超過60 min,需控制大環(huán)內(nèi)酯酶的酶解時間以滿足下游薄膜過濾試驗(yàn)的時間要求。因此,本文分別采用10 U和20 U大環(huán)內(nèi)酯酶,酶解時間20 min的反應(yīng)條件用于指導(dǎo)微生物限度試驗(yàn),既保證大環(huán)內(nèi)酯酶達(dá)到最佳酶解效果,也滿足微生物限度檢查對時間的要求和對潛在污染菌的保護(hù)。

2.2 微生物限度檢查

2.2.1 菌液制備按《中國藥典》2020年版(四部),分別制備每1 mL含103～104cfu和不大于100 cfu的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液,用于方法適用性試驗(yàn)[12]。

2.2.2 供試液制備克拉霉素口服制劑的需氧菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為103cfu·g-1,當(dāng)檢驗(yàn)量為0.001 g(1∶1 000供試液1 mL),檢驗(yàn)結(jié)果存在較大的誤判風(fēng)險,因此供試液按下述方法制備：取供試品10 g,加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL,震蕩混合均勻,制成1∶10供試液,用同一稀釋液10倍梯度稀釋制成1∶100和1∶500供試液。

2.2.3 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.2.3.1 試驗(yàn)組方法1：取1∶10、1∶100和1∶500供試液10 mL,分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌懸液0.1 mL,使每1 mL供試液中含菌數(shù)不大于100 cfu,按平皿法(傾注法)培養(yǎng)計數(shù)。

方法2：取1∶100供試液1 mL,加入500 mL pH 7.0無菌蛋白胨-緩沖液,并以pH 7.0無菌蛋白胨-緩沖液作為沖洗液,沖洗量分別為300、500、1 000 mL,每次100 mL/膜,最后一次沖洗液中加入1 mL金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌懸液,每張濾膜含菌量不大于100 cfu,按薄膜過濾法培養(yǎng)計數(shù)。

方法3：取1∶100供試液1 mL,加入500 mL pH 7.0無菌蛋白胨-緩沖液(含大環(huán)內(nèi)酯酶10 U或20 U),并以pH 7.0無菌蛋白胨-緩沖液作為沖洗液,沖洗量為300 mL,每次100 mL/膜,最后一次沖洗液中加入1 mL金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌懸液,每張濾膜含菌量不大于100 cfu,按薄膜過濾法培養(yǎng)計數(shù)。

方法4：取1∶100供試液1 mL,加入500 mL pH 7.0無菌蛋白胨-緩沖液中,過濾至無菌濾器,以pH 7.0 SCPB作為沖洗液,沖洗量分別為300 mL,每次100 mL/膜,最后一次沖洗液中加入大環(huán)內(nèi)酯酶(10 U或20 U)作用20 min,然后分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌懸液或孢子懸液,每張濾膜含菌量不大于100 cfu,按薄膜過濾法培養(yǎng)計數(shù)。

2.2.3.2 供試品組取相應(yīng)稀釋級供試液,用緩沖液代替菌液,按試驗(yàn)組進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.3.3 菌液組用緩沖液代替供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

2.2.3.4 中和劑對照組用含大環(huán)內(nèi)酯酶的緩沖液代替供試液,按試驗(yàn)組進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.4 試驗(yàn)結(jié)果取克拉霉素片和克拉霉素顆粒,分別按照上述供試液制備方法和方法1～4開展適用性試驗(yàn),對各試驗(yàn)菌逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。平皿法先選擇低稀釋級的供試液,再選擇較高稀釋級的供試液。薄膜過濾法先后采用300、500、1 000 mL沖洗量和加入大環(huán)內(nèi)酯酶滅活的方法進(jìn)行回收試驗(yàn),結(jié)果見表1和表2。

