胡珀，何曉希，金華，趙祥杰，卜媛媛

（1.淮安市食品藥品檢驗所，江蘇淮安 223001； 2.淮陰工學(xué)院，江蘇淮安 223001）

伏馬毒素(FB)是鐮刀菌在適宜的溫度和濕度下產(chǎn)生的次級代謝物，Gelderblom 等[1]于1988 年首次在串珠鐮刀菌中分離出伏馬毒素，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的天然伏馬毒素共有28 種不同的異構(gòu)體，可分為4種類型，分別為FA、FB、FC和FP，主要以FB的形式存在，其中FB1的毒性主要包括神經(jīng)毒性、腸道毒性、肝毒性、腎毒性、免疫毒性和生殖毒性等[2]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(ⅠARC)對FB1進(jìn)行了評估，并將其評定為2B 級致癌物[3]。目前，人們對中藥材污染伏馬毒素的研究集中在檢測FB1和FB2，《中華人民共和國藥典》2020年版四部真菌毒素測定法中也明確了FB1和FB2的檢測方法，ZHAO 等[4]在中藥材土鱉蟲中檢出FB1和FB2。自然污染的情況下，F(xiàn)B1的污染最為廣泛。伏馬毒素除了以上述游離形式存在外，還有很多隱蔽形式，如伏馬毒素在酸性環(huán)境中易水解，失去1個或2個丙三羧酸基團(tuán)，從而形成水解伏馬毒素[5]，且水解產(chǎn)物仍然有毒性[6]。

動物類中藥材中的脂肪和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)易吸收空氣中的水分而潮解，導(dǎo)致藥材霉變，霉菌會破壞藥材的內(nèi)部組織，使有機(jī)物被分解、藥材腐爛變質(zhì)、色澤及氣味異常，藥材失去主要的有效成分，失去應(yīng)用價值[7]。由于動物類中藥材養(yǎng)殖范圍廣、成分復(fù)雜，且我國真菌毒素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)較為欠缺，使得真菌毒素殘留成為影響中藥材質(zhì)量安全的重要因素。為了保障動物類藥材、飲片質(zhì)量安全，亟需開展動物類藥材、飲片中外源性真菌毒素的高效檢測關(guān)鍵技術(shù)研究及應(yīng)用工作。

增強(qiáng)型脂質(zhì)去除填料EMR-Lipid 是一種改良的QuEChERS 凈化法，能高選擇性地去除基質(zhì)中的脂類雜質(zhì)，與傳統(tǒng)QuEChERS 凈化法相比更適用于脂肪、蛋白質(zhì)含量較高的樣品，方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好[8]。筆者利用QuEChERS EMR-Lipid凈化包凈化樣品，采用UPLC-MS/MS在多反應(yīng)監(jiān)測模式下對動物性中藥材樣品進(jìn)行測定，以色譜峰面積外標(biāo)法定量，建立了僵蠶、水蛭、土鱉蟲、地龍、全蝎、蜈蚣、九香蟲、蜂房、斑蝥9 種中藥材或飲片中伏馬毒素B1（FB1）、伏馬毒素B2（FB2）、伏馬毒素B3（FB3）、伏馬毒素A1（FA1）、水解伏馬毒素B1（HFB1）、水解伏馬毒素B2（HFB2） 6種真菌毒素的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：UltiMate3000型，美國賽默飛世爾公司。

三重四極桿質(zhì)譜儀：QTRAP 4500 型，附帶Analyst采集軟件和MultiQuant 3.0.2分析軟件，美國SCⅠEX公司。

電子天平：XS205DU 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司。

均質(zhì)分散機(jī)：T25 easy clean型，德國ⅠKA公司。

中藥材或飲片樣品：僵蠶、水蛭、土鱉蟲、地龍、全蝎、蜈蚣、九香蟲、蜂房、斑蝥9種，每種5批，共45批，市售；另有5批土鱉蟲飲片來自江蘇正大清江制藥有限公司。中藥材或飲片樣品信息見表1。

超純水機(jī)：Milli-Q型，美國密理博公司。

QuEChERS EMR-Lipid 凈化包：安捷倫科技（中國）有限公司。

伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：FB1、FB2、FB3、FA1、HFB1、HFB2的 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為5.00、5.02、5.00、5.08、5.01、5.00 μg/mL，青島普瑞邦生物工程有限公司。

甲醇、乙腈、甲酸：色譜純。

實驗用水由Milli-Q純水機(jī)制得。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：ACQUⅠTY UPLC?BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司）；進(jìn)樣器溫度：10 ℃；柱溫：30 ℃；流動相：A相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液，B相甲醇-乙腈（體積比為1∶1），流量為0.3 mL/min；梯度洗脫程序：B 體積分?jǐn)?shù)在0～2 min 為10%，2～2.1 min 由10%到40%，2.1～5 min 由40%到55%，5～10 min 由55%到70%，10～10.5 min由70%到90%，10.5～11 min 由90%到10%，11～13 min為10%；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化(ESⅠ)模式；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，檢測離子為正離子；霧化電壓：5 500 V；離子傳輸溫度：500 ℃；去簇電壓和碰撞能量見表2。

