宋佳，賴煥華，姜麗君，林葉婧，陳華龍

（韶關(guān)市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東韶關(guān) 512028）

隨著人們對化妝品安全性的要求越來越高，以植物資源為原料開發(fā)的化妝品是化妝品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新趨勢,如鐵皮石斛發(fā)酵液具有抗氧化活性[1]、光果甘草根提取物具有美白功效[2]。然而，在綠色、天然概念的背后，監(jiān)管部門必須清楚認(rèn)識到植物原料化妝品的安全問題，植物源化妝品原料成分復(fù)雜，指標(biāo)成分含量低，原料指標(biāo)成分比較難規(guī)范[2]。在化妝品不良反應(yīng)監(jiān)測工作中發(fā)現(xiàn)，在2018～2022 年，廣東省韶關(guān)地區(qū)共報告化妝品不良反應(yīng)1 212例，其中由植物組分化妝品引起的有198例，占16.34%，可見植物組分化妝品在宣稱成分安全健康的同時，其安全性也不容忽視。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）列出了109種禁用植（動）原料，根據(jù)其毒性大致可歸為以下幾類：一是含毒苷類組分如白芥、商陸等；二是含生物堿類組分如顛茄、秋水仙、白附子、檳樃等；三是含光敏、過敏性成分如白芷、土木香根油；四是含對皮膚有刺激性的組分如斑蝥素、大戟科巴豆屬植物等[3]，為了加強(qiáng)對植物源性化妝品的安全監(jiān)管，建立高效快捷的化妝品禁用植（動）物原料的檢驗(yàn)檢測方法要求迫切。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）中禁用植物原料的檢測方法僅涵蓋了3 個標(biāo)準(zhǔn)，包含6-甲基香豆素、8-甲氧基補(bǔ)骨脂素、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素、三甲沙林、歐前胡內(nèi)酯5種化合物的定量方法，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮 4 種化合物的定性方法。目前黃酮類化合物、生物堿類化合物和致敏香料的檢測方法研究較多，如范菲等[4]建立了補(bǔ)骨脂素等4 種化合物的含量測定方法；呂小會等[5]建立了士的寧等9種禁用生物堿的含量測定方法，黃學(xué)泓等[6]采用氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜法測定了進(jìn)口化妝品中24種致敏香料成分。然而，針對具有光敏性和引起皮膚過敏反應(yīng)的化妝品原料的檢測方法較少。

筆者以潛在光敏性和引起過敏反應(yīng)的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》規(guī)定的禁用植物原料為研究對象，包括在美容方劑中使用頻率較高的杏仁[7]以及巴豆、白芷、狼毒、土木香、馬兜鈴共6 種植物原料。其中大戟科巴豆屬植物、馬兜鈴科馬兜鈴屬植物、狼毒均為具有毒性的禁用植物原料。巴豆能引起皮膚發(fā)泡急性癥狀[8]，巴豆苷為《中國藥典》規(guī)定的巴豆質(zhì)量控制的指標(biāo)[9]。馬兜鈴酸為化妝品禁用原料，是一種強(qiáng)致癌物。狼毒為毒性植物，其成株莖葉中含有萜類成分，研究表明狼毒具有抑菌活性[10]，可能做為防腐劑使用，狼毒乙素是狼毒的指標(biāo)成分[11]?？嘈尤受諡樾尤驶钚猿煞郑纸猱a(chǎn)生的氫氰酸為化妝品禁用原料，大劑量時會對神經(jīng)中樞產(chǎn)生麻痹作用[12-13]。而白芷和土木香為具有光毒性的禁用植物原料，白芷是古方《太平圣惠方》《普濟(jì)方》等古方中記載的美白方劑“七子白”的主要藥味[14]，其光敏物質(zhì)為呋喃香豆素類化合物，如花椒毒素、歐前胡素等[15]。土木香中的土木香內(nèi)酯為誘發(fā)過敏性疾病的變應(yīng)原[3]。巴豆苷、苦杏仁苷、花椒毒素、狼毒乙素、馬兜鈴酸、歐前胡素、土木香內(nèi)酯7種化合物均可利用有機(jī)-弱酸性流動相、反向高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測[16-22]，通過對流動相梯度的優(yōu)化可完成同時測定，為監(jiān)測植物組分化妝品的安全性提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260 Ⅰnffinity Ⅱ型，配有二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

