張曉蕓，孫星宇，楊政，徐禮友，谷琴，王曉晨，丁逸梅，2

（1.南京工業(yè)大學(xué)江蘇省藥物研究所，南京 210009； 2.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京 211816；3.江蘇海智生物醫(yī)藥有限公司，南京 210018； 4.山東食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，濟(jì)南 250022）

膠原蛋白在祛瘢痕和祛皺、皮膚屏障修復(fù)保濕、傷口敷料、創(chuàng)面止血等方面具有顯著療效，成為近年來醫(yī)療器械研究用重要的生物材料[1-15]。市售的膠原蛋白大都是從動(dòng)物結(jié)締組織中提取得到的動(dòng)物源膠原蛋白，而動(dòng)物源膠原蛋白屬于非同源物質(zhì)，與人源膠原蛋白存在差異，主要表現(xiàn)為活性低甚至無活性，可能含有動(dòng)物源病毒，易引起過敏等諸多缺陷[16]。重組人源化膠原蛋白是由DNA 重組技術(shù)制備的人源化膠原蛋白特定型基因編碼的全長或部分氨基酸序列片段，或含人膠原蛋白功能片段組合[17]，具有高生物活性性，透皮吸收率高，促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、生長和分化等功能，無病毒隱患，低免疫反應(yīng)，水溶性好，易于做成各種劑型。人源膠原蛋白有Ⅰ、ⅠⅠ、ⅠⅠⅠ、V 和XⅠ型，正常皮膚組織中主要以Ⅰ型和ⅠⅠⅠ型存在，其中III型人源膠原蛋白大量存在于嬰幼兒的皮膚、血管內(nèi)膜和腸道中。ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白具有延緩皮膚衰老，增加皮膚彈性和修復(fù)組織創(chuàng)傷等應(yīng)用。而隨著年齡的增長，ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白在人體中逐漸流失，因此皮膚出現(xiàn)松弛、皺紋和瘢痕等各種衰老現(xiàn)象。

ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白結(jié)構(gòu)為單鏈結(jié)構(gòu)，基本重復(fù)單元為GERGAPGFRGPAGPN-GⅠPGEKGPAGERGAP，為人膠原蛋白ⅠⅠⅠ型肽段，末端序列為PCCGGG，呈現(xiàn)164.88°的柔性彎曲結(jié)構(gòu)，被證實(shí)擁有人天然膠原蛋白典型的三螺旋構(gòu)象的膠原蛋白。目前市場上出現(xiàn)眾多以ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白為原材料的醫(yī)療器械產(chǎn)品，而國家尚未發(fā)布該類產(chǎn)品中重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白含量檢測(cè)方法，且文獻(xiàn)報(bào)道較少[19]。目前膠原蛋白含量測(cè)定的技術(shù)手段主要包括高效液相色譜法、紫外分光光度法、羥脯氨酸比色法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELⅠSA）法等[18-23]。對(duì)于膠原蛋白的檢測(cè)比較困難，且缺少直接測(cè)定方法，羥脯氨酸為膠原蛋白特異性氨基酸，通過水解膠原蛋白測(cè)定羥脯氨酸（Hyp）的含量可以確定膠原蛋白的含量。重組人源膠原蛋白為DNA 基因重組合成，其氨基酸組成不含羥脯氨酸。

篩選出重組人源膠原蛋白中合適的氨基酸代替羥脯氨酸，通過測(cè)定該氨基酸含量折算出膠原蛋白的含量，從而建立重組人源ⅠⅠⅠ型膠原蛋白修復(fù)凝膠中膠原蛋白含量測(cè)定方法，為該產(chǎn)品膠原蛋白的含量測(cè)定提供質(zhì)控依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-2010CHT 型，附帶LC Solution 工作站，日本島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

電子分析天平：（1）BSA224S 型，感量為0.1 mg；（2）QUⅠNTⅠX35-1CN 型，感量為0.01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9070A 型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

