羅玲，唐文婷，易睿，張楠，周小娟，唐亮

（長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410219）

高血脂癥（Hyperlipemia）是由于脂肪代謝運(yùn)轉(zhuǎn)異常造成血漿中的總膽固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglycerides,TG）與低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL-C）高于正常值，或高密度脂蛋白（High density lipoprotein,HDL-C）低于正常值的一種疾病[1]。高血脂癥發(fā)病因素較多，包括遺傳因素、年齡、性別因素、飲食因素、情緒因素和生活習(xí)慣等[2]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)高血脂癥的治療以化學(xué)藥物如他汀類(lèi)、樹(shù)脂類(lèi)和降甘油三酯類(lèi)為主[3]。與西藥相比，中藥對(duì)高血脂癥的治療效果已顯示出諸多優(yōu)點(diǎn)，但其作用機(jī)制比較復(fù)雜。

何首烏[Fallopia multiflora (Thunb.) Harald.]是廖科何首烏屬多年生纏繞藤本植物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，何首烏具有抗衰老、降血脂和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等功能[5]。已有研究報(bào)道了何首烏降血脂效果，其降血脂成分主要集中在水提多糖、堿提多糖、醋酸乙酯提取物和二苯乙烯苷類(lèi)[6,7]。然而，有關(guān)何首烏降血脂的分子機(jī)制研究比較少見(jiàn)，僅有俞捷等[8]和韓曉等[9]報(bào)道了何首烏二苯乙烯苷可通過(guò)調(diào)控甘油三酯、膽固醇的合成、分解及轉(zhuǎn)運(yùn)的多個(gè)關(guān)鍵酶或關(guān)鍵蛋白及低密度脂蛋白受體的表達(dá)，達(dá)到降脂目的。因此，采用動(dòng)物模型探究何首烏提取液的降脂機(jī)制具有重要意義。本研究參考鄒佳益等[10]的方法，采用高脂飼料建立高脂動(dòng)物模型，并利用何首烏提取液干預(yù)小鼠高血脂癥模型，研究何首烏的降血脂效果。利用RNA-seq 測(cè)序檢測(cè)肝臟組織差異表達(dá)基因，深入闡明何首烏降血脂的分子機(jī)制，為何首烏的降血脂研究提供試驗(yàn)依據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

何首烏經(jīng)儀器打磨成粉，過(guò)3 次四號(hào)篩（65 目），稱(chēng)取100g，然后加入6 倍體積的75%乙醇煎煮回流2次，每次1 h，通過(guò)離心10 min 后獲取上清液。將2 次的上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮至無(wú)乙醇味，使最終的藥物濃度相當(dāng)于生藥計(jì)1 g/mL，4 ℃冰箱保存待用。高濃度取1 g/mL、中濃度取1 g/mL 稀釋為60%溶液（0.6g/mL），低濃度取1g/mL稀釋為30%溶液（0.3g/mL）[8]。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

60 只昆明種雄性小鼠，購(gòu)于長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，體重18～22 g，鼠齡3 個(gè)月，飼養(yǎng)于普通環(huán)境中，飼養(yǎng)溫度23～26 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。隨機(jī)數(shù)字表法分為5 組（n=12）：正常對(duì)照組，高脂模型組，何首烏提取液高、中、低濃度組。除正常對(duì)照組外，其他4 組采用高脂飼料喂養(yǎng)，誘導(dǎo)建立高血脂模型。8 周后何首烏提取液高、中和低濃度組分別采用1.0 g/mL、0.6 g/mL和0.3 g/mL進(jìn)行腹腔注射（0.1 mL/10 g）[9]。正常對(duì)照組和高血脂模型組腹腔注射等體積生理鹽水，每天給藥1 次，持續(xù)60d。干預(yù)結(jié)束，小鼠腹腔注射4%水合氯醛（1 mL/100 g）。待小鼠麻醉后，摘除眼球取血，在4 ℃下3 500 r/min離心10 min，取上清于 20 ℃待用。斷頭處死小鼠，取出肝組織，于 80 ℃冰箱保存。

