白帆，王娜，宋越，張帆，張?jiān)旅罚軙詵|，錢(qián)林娜，戴伶俐*

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

隨著肉羊產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，集約化、規(guī)?；潭炔粩嗵岣?，羊混合病原感染引起的傳染性胸膜肺炎（俗稱(chēng)爛肺?。┏蔀轲B(yǎng)羊生產(chǎn)的重大疾患問(wèn)題，造成的損失巨大。綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae, M.ovi)是引起綿羊、山羊、大角羊和野生小反芻動(dòng)物慢性肺炎的主要病原，引起患病羊只進(jìn)行性消瘦、痙攣性咳及喘等癥狀，病程可持續(xù)數(shù)月至數(shù)年[1-2]。本團(tuán)隊(duì)從內(nèi)蒙古的多個(gè)地區(qū)分離到該病原，該病在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病率為14.3%～75%（引進(jìn)品種羔羊）。羊多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida, Pm）A/D 型常與支原體混合感染或冷、熱應(yīng)激后繼發(fā)性感染，引起羊常見(jiàn)的細(xì)菌性呼吸道傳染病，導(dǎo)致羊只出現(xiàn)嚴(yán)重的纖維素性肺炎和其他肺臟病變，危害性不斷增大[3]。近年來(lái)，隨著養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)方式的轉(zhuǎn)變，一些地區(qū)的綿羊、羔羊和育肥青年羊有地方性群發(fā)的報(bào)道，發(fā)病率為31%～87.5%，病死率為18.6%～41%，成年羊也常有散發(fā)[4]。本團(tuán)隊(duì)在2016—2022 年從內(nèi)蒙古、遼寧、山東、陜西及寧夏等地采集777 份鼻拭子樣本，檢測(cè)M.ovi、PmA 及PmD 的感染情況，其中M.ovi 陽(yáng)性245 份，陽(yáng)性率為31.53%；PmA陽(yáng)性223 份，陽(yáng)性率為28.70%，PmD 陽(yáng)性210 份，陽(yáng)性率為27.03%；巴氏桿菌和M.ovi 混合感染陽(yáng)性樣本138 份，陽(yáng)性率為17.76%。

雖然，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有針對(duì)山羊傳染性胸膜肺炎的支原體雙價(jià)滅活疫苗，但是對(duì)于山羊、綿羊預(yù)防效果并不理想（據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，這些疫苗對(duì)羊傳染性肺炎的保護(hù)率在75%以下）[5]。試驗(yàn)研究和診治實(shí)踐表明，單一種類(lèi)疫苗的針對(duì)性差，產(chǎn)生的免疫抗體對(duì)混合感染病原毒株抗原的中和覆蓋度低是問(wèn)題產(chǎn)生的主要原因和關(guān)鍵根源[6-7]。該項(xiàng)目開(kāi)展了M.ovi、Pm（A/D 型）聯(lián)合滅活疫苗的研究，通過(guò)對(duì)地方羊場(chǎng)優(yōu)勢(shì)流行菌株的分離和候苗株的篩選，實(shí)驗(yàn)室嘗試研制出針對(duì)綿羊爛肺病的復(fù)方油佐劑自家滅活疫苗，攻毒保護(hù)率可達(dá)86.2%。為考查該疫苗對(duì)妊娠期母羊免疫接種的安全性，以及進(jìn)一步確定新生羔羊通過(guò)初乳獲得母源抗體的水平，以高繁湖羊懷孕母羊及其新生羔羊?yàn)檠芯繉?duì)象。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

已懷孕120 d 的純種湖羊購(gòu)自巴彥淖爾市五原縣金草原生態(tài)科技集團(tuán)有限公司，6 月內(nèi)未免疫山羊支原體肺炎雙價(jià)疫苗（四川海大生物出品），ELISA 檢測(cè)M.ovi、Pm 血清抗體呈陰性，PCR 檢測(cè)鼻拭子無(wú)M.ovi、Pm（A/D 型）等感染。

1.2 試驗(yàn)疫苗及試劑

綿羊肺炎支原體-多殺性巴氏桿菌A/D 型三聯(lián)滅活疫苗由本實(shí)驗(yàn)室試制；支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司（HKM，廣東）；脫脂乳、特級(jí)馬血清購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司（Solarbio，北京）；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司（TIANGEN，北京）；ELISA 板、HRP 標(biāo)記兔抗綿羊IgG（H+L）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech，上海）；其他未注明試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad 公司。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及差異性分析。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

2 試驗(yàn)方法

2.1 妊娠后期母羊疫苗接種安全性評(píng)價(jià)

如表1 所示，試驗(yàn)將15 只懷孕母羊隨機(jī)分為3組，分別為連續(xù)免疫單一劑量試驗(yàn)組、超劑量免疫試驗(yàn)組及PBS 對(duì)照組，每組5 只。其中，連續(xù)免疫單一劑量試驗(yàn)組羊只疫苗免疫劑量為5 mL/只，共免疫4 次，每次免疫時(shí)間間隔7 d； 超劑量免疫試驗(yàn)組羊只疫苗免疫劑量為10 mL/只，共免疫1 次；PBS 對(duì)照組羊只免疫PBS 作為對(duì)照，免疫劑量為5 mL/只。采用頸部皮下注射方式，免疫后及產(chǎn)羔前后統(tǒng)計(jì)流產(chǎn)率、弱羔率、早產(chǎn)2 周齡羔羊存活率及致畸率等情況。

