杜連云，張慧娥，周蕖，張濤，黃鑫，劉芳鑫，李東飛，王恩鵬※，陳長(zhǎng)寶※

[1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司，吉林 通化 135300；3.國(guó)家中藥質(zhì)量檢測(cè)（北方）中心，吉林 長(zhǎng)春 130117]

細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛[Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.]、漢城細(xì)辛（Asarum sieboldii Miq.var.seoulense nakai）或華細(xì)辛（Asarum sieboldii Miq.）的干燥根和根莖，前兩者又習(xí)稱“遼細(xì)辛”[1]。目前市場(chǎng)上，根據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為北細(xì)辛在這3 種正品細(xì)辛中質(zhì)量最好[2]，逐漸成為市場(chǎng)流通的主流品種。東北三省是北細(xì)辛的主產(chǎn)地，其中以遼寧為主，其他地區(qū)如山東、陜西、河南及山西等地亦有分布[3,4]。根據(jù)文獻(xiàn)資料報(bào)道，北細(xì)辛在鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、止咳、抗氧化、抗抑郁和抑制癌細(xì)胞等方面扮演重要角色[5-8]，在治療感冒、流感、鼻炎或作為局部麻醉劑等方面發(fā)揮了重要作用[9]。

近年來，為了提高產(chǎn)量，控制害蟲和雜草等的侵害，藥材在種植過程中不免存在農(nóng)藥濫用的現(xiàn)象，嚴(yán)重威脅到人們的健康。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的前處理方法主要有固相萃?。⊿olid phase extraction SPE）法[10]、基質(zhì)固相分散萃取法[11]和QuEChERS（Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe）法等[12]。固相萃取法是近年發(fā)展起來一種樣品前處理技術(shù)，它可以有效的將分析物與干擾組分分離，提高分析物的回收率，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、重現(xiàn)性好，因此，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥多殘留的實(shí)際檢測(cè)之中[10]。檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[13]、液相色譜法[14]、氣相色譜質(zhì)譜（Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）法[15,16]和高效液相色譜質(zhì)譜（High performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS）法[17,18]。由于近年來科技的發(fā)展，GC 和LC 受方法靈敏度和選擇性限制，已無法達(dá)到目前的檢測(cè)要求。HPLC-MS 具有高通量的離子傳輸性能，選擇性和抗干擾能力強(qiáng)，可在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multi reaction monitoring,MRM）模式下實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣的同時(shí)分析百余種物質(zhì)，結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高[19]。本文將固相萃取法結(jié)合HPLC-MS法同時(shí)檢測(cè)北細(xì)辛藥材中30 種禁用農(nóng)藥殘留，該方法重復(fù)性良好、操作簡(jiǎn)便快捷且特異性強(qiáng)，可運(yùn)用到北細(xì)辛及其他藥材中的多農(nóng)藥殘留安全檢測(cè)與質(zhì)量控制之中。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent1290-6470 HPLC-MS型高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有ESI 源和Mass Hunter 定量處理軟件，美國(guó)安捷倫公司）；TD5A-WS 型離心機(jī)（湖南湘儀公司）；MilliQ 型超純水器（美國(guó)Millipore 公司）；賽多利斯BSA224S-CW 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；N-1300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA 公司）。

乙腈（色譜純），購自美國(guó)賽默飛世爾公司；農(nóng)藥殘留凈化包、農(nóng)藥殘留凈化管購自北京迪馬科技有限公司。

北細(xì)辛樣品：來源于吉林省和遼寧省不同產(chǎn)地的33 批抽檢樣品，見表1；30 種禁用農(nóng)藥混標(biāo)（批號(hào)：D6850065，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），見表2。

表1 33 批北細(xì)辛的來源及批號(hào)Table 1 Source and batch number of 33 batches of

表1 33 批北細(xì)辛的來源及批號(hào)Table 1 Source and batch number of 33 batches of

表2 MRM 模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters of MRM mode

1.2 供試品制備

用粉碎機(jī)將北細(xì)辛樣品粉碎成粉末，過3 號(hào)篩，置于干燥處備用。經(jīng)過前期對(duì)5 種方法[詳見中國(guó)藥典（2020 版）第四部通則]考察優(yōu)選后[20]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接提取-固相萃取法方法回收率最好，故最終采用直接提取-固相萃取法對(duì)北細(xì)辛藥材中的禁用農(nóng)藥進(jìn)行提取。

提取-凈化：參考中國(guó)藥典（2020版）第四部“2341農(nóng)藥殘留量測(cè)定法”第五法藥材及飲片（植物類）中禁用農(nóng)藥多殘留測(cè)定法。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配置

1.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密量取1.0 mL 禁用農(nóng)藥的混合對(duì)照品溶液（100g/mL），轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，乙腈進(jìn)行稀釋處理至目標(biāo)刻度線，搖勻后即得5g/mL 的混合對(duì)照品溶液。

1.3.2 空白基質(zhì)溶液的制備 該過程的處理方法與制備供試液時(shí)方法相同。取空白基質(zhì)樣品，參照供試液的制備，處理后即得到空白基質(zhì)溶液。