表1 克拉霉素片需氧菌總數(shù)回收試驗(yàn)結(jié)果

表2 克拉霉素顆粒需氧菌總數(shù)回收試驗(yàn)結(jié)果

未使用大環(huán)內(nèi)酯酶時,需氧菌總數(shù)的檢查可選擇1∶100供試液,采用薄膜過濾法,分別采用沖洗量為500、800、1 000 mL,經(jīng)試驗(yàn)沖洗量為1 000 mL時,金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均在藥典規(guī)定的0.5～2.0范圍內(nèi)。以大環(huán)內(nèi)酯酶作為中和劑時,需氧菌總數(shù)應(yīng)選擇1∶100的供試液,采用薄膜過濾法,沖洗量為300 mL,最后一次沖洗液中加入約10 U和20 U的大環(huán)內(nèi)酯酶作用20 min,金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均在藥典規(guī)定的0.5～2.0范圍內(nèi),中和劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)的比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)。其他方法組合均不能使5種試驗(yàn)菌的回收比值同時在0.5～2.0范圍內(nèi)。

2.3 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗(yàn)取克拉霉素片和克拉霉素顆粒的1∶10供試液,按平皿法(傾注法)開展霉菌和酵母菌總數(shù)的方法適用性試驗(yàn),白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均在藥典規(guī)定的0.5～2.0范圍內(nèi)。

2.4 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn)克拉霉素片和克拉霉素顆粒為非無菌口服給藥制劑,按《中國藥典》2020年版通則1107要求,應(yīng)檢查大腸埃希菌[12]。取1∶10供試液10 mL采用薄膜過濾法時,極易造成濾膜堵塞,無法完成過濾和沖洗,本文采用直接接種法和直接接種法聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯酶的方法開展方法適用性試驗(yàn)。

2.4.1 試驗(yàn)組方法1：取1∶10供試液10 mL,及不大于100 cfu的大腸埃希菌菌懸液1 mL,一并接種至1 000、2 000、4 000 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)中,按《中國藥典》2020年版(四部)1106進(jìn)行大腸埃希菌檢查。

方法2：取1∶10供試液10 mL,及不大于100 cfu的大腸埃希菌菌懸液1 mL,一并接種至500 mL和1 000 mL含大環(huán)內(nèi)酯酶(10 U或20 U)TSB中,按《中國藥典》2020年版(四部)1106進(jìn)行大腸埃希菌檢查。

2.4.2 陰性對照組取稀釋液10 mL,照試驗(yàn)組同法操作。

2.4.3 試驗(yàn)結(jié)果對克拉霉素片和克拉霉素顆粒的大腸埃希菌檢查方法進(jìn)行適用性試驗(yàn),結(jié)果見表3。所有試驗(yàn)組中,僅在1 000 mL含20 U大環(huán)內(nèi)酯酶的TSB培養(yǎng)體系下,檢出所加大腸埃希菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。

表3 大腸埃希菌檢查適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 大環(huán)內(nèi)酯酶的應(yīng)用在磷酸鹽-乙腈的流動相體系下,添加10 U和20 U大環(huán)內(nèi)酯酶的克拉霉素酶解試驗(yàn)均在約30min達(dá)到酶促反應(yīng)的動態(tài)平衡,20 U的酶解效率略高于10 U濃度下。為驗(yàn)證大環(huán)內(nèi)酯酶在克拉霉素供試液中的酶解作用,本文在開展克拉霉素制品微生物限度檢查時將大環(huán)內(nèi)酯酶的使用量設(shè)定為10 U和20 U。滅活時間的確定主要從滅活效果和對微生物限度檢查總時間的影響兩方面考量,滅活時間試驗(yàn)結(jié)果表明,超過30 min試驗(yàn)結(jié)果相較于20 min結(jié)果,酶解并未顯著增加,因此設(shè)定大環(huán)內(nèi)酯酶在沖洗液中的作用時間為20 min,該條件還可確保微生物限度檢查時間符合藥典相關(guān)要求。大環(huán)內(nèi)酯在磷酸鹽-乙腈的流動相體系下對克林霉素的滅活效果雖不能完全反映其在pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液的作用效果,但是在一定程度上為微生物限度檢查中大環(huán)內(nèi)酯酶的使用量和反應(yīng)時間,提供了理論依據(jù)。