表1 疫苗安全性評(píng)價(jià)分組方式

2.2 新生羔羊母源抗體獲得水平及妊娠母羊抗體評(píng)價(jià)

2.2.1 妊娠羊免疫設(shè)計(jì)。試驗(yàn)將20 只懷孕母羊隨機(jī)分為2 組，分別為免疫試驗(yàn)組及PBS 對(duì)照組，每組10只。免疫劑量為5 mL（表2），采取頸部皮下注射。母羊分別在免疫前、免疫后14 d 及28 d 采血。羔羊出生后24 h 內(nèi)保證及時(shí)攝入足量初乳。同時(shí)在羔羊出生后第1、3、6、9、12 及15 天分別采血，分離血清后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 妊娠母羊免疫分組方式

2.2.2 抗體評(píng)價(jià)。M.ovi 及Pm 分別利用加有10%馬血清的支原體培養(yǎng)基及TSB 培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別取適量培養(yǎng)液12 000 r/min 離心30 min 后棄上清，用等量PBS 溶液重懸沉淀，以上步驟重復(fù)3次后將菌體沉淀重懸，0 ℃冰浴條件下利用超聲破碎儀破碎菌體，釋放菌體蛋白。使用BCA 蛋白定量試劑盒對(duì)菌體總蛋白進(jìn)行定量后，利用碳酸鹽包被液稀釋菌體蛋白至0.5 μg/孔后包被ELISA 板，取200 μL 濃度為50 g/L 的脫脂乳37 ℃封閉2 h 后用PBST 洗3次。進(jìn)行M.ovi 或Pm 抗體檢測(cè)的羊血清分別以體積比為1∶100 和1∶200 稀釋?zhuān)?00 μL/孔分別加入上述ELISA 板中，37 ℃孵育90 min，PBST 洗3 次。每孔加入100 μL 按體積比1∶10 000 稀釋的兔抗綿羊HRP-IgG，37 ℃孵育1 h，PBST 洗3 次。利用TMB 底物溶液顯色25 min 后，取2 mol/L 硫酸100 μL/孔終止顯色，并分別測(cè)量其OD450。

2.3 新生羔羊獲得母源抗體被動(dòng)免疫效果評(píng)價(jià)

新生羔羊在出生60 d 后，每組隨機(jī)抽選3 只進(jìn)行剖檢，觀察呼吸系統(tǒng)病變情況，并依據(jù)肺臟病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)測(cè)。羊只肺臟分為7 葉，每葉肺臟根據(jù)病變面積不同進(jìn)行相應(yīng)打分，0%～25%面積病變?cè)u(píng)為1 分；25%～50%面積病變?cè)u(píng)為2 分；50%～75%面積病變?cè)u(píng)為3 分；75%～100%面積病變?cè)u(píng)為4 分； 滿分為28 分。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 妊娠后期母羊疫苗接種安全性評(píng)價(jià)

為進(jìn)行妊娠后期母羊疫苗接種安全性評(píng)價(jià)，本試驗(yàn)對(duì)3 組懷孕母羊在完成免疫后分別統(tǒng)計(jì)流產(chǎn)率、弱羔率、早產(chǎn)2 周齡羔羊存活率及致畸率情況。試驗(yàn)觀察至懷孕母羊產(chǎn)羔后第60 天。如表3 所示，3 組試驗(yàn)妊娠羊只均未發(fā)生流產(chǎn)及早產(chǎn)2 周情況，分娩羔羊均健康成活，沒(méi)有弱羔及致畸現(xiàn)象。

表3 疫苗接種安全性評(píng)價(jià)結(jié)果 單位：%

3.2 妊娠母羊免疫效果評(píng)價(jià)

為進(jìn)行新生羔羊母源抗體獲得水平的評(píng)價(jià)，本研究首先評(píng)價(jià)了懷孕母羊產(chǎn)前抗體水平。如圖1 結(jié)果所示，在對(duì)M.ovi 及Pm 抗體水平評(píng)價(jià)中，免疫前2 組懷孕母羊相應(yīng)抗體水平均較低，組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在免疫后14 d，免疫試驗(yàn)組母羊M.ovi 及Pm 抗體水平出現(xiàn)較大幅度上升，與PBS 對(duì)照組相比差異極顯著；在免疫后28 d，免疫試驗(yàn)組母羊M.ovi 及Pm抗體水平依然維持在較高水平，與PBS 對(duì)照組相比依然存在極顯著差異。

圖1 懷孕母羊M.ovi 及Pm 抗體水平

3.3 新生羔羊母源抗體獲得水平評(píng)價(jià)