分析天平：MSA225S-ⅠCE-DU 型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯儀器有限公司。

超聲波清洗器：ELMA P60H 型，德國Elma公司。

渦旋混合器：Ⅰka LabDancer型，德國艾卡公司。

中央純水機(jī)：Central R2E 500-As 型，上海和泰儀器有限公司。

巴豆苷對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.5%，批號111856-201102，中國食品藥品檢定研究院。

苦杏仁苷對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%，批號110820-202109，中國食品藥品檢定研究院。

花椒毒素對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%），批號112077-202101，中國食品藥品檢定研究院。

狼毒乙素對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，批號111932-201201，中國食品藥品檢定研究院。

馬兜鈴酸對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.1%，批號110746-201912，中國食品藥品檢定研究院。

歐前胡素對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%，批號110826-201918，中國食品藥品檢定研究院。

土木香內(nèi)酯對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%，批號110760-201811，中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈：均為色譜純，美國TEDⅠA公司。

磷酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

化妝品樣品：11批，其中水劑3批，乳劑4批，霜劑2批，面膜粉2批，均為市售。

1.2 溶液配制

對照品儲備液：質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，精密稱取巴豆苷、苦杏仁苷、花椒毒素、狼毒乙素、馬兜鈴酸、歐前胡素、土木香內(nèi)酯對照品各10 mg，精確至0.000 1 g，分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密量取巴豆苷、花椒毒素、狼毒乙素、馬兜鈴酸、歐前胡素、土木香內(nèi)酯對照品儲備液各0.8 mL，苦杏仁苷對照品儲備液3.2 mL，置于同一20 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇稀釋成巴豆苷、花椒毒素、狼毒乙素、馬兜鈴酸、歐前胡素、土木香內(nèi)酯質(zhì)量濃度均分別為1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 μg/mL，苦杏仁苷質(zhì)量濃度分別為4.0、20.0、40.0、80.0、120.0、160.0 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK MG C18柱（250 mm×4.6 nm，5 μm，日本大阪曹達(dá)株式會社)；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；流動相：A 相為乙腈，B 相為體積分?jǐn)?shù)0.05%的磷酸溶液，流量為1 mL/min，梯度洗脫，系統(tǒng)程序見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件

1.4 樣品處理

精密稱取化妝品樣品0.5 g 于10 mL 具塞比色管中，加入甲醇溶液5 mL，渦旋30 s，使樣品與提取溶劑充分混勻，超聲提取30 min，搖勻，放冷后加入甲醇稀釋至標(biāo)線，若溶液中有沉淀或渾濁，以10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。精密稱取空白化妝品樣品0.5 g于10 mL具塞比色管中，同法作空白溶液。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

分別取空白溶液、系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，按1.3色譜條件進(jìn)樣測定。用色譜工作站軟件Openlab CDS2.0 分析、處理數(shù)據(jù)，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品溶液中各禁用組分標(biāo)志性成分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長

采用高效液相色譜儀配備二極管陣列檢測器于190～400 nm 掃描，7 種目標(biāo)物的紫外吸收光譜圖見圖1。

圖1 7種化合物紫外吸收光譜圖

由圖1 可知，7 種目標(biāo)物在210 nm 左右均有較強(qiáng)吸收峰且能滿足方法靈敏度的要求，因此選擇210 nm作為檢測波長。

2.1.2 流動相

參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-18]，分別考察乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-水這兩種流動相體系對巴豆苷、苦杏仁苷、花椒毒素、狼毒乙素、馬兜鈴酸、歐前胡素、土木香內(nèi)酯的分離效果的影響。結(jié)果顯示，以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相時各化合物峰形最優(yōu)，優(yōu)化此流動相體系的梯度洗脫程序，使得7 種化合物得到最佳分離效果。

