崔俊鳳，梁秀坤，崔帥，夏方亮

（濱州市檢驗檢測中心，濱州市化學(xué)藥物研發(fā)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東濱州 256600）

小柴胡片的質(zhì)量標準收載于《中華人民共和國藥典（2020年版）》一部[1]，由柴胡、黃芩、甘草、黨參、生姜、姜半夏、大棗共七味藥材組成，具有解表散熱、舒肝和胃的功效，臨床用于治療外感病邪犯少陽癥。現(xiàn)行標準中僅規(guī)定了黃芩中黃芩苷的含量測定、黨參的顯微鑒別和甘草的薄層鑒別，未對處方中含量較高的柴胡、甘草、黨參、生姜中的指標成分的進行含量測定，不能全面控制小柴胡片的生產(chǎn)工藝流程、參數(shù)和內(nèi)在質(zhì)量。文獻中只涉及了黃芩苷、柴胡皂苷a、6-姜辣素的單一成分的含量測定[2-4],尚未查詢到小柴胡片中多種指標成分同時進行含量測定的文獻。

為了全面地評價和控制小柴胡片的質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜二極管陣列檢測器（HPLCDAD）同時測定該制劑中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、黨參炔苷、甘草苷、甘草酸、6-姜辣素10個指標成分的含量，測定方法儀器普及率高，可操作性強，為全面控制小柴胡片的質(zhì)量、保證該藥物的療效奠定良好的基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent-1260 型，配有DAD檢測器，安捷倫科技（中國）有限公司。

電子分析天平：XSE205DU型，感量0.01 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

小柴胡片樣品：規(guī)格0.4 g/片，（1）批號分別為20030001、20060002、21080002，太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司；（2）批號分別為200402、201101、210606，國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司。

10種對照品信息見表1。

表1 10種對照品信息

甲醇、乙腈：色譜純，默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

磷酸：優(yōu)級純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

乙醇、氨水：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

柴胡、黃芩、黨參、甘草、大棗對照藥材：中國食品藥品檢驗研究院。

姜半夏、生姜對照藥材：山東沐澤中藥飲片有限公司。

實驗用水：純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Venusil XBP C18（L）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；進樣體積：5 μL；檢測波長：210、237、280 nm；流動相：A 相為乙腈，B 相為0.1%磷酸溶液，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗滌程序

1.3 溶液制備

1.3.1 混合對照品貯備溶液

取上述10種對照品適量，置于同一50 mL容量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理10 min，放至室溫，加入甲醇至標線，搖勻。各成分質(zhì)量濃度分別為黃芩苷1.876 4 mg/mL、漢黃芩苷0.693 2 mg/mL、黃芩素0.351 2 mg/mL、漢黃芩素0.140 4 mg/mL、柴胡皂苷a 0.306 3 mg/mL、柴胡皂苷d 0.311 8 mg/mL、甘草苷0.258 4 mg/mL、甘草酸0.907 4 mg/mL、6-姜辣素0.053 2 mg/mL、黨參炔苷0.057 3 mg/mL。

1.3.2 系列混合標準溶液

精密量取混合對照品貯備液0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mL，分別置于10 mL 溶量瓶中，用甲醇定容至標線，搖勻。其中黃芩苷的質(zhì)量濃度分別為0、0.018 8、0.093 8、0.187 6、0.938 2、1.876 4 mg/mL；漢黃芩苷的質(zhì)量濃度分別為0、0.006 9、0.034 7、0.069 3、0.346 6、0.693 2 mg/mL；黃芩素的質(zhì)量濃度分別為0、0.003 5、0.017 6、0.035 1、0.175 6、0.351 2 mg/mL；漢黃芩素的質(zhì)量濃度分別為0、0.001 4、0.070 2、；0.014 0、0.070 2、0.140 4 mg/mL；柴胡皂苷a 的質(zhì)量濃度分別為0、0.003 1、0.015 3、0.030 6、0.153 2、0.306 3 mg/mL；柴胡皂苷d質(zhì)量濃度分別為0、0.003 1、0.015 6、0.031 2、0.155 9、0.311 8 mg/mL；甘草苷質(zhì)量濃度分別為0、0.002 6、0.012 9、0.025 8、0.129 2、0.258 4 mg/mL；甘草的酸質(zhì)量濃度分別為0、0.009 1、0.045 4、0.090 7、0.453 7、0.907 4 mg/mL；6-姜辣素的質(zhì)量濃度分別為0、0.000 5、0.002 7、0.005 3、0.026 6、0.053 2 mg/mL；黨參炔苷質(zhì)量濃度分別為0、0.000 6、0.002 9、0.005 7、0.028 7、0.057 3 mg/mL。

