肖自添，何煥清，彭洋洋，劉明，徐江

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東省草菇科技創(chuàng)新中心/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

蓋囊側(cè)耳（Pleurotus cystidiosus）又稱鮑魚菇、高溫平菇、黑鮑菇等，是側(cè)耳科側(cè)耳屬真菌，是一種高溫季節(jié)發(fā)生的珍稀菌類，在我國多分布于臺灣、福建、廣東、浙江、云南、海南和廣西等南方熱帶地區(qū)，在北美洲、歐洲也有分布[1]。野生蓋囊側(cè)耳多發(fā)生于榕樹、刺桐、鳳凰木、番石榴及法國梧桐等的腐木上。蓋囊側(cè)耳肉質(zhì)肥厚，味道鮮美，風(fēng)味獨(dú)特（有鮑魚風(fēng)味），經(jīng)煮耐貯，適合鮮銷和罐制[2]，且具有多種生物活性作用，如抗氧化[3]、抗腫瘤[4]和降血糖[5,6]等，是一種具有食用和藥用雙重價值的珍稀菌類。蓋囊側(cè)耳自然條件下發(fā)生較少，關(guān)于蓋囊側(cè)耳的鑒定、馴化栽培報道也較少。黃年來等[7]、李翠新等[8]和李蝶等[9]在福建、昆明及廣西等地發(fā)現(xiàn)了野生蓋囊側(cè)耳，并開展了鑒定和部分馴化栽培試驗(yàn)。我國從20 世紀(jì)70 年代初開始馴化、引種栽培蓋囊側(cè)耳，由于高溫高濕的氣候條件，鮑魚菇被大力推廣種植，研發(fā)了多種菜譜，生產(chǎn)的罐頭暢銷到東南亞及港澳臺等地，深受消費(fèi)者喜愛[10]。福建三明真菌研究所黃年來等在70 年代采集到野生蓋囊側(cè)耳進(jìn)行馴化栽培，獲得成功[11,12]。隨后郭美英[13]、趙彥杰[14]和胡曉艷等[15]對蓋囊側(cè)耳（鮑魚菇）的生物學(xué)特性、栽培技術(shù)和優(yōu)良配方篩選等進(jìn)行研究并推廣，使得蓋囊側(cè)耳在國內(nèi)逐漸被消費(fèi)者所認(rèn)識，但由于其發(fā)菌速度相對同屬側(cè)耳屬的平菇、鳳尾菇和秀珍菇等慢，生物轉(zhuǎn)化率相對偏低，市場上鮑魚菇的產(chǎn)品依然比較少見。蓋囊側(cè)耳適合在炎熱的夏季栽培，自然條件下其他食用菌難以生長，鮮菇斷檔的時候可作為有益的補(bǔ)充，滿足消費(fèi)者需求。目前，我國栽培的食用菌品種大多是中低溫型品種，集中在秋、冬、春三季，工廠化周年生產(chǎn)的也是中低溫的金針菇、杏鮑菇[16]、海鮮菇及雙孢菇等能耗大、生產(chǎn)成本高的品種。尋找耐高溫的優(yōu)良食用菌種質(zhì)資源，選育耐高溫菌株并進(jìn)行推廣利用對我國食用菌產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展十分有意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試野生菌株采集于華南師范大學(xué)廣州天河石牌校區(qū)一棵紫荊花樹上，經(jīng)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所進(jìn)行分離、提純和保存，編號為HSBYG，子實(shí)體形態(tài)見圖1。

圖1 鮑魚菇HSBYG 菌株子實(shí)體生態(tài)照Fig.1 Fruiting bod ? HSBYG strain

1.1.2 供試試劑 PCR 引物為ITS1 與ITS4，PCR 聚合酶（B639297-0005），由上海生工生物工程有限公司制備。DNA 提取與檢測試劑盒（B518259-0100），購自上海生工生物工程有限公司。PDA培養(yǎng)基購自江門市雅康農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.1.3 生物學(xué)特性培養(yǎng)基 碳源試驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨0.2%、瓊脂2%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、2%碳源、蒸餾水1 000 mL。替代碳源采用葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、淀粉和麥芽糖。

氮源試驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖2%、瓊脂2%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、0.2%氮源、水1 000 mL。替代氮源采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、黃豆粉和麩皮等有機(jī)氮以及氯化銨、硫酸銨。

溫度試驗(yàn)培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基。

pH 試驗(yàn)培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基，并用1 mol/L 鹽酸和1 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH。