3.2 大環(huán)內(nèi)酯類制品抗菌活性的去除和滅活《中國藥典》2020年版通則1105收載的用于供試品中抗菌活性的去除或滅活的方法主要是增加稀釋液或培養(yǎng)基體積,加入適宜的中和劑或滅活劑,采用薄膜過濾法,以及幾種方法的聯(lián)合使用[12]。克拉霉素因其廣譜的抗菌性、低溶解性和穩(wěn)定性,在相關(guān)制劑微生物限度檢查中,消除或者滅活其抗菌活性的方法需借助大量沖洗方法,而口服制劑的需氧菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為103cfu·g-1,通過制備最高稀釋級供試液來降低單位體積供試液抗菌活性的平皿法,仍不能達(dá)到符合藥典要求的試驗(yàn)菌回收比值。薄膜過濾法需控制沖洗液體積達(dá)藥典規(guī)定的上限沖洗量1 000 mL,在最后一次沖洗液中加入試驗(yàn)菌,回收率方可達(dá)到要求,而大劑量的沖洗增加了對污染微生物的損傷作用。本文采用薄膜過濾法結(jié)合大環(huán)內(nèi)酯酶解作用的方法,可將沖洗量有效控制在300 mL內(nèi),不僅提高了克拉霉素相關(guān)制劑的微生物限度檢驗(yàn)效率,也降低了因長時間操作和大量沖洗引入的污染風(fēng)險及對微生物的損傷。大環(huán)內(nèi)酯酶在大腸埃希菌檢查中也取得了很好的效果,1 000 mL含大環(huán)內(nèi)酯酶20 U的TSB,即可消除供試品中克拉霉素對大腸埃希菌的抑制作用,從試驗(yàn)效果、工作量、經(jīng)濟(jì)性等角度考慮,無疑都是最佳方案。

《中國藥典》2020年版對供試品中可能存在的干擾物給出了所對應(yīng)的中和劑或滅火方法,含抗生素類的供試品,如喹諾酮類抗生素可被鎂或鈣離子絡(luò)合而失去活性、磺胺類抗生素可被對氨基苯甲酸作用失活,β-內(nèi)酰胺類抗生素可被青霉素酶或頭孢菌素酶滅活等,但大環(huán)內(nèi)酯類抗生素并未給出相適用的滅活劑,含聚山梨酯80和卵磷脂的稀釋液和沖洗液也已被證明無法消除大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的抗菌活性[12]。低速離心制備供試液的方法,可以減少聯(lián)合薄膜過濾法時濾膜上截留的供試品,但該方法已在《中國藥典》2015年版后刪除[13]。牛萌萌等[14]建立了阿奇霉素和羅紅霉素干混懸劑的微生物限度檢查方法,采用含乙醇的緩沖液作為稀釋液和沖洗液來增加兩種供試品的溶解,但乙醇在供試液制備過程中是否對潛在污染菌造成損傷尚需驗(yàn)證。傳統(tǒng)的酶解中和試驗(yàn)在微生物限度檢查中的應(yīng)用較粗獷,往往以使用大量的酶制劑以獲得理想的微生物回收結(jié)果為主要目的,而酶使用量、酶作用時間等因素均未考慮。大環(huán)內(nèi)酯酶是最新出現(xiàn)的可以酶解阿奇霉素的酶制劑,還未有其用于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素制劑微生物限度檢查的相關(guān)研究[1,15]。

本文通過HPLC法測定大環(huán)內(nèi)酯酶對克拉霉素的作用過程,掌握了大環(huán)內(nèi)酯酶的最佳作用條件并將其應(yīng)用于克拉霉素相關(guān)制劑的微生物限度檢查,建立了以酶解法作為中和方法的克拉霉素相關(guān)制劑微生物限度檢查方法,同時,也為建立適用于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)品最佳的微生物限度或無菌檢查方法提供了新的思路和技術(shù)方法。