恒溫水浴鍋：HH-6 型，常州國華電器有限公司。

超純水機(jī)：PURELAB flex2型，威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司。

鹽酸：分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司。

磷酸二氫鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

乙腈：色譜純，霍尼韋爾（中國）有限公司。

氫氧化鈉：分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司。

無水碳酸鈉：工作基準(zhǔn)試劑，天津市化學(xué)試劑研究所有限公司。

碳酸氫鈉：分析純，阿拉丁生化科技股份有限公司。

三水合乙酸鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2，4-二硝基氟苯：分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司。

脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)為111578-50 mg，批號(hào)為111578-201602，中國食品藥品檢定研究院。

甘氨酸：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

L-丙氨酸：分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司。

重組人源ⅠⅠⅠ型膠原蛋白：蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究有限公司。

重組人源ⅠⅠⅠ型膠原蛋白修復(fù)凝膠樣品：批號(hào)分別為20221031、20221214、20230202，江蘇海智生物醫(yī)藥有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，威立雅超純水儀制得。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Kromasil 100-5 型C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm；諾力昂新材料(蘇州)有限公司]；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長為360 nm；流動(dòng)相：A相為0.05 mol/L乙酸銨溶液，B相為乙腈，流量為1.0 mL/min；梯度洗脫程序：0～5 min，A體積分?jǐn)?shù)為95%，10～15 min A體積分?jǐn)?shù)為80%→50%，17～18 min A體積分?jǐn)?shù)為50%→95%，30 min A體積分?jǐn)?shù)為95%。

1.3 溶液配制

脯氨酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：200 μg/mL，精密稱取脯氨酸對(duì)照品10 mg，置于50 mL 容量瓶中，加入6 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻。

脯氨酸對(duì)照品溶液：20 μg/mL，精密量取質(zhì)量濃度為200 μg/mL 脯氨酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入6 mol/L鹽酸溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻。

樣品溶液：精密稱取重組人源膠原蛋白修復(fù)凝膠4 g，置于20 mL頂空瓶中，加入6 mol/L鹽酸溶液5 mL，再置于110 ℃烘箱中，加熱水解24 h，取出放冷至室溫，使用中性濾紙過濾（濾紙上加入適量直徑3～4 mm 實(shí)驗(yàn)用玻璃珠），全部轉(zhuǎn)移置于20 mL 容量瓶中，用水清洗3 次，加入12 mol/L 氫氧化鈉溶液2.6 mL，混勻，放冷至室溫后，加水定容至標(biāo)線，搖勻。

磷酸鹽緩沖液：pH值為7.0，稱取6.8 g磷酸二氫鉀，置于1 L容量瓶中，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液291 mL，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻。

空白溶液：精密稱取空白凝膠4 g，置于20 mL頂空瓶中，與樣品溶液制備同法操作。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 衍生化反應(yīng)

精密量取脯氨酸對(duì)照品溶液和樣品溶液各2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入1 mol/L碳酸氫鈉溶液1.0 mL、0.5 mol/L 碳酸鈉溶液0.5 mL、1%DNFB 乙腈溶液100 μL，避光，于60 ℃下恒溫水浴中保溫1 h，取出，放至室溫后，加入適量的磷酸鹽緩沖液稀釋至標(biāo)線，搖勻。

1.4.2 重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白中脯氨酸的含量計(jì)算

重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白結(jié)構(gòu)為單鏈結(jié)構(gòu)基本重復(fù)單元為GERGAPGFRGPAGPNGⅠPG-EKGPAG ERGAP，為人膠原蛋白ⅠⅠⅠ型肽段，末端序列為PCCGGG。根據(jù)國泰生物多肽分子量計(jì)算器將末端序列作為C 段序列計(jì)算重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為26 126，含有55 個(gè)脯氨酸殘基，計(jì)算出脯氨酸含量為24.24%。

1.4.3 測(cè)定

取衍生化反應(yīng)后的脯氨酸對(duì)照品溶液及樣品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中脯氨酸的含量。按照重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白中脯氨酸的含量，折算為膠原蛋白的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化條件的優(yōu)化