1.3.3 樣品溶液

取小柴胡片樣品10 片，稱定質(zhì)量，研細，混勻，取約0.4 g，精密稱定，精密加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，于30 ℃水溫下超聲處理（功率500 W，頻率80 kHz）30 min，放至室溫，用5%濃氨試液的甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，過濾，濾液備用，濾渣精密加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，過濾。取上述濾液等體積混合，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過。

1.3.4 陰性樣品溶液

按照小柴胡片的處方組成及制備工藝，以1.3.3方法，分別制備缺柴胡、缺黃芩、缺黨參、缺甘草、缺生姜的5份不同的陰性樣品溶液。

1.4 實驗方法

取系列混合標準溶液、樣品溶液和陰性樣品溶液按1.2色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積，建立指標成分的標準工作曲線，計算線性方程，利用標準曲線法計算樣品中各指標成分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長

結(jié)合《中華人民共和國藥典（2020年版）》一部[1]和文獻[2-17]，以及通過DAD 檢測器在196～400 nm 掃描，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 在210 nm 波長處有最大吸收，甘草苷、甘草酸在237 nm 波長處有最大吸收。黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素在280 nm波長處有最大吸收，在充分比較了黨參炔苷、6-姜辣素在267、280、286 nm處的吸收圖譜和陰性藥品溶液的吸收圖譜后，選擇采用280 nm作為二者的檢測波長，因此檢測波長最終確定為210、237、280 nm，一方面能夠保證各指標成分均有較大吸收，另一方面可以排除干擾，提高檢測靈敏度，使含量測定結(jié)果更加準確。

2.1.2 流動相的選擇

分別考察了包括乙腈-磷酸溶液、乙腈-磷酸二氫鉀溶液、甲醇-磷酸溶液、甲醇-磷酸三乙胺溶液等[5-17]不同流動相的洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫時色譜圖基線保持平穩(wěn)，并且各目標色譜峰的對稱性、分離度、理論塔板數(shù)更理想，陰性樣品相應(yīng)色譜峰處無干擾。

2.1.3 進樣體積、體積流量、柱溫

試驗采用Agilent1260色譜儀（配置二極管陣列檢測器）、Venusil XBP C18（L）色譜柱，分別考察不同進樣體積（5、10、20 μL）、不同流動相流量（0.8、1.0 mL/min）、不同柱溫（20、25、30 ℃）下同一份樣品溶液中各目標成分的含量測定值，結(jié)果見表3。

表3 不同進樣體積、體積流量、柱溫對應(yīng)的含量測定結(jié)果

由表3 可知，測定結(jié)果均無明顯變化?？紤]到圖譜的優(yōu)化，選擇進樣體積為5 μL，流動相流量為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃。

2.2 評價指標選擇

小柴胡片的質(zhì)量標準僅對黃芩中的黃芩苷進行了含量規(guī)定，單一成分的測定不能全面評價小柴胡片中單味藥材的投料等級，難以控制不同批次藥品的生產(chǎn)質(zhì)量，不能保證臨床療效。

以柴胡、黃芩、黨參、甘草、生姜中的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、黨參炔苷、甘草苷、甘草酸和6-姜辣素10種成分作為質(zhì)量控制的評價指標，可以有效地控制小柴胡片中的5 味藥材質(zhì)量，并且為提升質(zhì)量標準提供了依據(jù)。