1.1.4 馴化栽培培養(yǎng)基 原種及栽培種配方：棉籽殼88%、麩皮10%、碳酸鈣1%、石灰1%，含水量約60%、pH 為8。

栽培出菇配方：棉籽殼50%、玉米芯34%、麩皮15%、石灰1%，含水量約62%。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與培養(yǎng) 采用組織分離法。在無菌條件下對野生株子實(shí)體進(jìn)行表面消毒，用手術(shù)刀從菌柄與菌蓋交匯處切出大約0.3 cm2大小的組織塊，放于母種培養(yǎng)基中，置于（25±1）℃的恒溫箱中避光培養(yǎng)。待菌絲體長滿后，編號為HSBYG，再次轉(zhuǎn)管，放于4～8℃冰箱中冷凍保藏。

1.2.2 菌株的形態(tài)鑒定 觀察HSBYG 菌株的子實(shí)體形態(tài)，記錄其表觀特征。顯微鏡觀察HSBYG 菌株的菌絲和孢子形態(tài)。

1.2.3 菌株的分子鑒定 采用試劑盒提取法提取總DNA，依照上海生工生物工程有限公司購回的真菌DNA 提取試劑盒的試驗(yàn)步驟得到DNA，保存于 20 ℃。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在基因有限公司的Veriti 型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，ITS-PCR 反應(yīng)體系（20L）為：基因組DNA 0.2L（模板），正反引物（56mol/L）各0.8L，兩條引物分別為ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG），ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），2 Flash PCR Master Mix（Dye）10L，補(bǔ)充ddH2O 至20L。

擴(kuò)增反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)33 次；完成后保存在4 ℃冰箱，由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，將菌株檢測完成后送回的ITS基因組順序，提交到GenBank 核酸擴(kuò)增序列數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)一步運(yùn)用BLAST 程序，與GenBank 和CBOL中的ITS 基因組序列開展同源性比對，搜索相似的基因序列，用MEGA7.0 軟件系統(tǒng)，Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Kimura2-parameter法估算遺傳間距，分析同源關(guān)系。

1.2.4 生物學(xué)特性研究 最適碳源、氮源、溫度及pH試驗(yàn)均采用平板培養(yǎng)法（直徑90 mm），進(jìn)行5 次重復(fù)試驗(yàn)。無菌條件下，先將已活化的約0.4 cm2組織塊，直接接種于培養(yǎng)器中，于接種塊下方劃一刻度線作為測量的開始線，置于28 ℃恒溫箱中避光培養(yǎng)，待其中一試驗(yàn)組長滿培養(yǎng)皿后，終止培養(yǎng)，計算菌絲日均長速。菌絲的生長速率=菌落半徑增長度（mm）/培養(yǎng)時間（d）。溫度試驗(yàn)置于不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，避光培養(yǎng)。

1.2.5 馴化栽培試驗(yàn) 試驗(yàn)選用規(guī)格為17 cm 36 cm、厚0.5 mm 的聚丙烯塑料袋，每袋裝培養(yǎng)料約500 g（干重計），含水量60%～62%，30 包，3 次重復(fù)。采用常規(guī)代料栽培方法。接種后將菌包搬入恒溫培養(yǎng)室內(nèi)發(fā)菌，室內(nèi)保持黑暗，培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)受污染的菌包及時清理出培養(yǎng)室。待菌絲長滿菌包后進(jìn)行出菇管理。打開蓋子取下套環(huán)，將菌袋均勻擺放到出菇房，保持溫度25～28 ℃、空氣相對濕度85%～95%，出菇房經(jīng)常通風(fēng)換氣，保持新鮮的氧氣供應(yīng)。記錄菌絲生長速度、產(chǎn)量和子實(shí)體商品性等。

1.2.6 子實(shí)體粗多糖、總?cè)坪繙y定 子實(shí)體粗多糖檢測采用《NYT 1676-2008 食用菌中粗多糖含量的測定》、總?cè)茀⒖肌禢YT 3676～2020 靈芝中總?cè)坪康臏y定》。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和分析采用Excel 統(tǒng)計軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株子實(shí)體形態(tài)特征

供試菌株子實(shí)體為叢生，部分為單生，菌蓋直徑達(dá)7～14 cm，菌蓋初期黑色，后為灰黑色或黑褐色，最后變?yōu)榘祷疑?，扇形至平展，表面光滑、干燥，菌肉較厚，淡黃色，菌褶間距稍寬，線狀延生，不等長，乳白色；菌柄中生或偏生，長1.8～9.8 cm，粗1.1～3 cm，暗灰色。菌絲體白色，在PDA 培養(yǎng)基上呈放射性狀生長（圖2 a），氣生菌絲比較旺盛，有鎖狀聯(lián)合（圖2 b），后期可形成大量黑色分生孢子梗束（圖2 a），栽培菌包成熟后也會形成大量黑色分生孢子梗束，分生孢子呈長橢圓形或棒狀（圖2 c），孢子印乳白色（圖2 d），孢子透明，結(jié)果與黃年來編著的《中國食藥用菌學(xué)》中鮑魚菇的特征較一致。