1.3.3 基質(zhì)混合對(duì)照溶液的制備 分別精密量取1.0 mL 空白基質(zhì)溶液，置氮吹儀上，40 ℃水浴濃縮至約0.6 mL，然后分別加入混合對(duì)照品溶液4L、10L、20L、40L、80L 和100L，并用乙腈進(jìn)行稀釋處理至1 mL 刻度線，渦旋混勻后即得0.02g/mL、0.05g/mL、0.10g/mL、0.20g/mL、0.40g/mL 和0.50g/mL 的基質(zhì)混合對(duì)照品溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm 100 mm，1.8m）；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：4 ℃；流速：0.25mL/min；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸5mmoL 甲酸銨水溶液，B為乙腈；進(jìn)樣體積：2L；梯度洗脫:0～4min，10%～49%B，4～15 min，49%～60% B，15～20 min，60%～80% B，20～20.1 min，80%～95% B，20.1～25 min，95%B，25～25.1 min，95%～10%B，25.1～30 min，10%B。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI），干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量7 L/min；霧化器壓力：30 psi；鞘氣溫度：325 ℃；鞘氣流量：11 L/min；毛細(xì)管電壓：3 500 V；模式：MRM 掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)效應(yīng)

細(xì)辛藥材中基質(zhì)較為復(fù)雜，含有多糖類物質(zhì)和色素，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，如不去除，目標(biāo)色譜峰被干擾，難以對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量。通常的解決辦法有用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線、稀釋法和加入保護(hù)劑法。對(duì)北細(xì)辛進(jìn)行前處理時(shí)，在待凈化的乙腈樣品直接提取液中，使用無水硫酸鎂進(jìn)一步除水，加入PSA 可去除有機(jī)酸、糖類和色素等，加入C18吸附非極性物質(zhì)，另外還可以去除脂質(zhì)。為了增加試驗(yàn)準(zhǔn)確度及盡可能降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，本方法采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

通過直接進(jìn)樣方式，優(yōu)化30 種待測(cè)農(nóng)藥的混合對(duì)照品溶液的質(zhì)譜參數(shù)。首先對(duì)待測(cè)農(nóng)藥混標(biāo)分別進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜全掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正離子模式掃描的峰豐度高于負(fù)離子模式，所以選擇正離子為本方法的掃描模式。在確定母離子后，以正離子模式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，以豐度最強(qiáng)、次強(qiáng)的碎片分別作為定量、定性離子。在正離子MRM 模式下對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到的質(zhì)譜條件，見表2。

2.3 線性關(guān)系

以1.3 項(xiàng)下各基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)物離子的峰面積作為縱坐標(biāo)，將標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。30 種禁用農(nóng)藥線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，根據(jù)表3 所示，線性范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，以儀器能檢出基質(zhì)混合對(duì)照品溶液并能定量的最低量得出方法的檢出限（Limits of detection,LODs）為0.004～ 0.020 mg/kg，定量限（Limits of quantification,LOQs）以中國(guó)藥典（2020 版）第一部“0212 藥材和飲片檢定通則”項(xiàng)下藥材及飲片（植物類）禁用農(nóng)藥定量限值規(guī)定為參照，為0.010～0.200 mg/kg。

表3 30 種禁用農(nóng)藥殘留的線性關(guān)系、檢出限及定量限Table 3 Linear relationships,the limits of detection and the limits of quantification of 30 kinds of banned pesticides

2.4 回收率

在北細(xì)辛空白樣品中加入3 個(gè)水平（低、中和高）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2 項(xiàng)下北細(xì)辛樣品前處理方法，檢測(cè)樣品的加標(biāo)回收率（n=6），結(jié)果見表4。由表4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，細(xì)辛中30 種禁用農(nóng)藥的平均回收率為81.35%～104.35%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviations,RSD）在2.1%～7.6%，符合中國(guó)藥典（2020 版）第四部“2341 禁用農(nóng)藥殘留”回收率的相關(guān)規(guī)定。

表4 30 種禁用農(nóng)藥殘留的平均回收率結(jié)果Table 4 Results of the average recoveries of 30 kinds of banned pesticide residues

2.5 實(shí)際樣品分析

按照中國(guó)藥典（2020 版）第一部“0212 藥材和飲片檢定通則”項(xiàng)下規(guī)定藥材及飲片（植物類）禁用農(nóng)藥不得檢出（不得過定量限）所述方法，對(duì)本文中涉及的33 批北細(xì)辛藥材樣品進(jìn)行的檢測(cè)，結(jié)果在33 批北細(xì)辛藥材均未檢出30 種禁用農(nóng)藥殘留。

3 討論

以植物為原料的中藥材在中國(guó)由來已久，但是其有毒有害殘留物已經(jīng)影響了藥物的療效和安全。本研究采用直接提取法結(jié)合固相萃取法對(duì)北細(xì)辛樣品進(jìn)行快速前處理及凈化，使用HPLC-MS 法建立了北細(xì)辛藥材中甲胺磷、苯線磷及苯線磷砜等30 種禁用農(nóng)藥殘留量的測(cè)定方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，液相色譜和質(zhì)譜的串聯(lián)能夠避免雜質(zhì)的干擾，尤其是對(duì)于含有復(fù)雜成分的北細(xì)辛樣品，能有效地吸附和去除雜質(zhì)，避免產(chǎn)生交叉污染，減少假陽性的檢出率，在互相不干擾的情況下使每個(gè)目標(biāo)檢測(cè)物能充分的分離和出峰，并展現(xiàn)出美觀的峰形，便于后續(xù)定量，同時(shí)能提高分析的選擇性和檢測(cè)靈敏度，可達(dá)到檢測(cè)濃度較低及準(zhǔn)確定量的目的。因此，本方法適用于北細(xì)辛樣品中30 種禁用農(nóng)藥的分析檢測(cè)，對(duì)北細(xì)辛藥材的質(zhì)量安全控制提供了禁用農(nóng)藥監(jiān)測(cè)的有力借鑒和技術(shù)保障。