2.1.3 色譜柱及柱溫

參照文獻(xiàn)[17-22]，選擇最為常用的反相填料C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，通過調(diào)節(jié)流動相配比等參數(shù)來獲得最佳的分離效果。分別考察資生堂 CAPCELL PAK MG C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本大阪曹達(dá)株式會社)和Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.5 mm，5 μm，美國菲羅門公司)對各組分色譜行為的影響。結(jié)果表明，Phenomenex Luna C18色譜柱不能有效分離花椒毒素和狼毒乙素，無法實(shí)現(xiàn)同時分離7 種成分。而資生堂CAPCELL PAK MG C18能滿足7 種成分同時分離，且分離效果好，峰形尖銳，能滿足分析要求，因此最終選擇資生堂CAPCELL PAK MG C18色譜柱進(jìn)行檢測。

分別設(shè)置柱溫為25、30、35 ℃，平行進(jìn)樣測定，考察柱溫對色譜圖的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，柱溫微小變化對各組分峰形和分離度影響不大，均能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，因此試驗(yàn)選取的柱溫為最常見的30 ℃。

2.2 提取溶劑

根據(jù)7種目標(biāo)物的理化性質(zhì)，參照文獻(xiàn)[17-22]，分別考察體積分?jǐn)?shù)為100%、80%、50%的甲醇水溶液作為提取溶劑時的提取效果，結(jié)果表明，當(dāng)使用100%甲醇提取樣品時，各色譜峰面積最大，提取效果最佳，故最終選用甲醇作為提取溶劑。

2.3 色譜圖

在優(yōu)化的色譜條件下，7 種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品、加標(biāo)樣品溶液色譜圖分別見圖2～圖4。由圖2～圖4 可見，該方法對7 種化合物完成了基線分離，且峰形尖銳、對稱，對目標(biāo)物質(zhì)的檢測具有專屬性，可以排除其他雜質(zhì)干擾，滿足高效液相色譜法的系統(tǒng)適用性要求。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 空白樣品色譜圖

圖4 加標(biāo)溶液色譜圖

2.4 線性關(guān)系和檢出限

將系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按1.3 色譜條件依次進(jìn)樣測定，以目標(biāo)物的色譜峰面積對其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得線性方程和相關(guān)系數(shù)，以3倍信噪比對應(yīng)的目標(biāo)物在樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法檢出限。7種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限見表2。

表2 7種化合物線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限

由表2可知，巴豆苷、花椒毒素、狼毒乙素、馬兜鈴酸、歐前胡素、土木香內(nèi)酯的質(zhì)量濃度在1～40 μg/mL，苦杏仁苷的質(zhì)量濃度在4～160 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法的檢出限可滿足化妝品中巴豆苷、苦杏仁苷、花椒毒素、狼毒乙素、馬兜鈴酸、歐前胡素、土木香內(nèi)酯的含量檢測要求。

2.5 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

取水劑、乳劑兩種劑型空白化妝品樣品，分別添加高、低2個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中高水平添加質(zhì)量濃度為30.0 μg/mL（苦杏仁苷的質(zhì)量濃度為120 μg/mL），低水平添加質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL（苦杏仁苷40 μg/mL），按照1.4方法處理，每個濃度水平平行配制6份樣品，按照1.3色譜條件進(jìn)行測定并記錄色譜圖，計算7 種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率和測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，水劑、乳劑化妝品樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果分別見表3、表4。由表3、表4 可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～2.8%，方法回收率為90.0%～105.0%，不同劑型化妝品樣品的分析精密度、準(zhǔn)確度均能滿足分析要求。

表3 水劑空白樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表4 乳劑空白樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

采用二極管陣列檢測器高效液相色譜法同時測定化妝品中7種禁用或毒性植物原料標(biāo)志性成分的定性、定量分析方法，補(bǔ)充了化妝品禁用植物原料的檢測方法的空白，為監(jiān)測植物組分化妝品的安全性提供了技術(shù)支撐。