圖2 鮑魚菇HSBYG 菌絲體和孢子形態(tài)Fig.2 Mycelial and spore of Pleurotus cystidiosus HSBYG strain

2.2 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)PCR 擴(kuò)增和ITS 序列測定，得到HSBYG 菌株的ITS 片段序列長度為696bp，見圖3 和圖4。將檢測結(jié)果在GeneBank 上加以比對，發(fā)現(xiàn)該菌株與側(cè)耳屬的蓋囊側(cè)耳（Pleurotus cystidiosus，登錄號:KX787085.1）的物種相似性最大，達(dá)99.71%。進(jìn)一步使用了MEGA7.0軟件，以供試菌株和CBOL 和Gene Bank 中的已知側(cè)耳屬（Pleurotus）菌株ITS片段構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），供試菌種與蓋囊側(cè)耳（Pleurotus cystidiosus）的親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS 序列測定，可以確定該野生菌株為側(cè)耳科側(cè)耳屬蓋囊側(cè)耳，也稱鮑魚菇，編號為HSBYG。

圖3 供試菌株HSBYG 測序結(jié)果Fig.3 The sequencing result of Pleurotus cystidiosus HSBYG strain

圖4 供試菌株HSBYG 的ITS 序列擴(kuò)增效果Fig.4 The ITS sequencing result ofHSBYG strain

圖5 不同側(cè)耳屬DNA-ITS 序列間構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic trees of different Pleueras by the DNAITS sequences

2.3 不同碳源對HSBYG的菌絲體生長影響

從表1 得知，HSBYG 的菌絲在葡萄糖和蔗糖等6 種碳源中均可正常生長（圖6），在以麥芽糖為碳源培養(yǎng)時，菌絲長勢好，生長速度快，達(dá)到了3.30 mm/d，其次為淀粉和果糖，但三者沒有顯著差異；以乳糖為碳源時菌絲生長速度最慢，僅有1.94 mm/d，極顯著低于其他碳源。綜上所述，該菌株菌絲的最佳碳源是麥芽糖，其次是果糖和淀粉。

表1 不同碳源對HSBYG 菌絲生長情況比較Table 1 Effect of carbon sources on mycelia growth of HSBYG

圖6 不同碳源對HSBYG 的菌絲體生長的影響Fig.6 Effect of carbon sources on mycelia growth of HSBYG

2.4 不同氮源對HSBYG的菌絲體生長影響

由表2 可知，HSBYG的菌絲在牛肉膏和蛋白胨等7種氮源中均可生長（圖7）以牛肉膏為氮源時，HSBYG的菌絲長勢最好，生長速度最快，達(dá)3.13 mm/d，其次是黃豆粉和麩皮，但三者沒有顯著差異；以硫酸銨為氮源時菌絲生長速度最慢，長勢弱，僅有0.97 mm/d，其次是氯化銨，這兩種氮源極顯著低于其他氮源，且接種后發(fā)菌時間也比其他氮源慢。黃豆粉和麩皮的長速和長勢居中，優(yōu)于蛋白胨和酵母膏，但四者間沒有顯著差異。綜上所述，該菌株菌絲的最佳氮源是牛肉膏，其次是黃豆粉和麩皮。

表2 不同的氮源對HSBYG 菌絲生長情況比較Table 2 Effect of nitrogen sources on mycelia growth of HSBYG

圖7 不同氮源對HSBYG 菌絲體生長的影響Fig.7 Effect of nitrogen sources on mycelia growth of HSBYG

2.5 不同pH對HSBYG的菌絲體生長影響

由表3 可知，HSBYG 的菌絲在pH 5.0～9.0 的范圍內(nèi)均可正常生長（圖8），說明其可生長的pH范圍較廣，隨著pH 升高，菌絲生長速度呈上升趨勢，pH 在7.0 時，菌絲生長速度和長勢均為最優(yōu)，長速達(dá)3.37mm/d，其后菌絲生長速度和長勢趨于平穩(wěn)，pH 8.0～9.0 的長速均比pH7.0 的要慢，但沒有顯著差異。pH 在5.0 的時候，發(fā)菌晚，生長速度慢，表明pH 低于6 不適合H SBYG菌絲生長。綜上結(jié)果可知，HSBYG菌株比較適合在中性偏堿的環(huán)境中生長，適宜生長的pH 是7.0。

表3 不同PH 對HSBYG 菌絲生長情況比較Table 3 Effect of pH on mycelia growth of HSBYG

2.6 不同溫度對HSBYG的菌絲體生長影響

不同溫度HSBYG 菌絲生長的影響結(jié)果，見表4，HSBYG 菌絲在15～35 ℃的范圍內(nèi)均可生長（圖9），10 ℃時菌絲不能萌發(fā)，但是隨著溫度的升高，菌絲生長速度呈先升后降的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到25 ℃時，菌絲生長速度達(dá)到最快，隨后會隨著溫度的升高而下降，培養(yǎng)溫度高于30 ℃時菌絲生長速度會進(jìn)一步放緩。綜上結(jié)果可知，該菌株適宜在25～30 ℃范圍生長。