2.3 提取方法的選擇

根據(jù)小柴胡片的制備工藝和10 種指標成分的溶解特性，實驗采用5%濃氨試液的甲醇溶液、70%乙醇溶液進行超聲和加熱回流各30、45、60 min 進行提取，樣品溶液中各指標成分的含量測定結(jié)果見表4。

表4 不同提取方法含量測定結(jié)果 mg/片

由表4 可知，選擇5%濃氨試液的甲醇溶液30 ℃水溫超聲提取30 min 和70%乙醇溶液加熱回流提取60 min，等體積混合提取液作為樣品溶液，該提取方法各成分能最大程度同時被有效提取，并且操作簡單，能夠更加準確地對各成分進行含量測定。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

吸取系列混合標準溶液、樣品溶液和陰性樣品溶液，在1.2色譜條件下，按照2.1.1檢測波長進樣測定，色譜圖分別如圖1～圖3所示。

圖1 混合標準溶液液相色譜圖

圖2 樣品溶液液相色譜圖

圖3 陰性樣品溶液液相色譜圖

從圖1～圖3中可以發(fā)現(xiàn)，樣品溶液檢測的各指標成分均達到基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以各成分峰計，均大于5 000。陰性樣品溶液的色譜圖均未出現(xiàn)相應(yīng)保留時間的色譜峰，樣品溶液的含量測定未出現(xiàn)干擾成分，各成分的測定專屬性強，同時，采用光電二極管陣列檢測器對各成分進行紫外光譜掃描和峰純度檢測，10種指標成分紫外吸收光譜和相應(yīng)的對照品吸收圖譜完全一致，峰純度因子均大于1 000。

2.5 線性關(guān)系和定量限

取系列混合標準溶液，在1.2 色譜條件下進樣測定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標（x），色譜峰面積為縱坐標（y）進行回歸，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。以信噪比10 對應(yīng)組分的質(zhì)量濃度作為定量限。10種目標組分線性關(guān)系及定量限見表5。

表5 各目標成分的線性關(guān)系及定量限

由表5 可知，目標成分在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 7。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取小柴胡片樣品10片，除去包衣，研細，稱取約0.40 g，精密稱定，按1.3.3 方法制備1 份樣品溶液，分別放置0、6、12、18、24、36、48 h 后在1.2 色譜條件下測定，測得柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、黨參炔苷、甘草苷、甘草酸、6-姜辣素色譜峰面積見表6。

由表6 可知，測量值的相對標準偏差分別為0.89%、0.37%、0.04%、0.16%、0.33%、0.53%、0.86%、0.25%、0.38%、0.24%，均小于1.0%，結(jié)果表明樣品溶液中的10 種指標成分在48 h 內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.7 樣品加標回收試驗

精密稱取所測各藥物成分含量已知的片劑，除去包衣，每份約0.2 g，精密加入對照品貯備溶液2.0 mL，精密加入5%濃氨試液的甲醇溶液23 mL，按1.3.3方法分別平行制備6份樣品溶液，在1.2色譜條件下進行含量測定，計算加標回收率，試驗結(jié)果見表7。

表7 樣品加標回收試驗結(jié)果

由表7可知，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、黨參炔苷、甘草苷、甘草酸、6-姜辣素平均加標回收率分別為94.81%、93.62%、97.82%、95.80%、94.28%、93.44%、91.89%、92.34%、94.03%、91.40%，測定結(jié)果的相對標準偏差分別為1.29%、1.30%、0.79%、1.96%、1.86%、2.42%、2.88%、1.41%、1.43%、2.04%。

3 結(jié)語

采用多波長和梯度洗脫方式建立的10 種指標成分的含量測定方法，能全面控制小柴胡片的質(zhì)量，同時能評價藥材投料質(zhì)量等級，保證藥品的臨床療效，該含量測定方法簡便，專屬性強、靈敏度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，為全面考察小柴胡片的質(zhì)量水平提供了參考方法和依據(jù)。