2.1.1 氨基酸的選擇

ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白結(jié)構(gòu)為單鏈結(jié)構(gòu)基本重復(fù)單元為GERGAPGFRGPAGPN-GⅠPGEKGPAGERGAP，為人膠原蛋白ⅠⅠⅠ型肽段，末端序列為PCCGGG。根據(jù)氨基酸序列，ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白不含羥脯氨酸；含量較高的氨基酸分別為甘氨酸，丙氨酸、脯氨酸。羥脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸對(duì)照品、重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白、重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白修復(fù)凝膠、空白凝膠高效液相色譜圖見圖1。由圖1 可知，重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白中未檢出羥脯氨酸；而甘氨酸和丙氨酸分別受空白凝膠干擾，脯氨酸含量較高且不受空白凝膠干擾，專屬性良好，因此選擇脯氨酸作為重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白修復(fù)凝膠中膠原蛋白含量測(cè)定的特征氨基酸。

圖1 羥脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸對(duì)照品、重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白、重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白修復(fù)凝膠、空白凝膠高效液相色譜圖

2.1.2 衍生化試劑2，4-二硝基氟苯的用量考察

采用2，4-二硝基氟苯（DNFB）與脯氨酸在堿性環(huán)境下衍生化生成DNFB-脯氨酸，該反應(yīng)為可逆反應(yīng)，衍生化試劑的用量過少則衍生化不完全，用量過多易產(chǎn)生逆向反應(yīng)。分別使用80、90、100、110、120 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的DNFB 乙腈溶液進(jìn)行試驗(yàn)，考察DNFB 用量對(duì)響應(yīng)值的影響，不同體積1%的DNFB 乙腈溶液對(duì)應(yīng)色譜峰面積見圖2。由圖2 可知，1% DNFB 乙腈溶液體積為100 μL 時(shí)色譜峰面積最大。

圖2 衍生化試劑不同用量對(duì)應(yīng)的色譜峰面積

2.1.3 衍生化環(huán)境pH的考察

采用DNFB與脯氨酸在堿性環(huán)境下衍生化生成DNFB-脯氨酸，該反應(yīng)為可逆反應(yīng)，酸性條件不利于衍生化反應(yīng)；強(qiáng)堿性條件下DNFB-脯氨酸水解，也不利于衍生化反應(yīng)。分別在pH值為7.2、7.9、8.3、8.5、9.1、9.5、10 條件下進(jìn)行試驗(yàn)，考察pH 值對(duì)響應(yīng)值的影響，不同pH值對(duì)應(yīng)的色譜峰面積見圖3。由圖3可知，pH控制在8.5～9.0之間DNFB-脯氨酸的響應(yīng)值最大。

圖3 不同pH值對(duì)應(yīng)的色譜峰面積

2.1.4 衍生化溫度的考察

采用DNFB與脯氨酸在堿性環(huán)境下衍生化生成DNFB-脯氨酸，該反應(yīng)需要提供一定能量才能產(chǎn)生衍生化反應(yīng)。分別選擇衍生化溫度為50、60、70 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，考察溫度對(duì)響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明，該反應(yīng)從60 ℃起衍生化趨于平穩(wěn)，說明溫度60 ℃能夠滿足衍生化需要的反應(yīng)能量，因此選擇衍生化溫度為60 ℃。

2.1.5 衍生化時(shí)間的考察

考察60 ℃條件下加熱時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明，當(dāng)加熱時(shí)間為40～90 min 時(shí)，DNFB-脯氨酸的衍生化趨于平穩(wěn)，說明加熱時(shí)間不是關(guān)鍵因素，且加熱超時(shí)不會(huì)發(fā)生逆向反應(yīng)，雖然40 min反應(yīng)已經(jīng)平衡，但考慮凝膠基體復(fù)雜性，仍然選擇衍生化時(shí)間為60 min。

2.2 水解時(shí)長的優(yōu)化

膠原蛋白充分水解，且水解后的脯氨酸在高溫濃酸的環(huán)境下穩(wěn)定是本次研究的前提條件，重點(diǎn)篩選出在110 ℃條件下使用6 mol/L 鹽酸溶液水解膠原蛋白消耗的時(shí)長。分別選擇水解時(shí)間為1、2、4、7、13、19、24、28 h，考察膠原蛋白的水解情況，同時(shí)可以直觀反映脯氨酸在高溫酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，膠原蛋白在24 h內(nèi)水解完全，且超出24 h后脯氨酸仍保持穩(wěn)定，未見明顯降解，因此選用水解時(shí)長為24 h。