表2 6種伏馬毒素對照品質(zhì)譜分析參數(shù)

1.4 溶液的制備

樣品溶液：精密稱定中藥材樣品粉末約5 g 于50 mL離心管中，加入20 mL 80%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙腈水溶液，均質(zhì)2 min后，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，再精密量取4 mL上清液，轉(zhuǎn)移至QuEChERS EMR-Lipid 凈化包離心管中渦旋混勻，再以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取凈化液，濾過。

溶劑混合對照品溶液：精密量取伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用80%乙腈水溶液稀釋成系列溶劑混合對照品溶液，其中6 種伏馬毒素的質(zhì)量濃度均分別為2、4、10、20、40 ng/mL。

基質(zhì)混合對照品溶液：取中藥材空白基質(zhì)樣品5 g，同樣品溶液的制備方法處理，取凈化液作為空白基質(zhì)，分別精密加入伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成系列基質(zhì)混合對照品溶液，其中6 種伏馬毒素的質(zhì)量濃度均分別為2、4、10、20、40 ng/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理條件的優(yōu)化

檢測真菌毒素的動物性中藥材樣品處理方法包括提取和凈化2步，提取方法主要有均質(zhì)提取法、振蕩提取法、超聲提取法、攪拌提取法等，均質(zhì)提取法優(yōu)點突出，能快速分散樣品，使目標(biāo)化合物在短時間內(nèi)溶于提取液中，制得更均一的混合溶液，比起其它方法，時間大大縮短。

樣品凈化方法有多種，一是過HLB 柱，填料主要包括硅膠、C18、硅酸鎂等，選擇性吸附和洗脫是目前國際上較為常用的檢測真菌毒素樣品的處理方法之一，適用于簡單基質(zhì)，但凈化時間長，目標(biāo)化合物易在淋洗步驟中損失，造成數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確；二是過免疫親合柱，既可單獨(dú)凈化得到一種或一類毒素，例如黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮及其衍生物、赭曲霉毒素A，也有可能同時凈化得到幾類毒素，但是凈化效果容易受樣品基質(zhì)、pH、溶劑等因素的影響，同時價格高昂，凈化時間長；三是采用QuEChERS 凈化包凈化，通過購置商品化提取凈化包或自制不同配比的無水硫酸鎂、PSA、C18、氯化鈉等材料進(jìn)行樣品凈化處理，時間較短，操作簡便，但是該法目標(biāo)物易被吸附，實驗重復(fù)性不理想；四是使用EMR 材料，EMR是一種新型凈化材料，結(jié)合了體積排阻與疏水相互作用，可專門吸附脂質(zhì)中C5及以上的碳鏈，在不影響目標(biāo)物回收率的情況下對脂質(zhì)具有非常強(qiáng)的選擇吸附性，可很大程度上降低基質(zhì)的干擾，方法靈敏度較高[8]。

由于伏馬毒素為一類由不同多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物，吸附性強(qiáng)，傳統(tǒng)樣品處理方法回收率低，使用的EMR-Lipid 凈化材料，可吸附雜質(zhì)、脂類和蛋白質(zhì)，適用于伏馬毒素凈化，凈化時間短，回收率在可接受范圍，因此選擇EMRLipid凈化樣品處理方法。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

在對照品溶液濃度相同的情況下，在流動相水相中加入有機(jī)酸時，部分化合物的響應(yīng)會明顯增強(qiáng)，這是因為有機(jī)酸的存在促進(jìn)了化合物的離子化效率，使響應(yīng)增大，因此選擇在水相中加入甲酸。分別考察了乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-乙腈（1∶1，體積比）-0.01%甲酸水溶液、甲醇-乙腈（1∶1）-0.1%甲酸水溶液流動相系統(tǒng)對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相時，伏馬毒素A1、伏馬毒素B3、水解伏馬毒素B2的色譜峰不能良好分離；采用甲醇-乙腈（1∶1）-0.01%甲酸水溶液作為流動相，伏馬毒素B1色譜峰高降低了約50%，伏馬毒素B2色譜峰高降低了約80%；采用甲醇-乙腈（1∶1）-0.1%甲酸水作為流動相，通過調(diào)整流動相梯度，6個目標(biāo)物色譜峰可以良好分離，峰形理想且靈敏度較高，故選擇甲醇-乙腈（1∶1）-0.1%甲酸水溶液為流動相。