1.3 試劑

TC、TG、HDL-C 和LDL-C 試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京建成生物工程研究所。RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT試劑盒（Code No.:RR037A）及TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒（Code No.:RR82WR）均購(gòu)自日本TAKARA 公司。

1.4 儀器

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（長(zhǎng)沙市卓成醫(yī)療器械有限公司）；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 血脂指標(biāo)測(cè)定 取每組離心所得血清樣本，根據(jù)試劑盒說(shuō)明，配置檢測(cè)TC、TG、HDL-C 和LDL-C含量所需的試劑溶液，通過(guò)化學(xué)比色分析并計(jì)算TC、TG、HDL-C 和LDL-C 含量[11]。

1.5.2 肝臟RNA 提取及RNA-seq 測(cè)序 根據(jù)干預(yù)結(jié)果，選取高濃度何首烏提取液組和模型對(duì)照組小鼠肝邊緣區(qū)組織（n=3）。AMBION 試劑盒提取總RNA。NanoDrop 和Agilent 法檢測(cè)總RNA 質(zhì)量。通過(guò)高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina 進(jìn)行測(cè)序得到轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)（由上海歐易生物科技有限公司完成）。

1.5.3 差異表達(dá)基因分析 利用DESeq 軟件篩選差異蛋白編碼基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能分析和KEGG pathway 分析。采用STRING 軟件進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析（PPI）。

表1 PCR 引物Table 1 PCR primers

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS25.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。對(duì)于連續(xù)型變量進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)。對(duì)于符合正態(tài)性分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齊性，組間比較采用Least-significant difference（LSD）檢測(cè)，若方差不齊，組間比較采用Welch 近似F 檢驗(yàn)，P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 何首烏提取物對(duì)高血脂模型小鼠血脂的影響

與正常對(duì)照組相比，高血脂模型對(duì)照組小鼠血清中的TC、TG 和LDL-C 水平顯著升高（P ＜0.05），而HDL-C 水平顯著降低（P ＜0.05）。結(jié)果提示，高血脂小鼠建模成功。

與高血脂模型組相比，高濃度何首烏組中的TC、TG 和LDL-C 水平顯著降低（P ＜0.05），HDL-C 水平顯著升高（P ＜0.05）。中、低濃度何首烏提取液降脂效果不明顯（P ＞0.05）。這些結(jié)果表明，高濃度何首烏提取液能有效降低高血脂模型小鼠血清TC、TG 和LDL-C 水平，提高HDL-C 水平，見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平（，n=12）Table 2 Levels of TC,TG,HDL-C and LDL-C in mice blood(,n=12) 單位：mmol/L

表2 各組小鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平（，n=12）Table 2 Levels of TC,TG,HDL-C and LDL-C in mice blood(,n=12) 單位：mmol/L

注：**高脂模型組小鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平相比于正常對(duì)照組有顯著差異（P ＜0.05）。##何首烏高劑量組小鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平相比于高脂模型組有顯著差異（P ＜0.05）。縮寫(xiě)：TC.總膽固醇；TG.甘油三酯；LDL-C.低密度脂蛋白；HDL-C.高密度脂蛋白。Note:**Compared with normal control group,serum TC,TG,HDL-C and LDL-C levels in hyperlipidemic model group were significantly different(P ＜0.05).##Compared with the high fat model group,the serum TC,TG,HDL-C and LDL-C levels in the high concentration F.multiflora were significantly different(P ＜0.05).Abbreviations:TC.Total cholesterol;TG.Triglyceride;LDL-C.Low-density lipoprotein;HDL-C.high-density lipoprotein.