2.3 色譜條件的選擇

分別選擇檢測(cè)波長為（360±2） nm、柱溫為（30±2） ℃、流動(dòng)相流量為（1.0±0.2） mL/min進(jìn)行試驗(yàn)，考察分析條件波動(dòng)下對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，以上分析條件下重組人源膠原蛋白修復(fù)凝膠中膠原蛋白含量波動(dòng)均低于±2%，說明波長、柱溫和流量的微小波動(dòng)對(duì)重組人源膠原蛋白修復(fù)凝膠中膠原蛋白含量測(cè)定的影響較低。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取脯氨酸對(duì)照品、修復(fù)凝膠樣品和空白衍生化溶液各10 μL，按1.2色譜條件測(cè)定。樣品、對(duì)照品衍生化溶液在脯氨酸-BNBF處有相同保留時(shí)間為10.8 min，空白溶液對(duì)羥脯氨酸測(cè)定無干擾，結(jié)果表明該法專屬性良好。脯氨酸-DNBF衍生物理論塔板數(shù)大于5 000，脯氨酸-DNBF 衍生物峰拖尾因子為1.0，與相鄰峰分離度均大于1.5。衍生化溶液的高效液相色譜圖見圖4。

圖4 衍生化溶液高效液相色譜圖

2.5 線性關(guān)系

分別精密量取脯氨酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為10、16、20、24、40 μg/mL的脯氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行衍生化。分別精密量取上述溶液，注入液相色譜儀，用該方法測(cè)定，以脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得到線性方程：y=6.469×104x+1.577×103，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 6。結(jié)果表明，脯氨酸溶液的質(zhì)量濃度在10～40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一批號(hào)重組人源膠原蛋白修復(fù)凝膠進(jìn)行水解并衍生化，平行配制6 份樣品溶液，按1.2 色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，按脯氨酸對(duì)照計(jì)算脯氨酸含量，再根據(jù)脯氨酸的含量折算膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 重組人源膠原蛋白修復(fù)凝膠樣品精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，測(cè)定均值為0.138 6 mg/g（n=6），測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.85%，表明該方法的精密度良好。

2.7 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密量取空白凝膠4 g，置于20 mL 頂空瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為60、80、100 μg/mL 膠原蛋白（PA2208S003 批，脯氨酸含量為24.24%），每個(gè)濃度平行配制3份，水解和衍生化后測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 重組人源膠原蛋白修復(fù)凝膠樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，樣品加標(biāo)平均回收率為95.68%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于重組人源ⅠⅠⅠ型膠原蛋白修復(fù)凝膠中膠原蛋白含量測(cè)定。

2.8 溶液穩(wěn)定性

在室溫條件下，分別取脯氨酸對(duì)照品衍生化溶液、樣品衍生化溶液，分別于0、1、2、4、8、12、16、20、24 h，注入高效液相色譜儀測(cè)定，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于1%，表明脯氨酸對(duì)照品衍生物和修復(fù)凝膠水解衍生物在室溫條件下放置0～24 h穩(wěn)定。

3 結(jié)語

采用高效液相色譜法建立了重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白修復(fù)凝膠中膠原蛋白含量的方法。分析重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白的氨基酸序列以及專屬性定位，篩選出脯氨基酸作為重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白含量測(cè)定的特征氨基酸。以HPLC法測(cè)定樣品中脯氨酸含量，再進(jìn)行分子量折算得到膠原蛋白含量。選擇衍生化條件為110 ℃，水解時(shí)間為24 h，衍生化弱堿條件為pH 8.5～9.0，衍生化試劑為100 μL 1%DNFB乙腈溶液，衍生化溫度為60 ℃保溫1 h，所得到的修復(fù)凝膠中膠原蛋白含量最高。結(jié)果表明，所建方法專屬性強(qiáng)、科學(xué)合理，能比較客觀地反映修復(fù)凝膠中脯氨酸的含量，從而較客觀地反映膠原蛋白含量，可用于修復(fù)凝膠中膠原蛋白含量的測(cè)定。該研究結(jié)果可為形成重組ⅠⅠⅠ型人源膠原蛋白各類制劑的制定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。