2.3 專屬性、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗

同步開展空白試驗，空白樣品無干擾，表明該方法專屬性良好；取中藥材樣品粉末5 g，稱取6份，加入40 μL 混合對照品原液，制備加標(biāo)樣品溶液后測定，6 種伏馬毒素色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于10%，表明該方法的重復(fù)性良好；取基質(zhì)混合對照品溶液分別放置0、2、4、8、12、24 h 后測定6 種伏馬毒素的色譜峰面積，結(jié)果表明色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于10%，表明基質(zhì)混合對照品溶液中6種伏馬毒素在24 h內(nèi)均穩(wěn)定。伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品溶液、加標(biāo)樣品溶液總離子流圖見圖1。

圖1 伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品溶液、加標(biāo)樣品溶液總離子流圖

2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限

測定基質(zhì)混合對照品溶液，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。分別以信噪比為3、10 對應(yīng)的樣品中目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法檢出限和定量限。6種伏馬毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表3。由表3可知，6種伏馬毒素在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.4～1.4 μg/kg，定量限為1.2～4.7 μg/kg。

表3 線性方程及檢出限、定量限

2.5 樣品加標(biāo)回收試驗

以未檢出目標(biāo)真菌毒素樣品為空白樣品，精密稱定5 g，取18 份，6 份為1 組，按低、中、高3 個濃度水平精密加入混合對照品溶液16、40、80 μL，依次制備加標(biāo)樣品溶液并測定，結(jié)果見表4。

表4 樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果

由表4 可知，6 種伏馬毒素的平均回收率為77.3%～101.6%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%（n=6），表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度，滿足測定要求。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

ESⅠ源中基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生是受共流出物質(zhì)干擾，產(chǎn)生競爭性電離，導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)增強(qiáng)或降低現(xiàn)象[9]?；|(zhì)效應(yīng)在±20%之間為可接受范圍[10-11]，其值大于零則說明有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，小于零則說明有基質(zhì)抑制效應(yīng)[12]。配制10 ng/mL 溶劑混合對照品溶液和9種同濃度空白基質(zhì)混合對照品溶液進(jìn)行測定，比較每種伏馬毒素色譜峰面積，計算基質(zhì)效應(yīng)值，試驗結(jié)果見表5。

表5 6種伏馬毒素在9種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

由表5可知，6種伏馬毒素的基質(zhì)效應(yīng)在不同中藥基質(zhì)中有不同增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，F(xiàn)B1、FB2和FB3有抑制效應(yīng)，F(xiàn)A1、HFB1和HFB2有部分增強(qiáng)，部分抑制?？傮w來說，抑制效應(yīng)占81.48%，抑制和增強(qiáng)效應(yīng)超出±20%的占48.14%，說明6種伏馬毒素在9種動物類中藥材基質(zhì)中基質(zhì)效應(yīng)不可忽略。這可能是由于樣品提取液中油脂以及磷脂類物質(zhì)等影響了某些目標(biāo)物離子化效率導(dǎo)致的結(jié)果。消除基質(zhì)效應(yīng)最佳方法是用適宜的同位素內(nèi)標(biāo)[13]，但在真菌毒素較多的情況下，找到適于每種真菌毒素的內(nèi)標(biāo)物較為困難且價格昂貴，標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過測定基質(zhì)混合對照品溶液制得，可在現(xiàn)有條件基礎(chǔ)上最大程度減弱基質(zhì)效應(yīng)，保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確性。

3 結(jié)語

建立了僵蠶、水蛭、土鱉蟲、地龍、全蝎、蜈蚣、九香蟲、蜂房、斑蝥9 種中藥材或飲片中伏馬毒素B1，伏馬毒素B2，伏馬毒素B3，伏馬毒素A1，水解伏馬毒素B1，水解伏馬毒素B2共6種真菌毒素的檢測方法，該法簡便、快速、準(zhǔn)確。動物藥基質(zhì)以蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等大分子為主，基質(zhì)營養(yǎng)豐富，易霉變。伏馬毒素的污染途徑較廣，從藥材種植、養(yǎng)殖到銷售，任一環(huán)節(jié)都有可能造成污染。動物類中藥材養(yǎng)殖的環(huán)境食物中極易被伏馬毒素污染，影響后期產(chǎn)業(yè)鏈中每一個環(huán)節(jié)；其次，中藥材的貯存過程則是伏馬毒素污染的另一個重要環(huán)節(jié)，此過程環(huán)境變量的改變易使其內(nèi)部發(fā)熱升溫更易達(dá)到霉菌滋生和毒素產(chǎn)生的條件，故需要嚴(yán)格控制環(huán)境條件（溫度、濕度、水活度、pH 值、氧氣濃度、CO2濃度等），但是基于中藥材生產(chǎn)加工儲存的現(xiàn)實情況，很難將這些因素全部控制，只能控制其中某些方便控制的變量[14]。目前，多數(shù)動物藥并未明確規(guī)定冷藏、防潮等貯藏條件，霉變的樣品在市場上多見。有研究表明，適宜的干燥程度和較低的貯藏溫度可以有效控制霉菌生長[15]，需要進(jìn)一步研究霉菌在不同條件下的生長規(guī)律，扼制污染，為動物類藥材、飲片及其制劑的安全使用提供保障。