為進(jìn)行新生羔羊母源抗體獲得水平的評(píng)價(jià)，本研究對(duì)妊娠120 d 母羊進(jìn)行滅活疫苗免疫，并在羔羊出生第1、3、6、9、12 和15 天進(jìn)行采血，以評(píng)價(jià)母源抗體獲得水平。抗體檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示，在對(duì)M.ovi 抗體水平評(píng)價(jià)中，羔羊出生第1 天抗體水平組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在出生后3 d 時(shí)，免疫試驗(yàn)組母羊所產(chǎn)羔羊抗體水平達(dá)到最大值，與PBS 對(duì)照組所產(chǎn)羔羊抗體相比差異極顯著，PBS 對(duì)照組所產(chǎn)羔羊抗體與第1 天相比出現(xiàn)下降；在出生后6、9、12 和15 d 時(shí)，免疫試驗(yàn)組母羊所產(chǎn)羔羊抗體水平與PBS 對(duì)照組所產(chǎn)羔羊抗體均出現(xiàn)下降，但組間差異比較顯著。

圖2 新生羔羊母源M.ovi 及Pm 抗體獲得水平

在對(duì)Pm 抗體水平評(píng)價(jià)中，羔羊出生第1 天抗體水平組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； 在出生后3、6、9、12 和15 d時(shí)，PBS 對(duì)照組所產(chǎn)羔羊抗體水平與第1 天相比均出現(xiàn)不同程度的下降，但免疫試驗(yàn)組母羊所生羔羊抗體水平變化并不明顯，因此兩組間相比差異極顯著。

3.4 新生羔羊母源抗體被動(dòng)免疫效果評(píng)價(jià)

為確定獲得母源抗體被動(dòng)保護(hù)羔羊的保護(hù)效果，新生羔羊在出生60 d 后對(duì)其進(jìn)行剖檢，觀察呼吸系統(tǒng)病變情況，并依據(jù)肺臟病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)測(cè)。結(jié)果如圖3 所示，PBS 對(duì)照組所產(chǎn)羔羊肺臟右側(cè)前葉及左右側(cè)中葉出現(xiàn)肉樣實(shí)變，病變現(xiàn)象明顯。免疫試驗(yàn)組母羊所產(chǎn)羔羊肺臟粉紅有彈性，未見(jiàn)明顯病變。對(duì)2 組肺臟分別評(píng)分后，組間差異極顯著，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 新生羔羊剖檢肺臟病變?cè)u(píng)分結(jié)果

4 討論

目前由于現(xiàn)有支原體雙價(jià)滅活疫苗覆蓋病原譜窄，預(yù)防效果并不理想。本研究通過(guò)對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)各區(qū)域羊場(chǎng)優(yōu)勢(shì)流行菌株進(jìn)行分離并篩選候苗株，嘗試研制出針對(duì)綿羊爛肺病的M.ovi、Pm（A/D 型）聯(lián)合滅活疫苗。為考查該疫苗對(duì)妊娠期母羊免疫接種的安全性，對(duì)孕后期母羊進(jìn)行了連續(xù)免疫單一劑量免疫試驗(yàn)及單次超劑量免疫試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，懷孕羊未出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)現(xiàn)象及征兆，所產(chǎn)羔羊未出現(xiàn)致畸現(xiàn)象，證明本疫苗對(duì)懷孕母羊安全可靠無(wú)副作用。同時(shí)為進(jìn)一步確定新生羔羊通過(guò)初乳獲得免疫母羊母源抗體的水平，以高繁湖羊懷孕母羊及其新生羔羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用ELISA 檢測(cè)對(duì)懷孕母羊及新生羔羊血清抗體水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，懷孕母羊在接受1 次三聯(lián)滅活疫苗免疫后即可產(chǎn)生抗M.ovi 及Pm 抗體，且與PBS 對(duì)照組相比差異極顯著。

新生羔羊在接受免疫母羊充足初乳飼喂后，免疫試驗(yàn)組母羊所產(chǎn)羔羊可獲得相應(yīng)被動(dòng)性保護(hù)抗體，且與PBS 對(duì)照組母羊所產(chǎn)羔羊相比差異極顯著。這說(shuō)明母源抗體可通過(guò)初乳有效傳遞給新生羔羊。同時(shí)為進(jìn)一步印證試驗(yàn)效果，本團(tuán)隊(duì)在新生羔羊出生60 d 后進(jìn)行迫殺剖檢，剖檢結(jié)果與ELISA 結(jié)果相符，接受母源抗體被動(dòng)保護(hù)的羔羊得到有效保護(hù)。

5 結(jié)論

本團(tuán)隊(duì)新研制的綿羊肺炎支原體-多殺性巴氏桿菌A/D 型三聯(lián)滅活疫苗應(yīng)用于孕后期母羊時(shí)安全可靠，未出現(xiàn)流產(chǎn)、弱羔、早產(chǎn)2 周齡羔羊及致畸等情況。

本團(tuán)隊(duì)新研制的綿羊肺炎支原體-多殺性巴氏桿菌A/D 型三聯(lián)滅活疫苗免疫孕畜后，初生羔羊可通過(guò)被動(dòng)免疫，使相應(yīng)抗體水平上升，獲得可靠的免疫保護(hù)。