2.2 基因差異表達(dá)及聚類(lèi)分析

轉(zhuǎn)錄組分析共獲得40.73 G 數(shù)據(jù)。各樣本的有效數(shù)據(jù)量分布在6.67～6.94 G。Q30 堿基分布在94.24%～94.35%，平均GC 含量為50.55%。根據(jù)蛋白編碼基因在不同樣本中的表達(dá)量進(jìn)行差異篩選，共檢測(cè)到的787個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因260 個(gè)，下調(diào)基因527 個(gè)，見(jiàn)圖1 A。其聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖1 B，差異基因的詳細(xì)情況見(jiàn)火山圖，見(jiàn)圖1 C。隨機(jī)選擇CES1D、PEMT、MGST3、ANGPTL4、ANKRD26 和MFSD2A 等6 個(gè)差異基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，結(jié)果顯示，差異基因表達(dá)的相對(duì)趨勢(shì)與RNA-seq 結(jié)果趨勢(shì)一致，見(jiàn)圖1 D。

圖1 何首烏干預(yù)高血脂小鼠模型肝臟差異表達(dá)基因譜Fig.1 Differentially expressed gene profiles in the liver of hyperlipidemia mice induced by

2.3 差異表達(dá)基因功能分析

用GO 分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類(lèi)。差異表達(dá)基因富含了532 種細(xì)胞組分類(lèi)別，如絲氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶復(fù)合體、UBC13-MMS2 復(fù)合體、ISWI 復(fù)合體、RSF 復(fù)合體和CHOP-ATF4 復(fù)合體。注釋基因參與了933 個(gè)分子功能，如葡萄糖-1,6-二磷酸合酶活性、質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)體活性和胍基乙酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性等；參與了2 869 個(gè)生物過(guò)程，如短鏈脂肪酸分解代謝過(guò)程、細(xì)胞對(duì)甘油三酯的反應(yīng)過(guò)程和脂蛋白正向調(diào)節(jié)代謝過(guò)程等，見(jiàn)圖2 A。KEGG 富集通路分析表明，何首烏降脂過(guò)程參與多條生物通路，如脂質(zhì)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和異生化物的生物降解與代謝等通路，見(jiàn)圖2 B。

圖2 何首烏干預(yù)高血脂小鼠模型肝臟差異表達(dá)基因GO 和KEGG 分析Fig.2 Analysis of the differentially expressed genes GO and KEGG in the liver of hyperlipidemia mouse model interfered by

2.4 轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因預(yù)測(cè)分析

通過(guò)比較全部基因和差異基因（上調(diào)和下調(diào)）的轉(zhuǎn)錄因子的分布情況，共找到67 個(gè)具有明顯差異的轉(zhuǎn)錄因子，見(jiàn)圖3。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的總基因數(shù)量從0 到563。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的差異基因數(shù)量從0 到40。呈上調(diào)趨勢(shì)的差異轉(zhuǎn)錄因子有5 個(gè)，呈下調(diào)趨勢(shì)的差異轉(zhuǎn)錄因子有16 個(gè)。

2.5 差異表達(dá)基因相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

為探究差異表達(dá)基因編碼的相關(guān)蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系，本文采用PPI 法進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。按照互作結(jié)合分?jǐn)?shù)從高到低排序，篩選Top300 差異基因的互作關(guān)系結(jié)果。如圖4 A、4 B 所示，Top 300 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析中共有126 個(gè)差異表達(dá)基因（70 個(gè)表達(dá)下調(diào)，56 個(gè)表達(dá)上調(diào)），其中34 個(gè)差異基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子且表達(dá)上調(diào)，58 個(gè)差異基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子且表達(dá)下調(diào)，22 個(gè)差異基因?yàn)榘谢蚯冶磉_(dá)上調(diào)，12 個(gè)差異基因?yàn)榘谢蚯冶磉_(dá)下調(diào)。

圖4 Top300 差異基因的互作關(guān)系圖Fig.4 Interaction between top 300 differentially expressed genes in the liver of hyperlipidemic mice interfered by

3 討論

本研究采用何首烏干預(yù)高血脂小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)高濃度何首烏提取液能有效降低TC、TG 和LDL-C水平，提高HDL-C 水平，起降血脂作用。采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，發(fā)現(xiàn)787 個(gè)有顯著差異表達(dá)的基因，其可能與血脂調(diào)控相關(guān)。