表4 不同的溫度對HSBYG 菌絲生長情況比較Table 4 Effect of temperature on mycelia growth of HSBYG

2.7 HSBYG的子實(shí)體商品性及多糖、三萜含量分析

HSBYG 液體菌種培養(yǎng)5 d 即可用于接種，接種約30 d 長滿菌包，開袋后約7 d 出現(xiàn)原基（圖10），現(xiàn)原基后7～8d 即可采收，見圖11。生長周期為50～60 d，生長速度較平菇、秀珍菇慢。子實(shí)體出菇整齊，肉質(zhì)厚實(shí)，子實(shí)體單叢鮮重為95～195 g，含水量為84%～90%，菌蓋長4～12 cm、寬5～10 cm，瓦扇形，菌蓋厚1～3 cm，一潮菇生物轉(zhuǎn)化率約為27%，子實(shí)體多糖為5.97%，三萜含量為1.12%。

圖11 可采收的HSBYG 子實(shí)體Fig.11 The harvestable fruiting body of HSBYG

3 討論

蓋囊側(cè)耳為高溫型菌株，黃年來等[11]對福建一株野生鮑魚菇進(jìn)行人工栽培，指出該菌株菌絲最適宜生長溫度是27～28 ℃，子實(shí)體發(fā)生溫度25～33 ℃，最適溫度為27～28 ℃。李蝶等[9]對廣西大學(xué)校園內(nèi)一株野生泡囊側(cè)耳進(jìn)行馴化栽培，最適生長溫度為25～30 ℃，其中以30 ℃為最佳，本試驗(yàn)株菌絲最適生長溫度為25～ 30 ℃，其中以25 ℃最佳，子實(shí)體在25 ℃條件下開袋7 d 左右發(fā)生原基，15 d 左右采收，與黃年來等[17]和李蝶等[9]研究較一致。蓋囊側(cè)耳為木腐型真菌，對纖維素和木質(zhì)素分解利用較強(qiáng)，李蝶等[9]以木屑為主料栽培其生物學(xué)效率可達(dá)到43.33%，單菇重為79.51g/朵。徐彥軍等[17]利用玉米芯和玉米稈栽培鮑魚菇，結(jié)果顯示玉米芯營養(yǎng)更好，覆土栽培生物轉(zhuǎn)化率可達(dá)61.78%。汪國蓮等[18]利用意楊木屑添加適量棉籽殼進(jìn)行脫袋覆土培養(yǎng)鮑魚菇，其生物學(xué)轉(zhuǎn)化率可達(dá)105%。本試驗(yàn)以棉籽殼和玉米芯為主料栽培，單叢重為95～195 g，子實(shí)體商品性較好，出菇整齊。本試驗(yàn)只采收一茬，生物轉(zhuǎn)化率為27%，生物學(xué)效率略低，但從子實(shí)體商品性和第一茬產(chǎn)量比較，試驗(yàn)結(jié)果與李蝶、徐彥軍的結(jié)果較一致。鮑魚菇不僅肉質(zhì)爽脆，味道鮮味，其多糖具有抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用。劉振文[19]分析表明鮑魚菇子實(shí)體可溶性總糖（以葡萄糖計）為4.18%。胡曉艷[15]對不同培養(yǎng)料栽培的鮑魚菇子實(shí)體多糖進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示多糖含量為2.25%～6.54%。本試驗(yàn)子實(shí)體粗多糖含量為子實(shí)體多糖5.97%，三萜含量為1.12%，多糖含量較高。目前，關(guān)于蓋囊側(cè)耳的資源收集、鑒定和馴化利用較少，蓋囊側(cè)耳是側(cè)耳科側(cè)耳屬真菌，其栽培技術(shù)簡單，產(chǎn)量高，而且是一種非常適合夏季高溫季節(jié)栽培的菇類，因此，利用其選育耐高溫新品種有重大學(xué)術(shù)價值和市場前景。彭學(xué)文等[20]利用平菇和鮑魚菇單核菌絲經(jīng)原生質(zhì)體融合獲得新品種‘唐平0332’，該菌株出菇整齊、轉(zhuǎn)潮快，比對照生物學(xué)效率提高11%。本試驗(yàn)從蓋囊側(cè)耳野生菌株的鑒定、生物學(xué)特性分析、馴化栽培、子實(shí)體商品性和多糖含量分析等系統(tǒng)開展研究，研究結(jié)果可為蓋囊側(cè)耳的人工栽培及推廣應(yīng)用提供依據(jù)，也為后續(xù)選育廣溫、耐高溫型食用菌品種提供優(yōu)良種質(zhì)資源。