降血脂機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，它包括機(jī)體的各個(gè)方面機(jī)體功能下降的過(guò)程以及機(jī)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，如機(jī)體的免疫能力下降、神經(jīng)退行性病變和抗氧化能力減弱等[12]。研究表明，何首烏降脂主要通過(guò)直接抑制機(jī)體對(duì)外源性脂質(zhì)的吸收及減少肝腸循環(huán)中重吸收入血的脂質(zhì)含量[10]。何首烏能與膽固醇結(jié)合，減少膽固醇經(jīng)腸道的吸收。其所含蒽醌類(lèi)化合物還能促進(jìn)腸蠕動(dòng)，抑制膽固醇在腸道的再吸收，并能促進(jìn)膽固醇代謝[13]。此外，何首烏的卵磷脂成分進(jìn)入血液可吸附血管壁上的膽固醇，從而降低血脂[14]。何首烏主要活性物質(zhì)2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O--D-葡萄糖苷能夠抑制膽固醇合成酶并且升高低密度脂蛋白受體的表達(dá)[15]。本試驗(yàn)結(jié)果證明，高濃度何首烏提取液可以降低高血脂模型小鼠血清中的TC 和TG 水平，提高血清HDL-C 水平，其可能通過(guò)抑制外源性TG 和TC的消化吸收發(fā)揮作用。然而，具體機(jī)制還有待證實(shí)。

轉(zhuǎn)錄組分析共檢測(cè)到787 個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因260 個(gè)，下調(diào)基因527 個(gè)。通過(guò)KEGG 富集分析表明，差異表達(dá)基因多富集于短鏈脂肪酸分解代謝過(guò)程、細(xì)胞對(duì)甘油三酯的反應(yīng)過(guò)程和脂蛋白正向調(diào)節(jié)代謝過(guò)程等。PEMT基因主要在肝臟組織中表達(dá)，激活后可調(diào)控與葡萄糖的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運(yùn)、利用及脂肪代謝的調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷小鼠體內(nèi)PEMT途徑，小鼠血液中的膽固醇水平明顯降低，此外，也能使血液中同型半胱氨酸水平降低一半[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)何首烏干預(yù)后，小鼠PEMT 基因顯著上調(diào)，其可能通過(guò)調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)，影響血脂水平。ANGPTL4 基因主要在脂肪組織和胚胎中表達(dá)，參與脂質(zhì)代謝、糖代謝及血管新生等過(guò)程。ANGPTL4 基因的表達(dá)受禁食、肥胖、高脂肪飲食和過(guò)氧化物體增殖體激活受體（PPARs）調(diào)控[17]。此外，ANGPTL4 也可能通過(guò)上調(diào)脂肪甘油三酯酶而激活脂解[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，何首烏干預(yù)后，ANGPTL4 基因表達(dá)顯著降低，表明ANGPTL4 基因可能與脂質(zhì)代謝有關(guān)。然而，其參與血脂調(diào)控代謝的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，后期重點(diǎn)探究上述基因參與血脂代謝的分子機(jī)制。

目前已發(fā)現(xiàn)較多與脂質(zhì)代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，包括過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）、肝X 受體（LXR）、視黃醛受體（RXR）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPs）、法尼酯衍生物X 受體（FXR）、糖應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（ChREBP）、孕烷X 受體（PXR）及肝細(xì)胞核因子4（HNF4）等[19]。PPARs 是配體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，與另外一種RXR 形成異二聚體，結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)的特異反應(yīng)元件（PPRE）上，從而發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用[20]。ChREBP 的靶基因主要是參與糖酵解和脂質(zhì)合成的一些酶類(lèi)，ChREBP 的激活可促進(jìn)葡萄糖向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化[21]。因此，這些類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子可能參與肝臟脂質(zhì)代謝過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)，高濃度（0.6 g/mL）何首烏能有效降低高血脂小鼠模型血清血脂，其作用機(jī)制可能涉及CES1D、PEMT、MGST3、ANGPTL4、ANKRD26、MFSD2A 等基因以及PPARs、RXR、ChREBP 等轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)。本研究可為后續(xù)何首烏干預(yù)高血脂的機(jī)制研究提供新的思路。