李春楠，申嘉明，呂經(jīng)緯，張楠茜，張輝，孫佳明

（長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117）

隨著全球老年人口的逐年增多，骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis,OP）發(fā)病率居高不下，OP 成為嚴(yán)重危害人類身體健康和影響生活質(zhì)量的疾病之一，在世界常見病的發(fā)病率排行中位列第7 位[1]，是世界性公共衛(wèi)生問題[2]。OP 是一種由于骨量丟失或降低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加及骨密度下降，容易引起骨折的全身代謝性骨病[3]，中老年人和絕經(jīng)后婦女尤為常見[4]。雖然OP 多數(shù)情況下不會(huì)直接導(dǎo)致死亡，但嚴(yán)重影響了患者的生活能力和生活質(zhì)量，為社會(huì)醫(yī)療增加負(fù)擔(dān)。當(dāng)前，OP發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在細(xì)胞分化與凋亡、成骨、破骨細(xì)胞影響和基因多態(tài)性等方面，治療OP 的藥物主要分為3 大類：骨吸收抑制藥、骨形成促進(jìn)藥和骨礦化促進(jìn)藥，常用的西藥副作用較多，長期使用會(huì)增加患乳腺癌、冠心病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，研究人員將目光投向了中醫(yī)藥，去尋找高效、低毒治療OP的藥物[6-9]。

鹿茸是上等的滋補(bǔ)保健品，我國擁有悠久的鹿產(chǎn)品食用歷史[10]。鹿茸作為名貴的中藥材，民間常用其泡酒來飲用以強(qiáng)身健體。經(jīng)國家市場監(jiān)督管理總局網(wǎng)站中特殊食品信息查詢平臺(tái)，檢索到含有鹿茸的保健食品有200 多種，主要以緩解體力疲勞和增強(qiáng)免疫力為主，此外，鹿茸與其他中藥配伍形成了新的保健作用，如抗疲勞保健食品人參紅景天鹿茸保健酒，改善睡眠的口服液等[11]。鹿茸在《本草綱目》記載：“生精補(bǔ)髓，養(yǎng)血益陽，強(qiáng)筋健骨”，即有補(bǔ)腎陽，益精血，強(qiáng)筋骨的作用，常用于陽痿滑精、宮冷不孕、神疲、崩漏帶下、陰疽不斂等，有廣泛的藥理作用。《素問·宣明五氣》記載：“腎主骨”；《素問·痿論》記載：“腎主身之骨髓”，“腎藏精，精能生髓，髓能充骨”，說明了腎與骨的關(guān)系非常密切。鹿茸入腎經(jīng)，因此，鹿茸具備抗OP 作用，兼具一定藥用功效和營養(yǎng)價(jià)值。

為了進(jìn)一步探討鹿茸抗OP 作用機(jī)制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)結(jié)合成骨細(xì)胞的驗(yàn)證方法，挖掘鹿茸潛在有效成分和作用靶點(diǎn)，闡明基因本體功能及信號(hào)通路，為鹿茸抗OP 研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

鹿茸切片購于吉林省雙陽梅花鹿廠；小鼠成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；MEM細(xì)胞培養(yǎng)液、雙抗購自美國HYCLONE公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Cell Counting Kit-8（CCK8）購自于北京博奧森；地塞米松、DAPI 染色液購自于索萊寶公司，SYBR Premix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ、Probe qPCR Mix等購自于長春百金生物科技有限公司。

GZLY-0.4 真空冷凍干燥機(jī)（北京速原中天科技有限公司）；BIO-RAD-680 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）；LineGene 9600 q-PCR儀（杭州博日科技）；CKX41 倒置顯微鏡（日本奧林巴斯）。

1.2 化學(xué)成分收集和篩選與靶點(diǎn)預(yù)測

由于鹿茸是非植物藥，檢索BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫設(shè)置閾值分?jǐn)?shù)（core）≥30 和P 值（P-value）≤0.05 篩選鹿茸成分；利用中國知網(wǎng)、Web of Science 等數(shù)據(jù)庫檢索日期2005年1 月1 日至2021 年7 月1 日，采用主題詞與自由詞結(jié)合的方式，中文檢索式為“鹿茸”和“化學(xué)成分”；英文檢索式為“pilose antler”and“chemical composition”研究文獻(xiàn)限定為核心期刊來源，篩除非動(dòng)物藥鹿茸文獻(xiàn)，納入鹿茸化學(xué)成分相關(guān)的文獻(xiàn)；收集、歸納和整理文獻(xiàn)中的鹿茸化學(xué)成分。

將檢索成分在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI，https://w-ww.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢相應(yīng)SMILES 號(hào)，應(yīng)用BATMAN-TCM、Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、SEA（http://sea.bkslab.org/）等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，最后將所有預(yù)測的靶點(diǎn)合并，整理查重，確定鹿茸中成分作用靶點(diǎn)。

1.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)收集

采用TTD（https://db.idrbl-ab.org/ttd/）、DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）、Drugbank 等數(shù)據(jù)庫，檢索“Osteoporosis”，收集整理和查重相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.4 鹿茸治療OP的核心靶點(diǎn)篩選

將前期檢索的化學(xué)成分預(yù)測靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)nipro（thttps://www.uni-prot.org/）中，考察范圍定位到人類，最后轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的Uniprot ID、基因名稱。以Uniprot 號(hào)為橋梁，將復(fù)方中所有成分預(yù)測靶點(diǎn)與疾病對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行合并，查找重復(fù)項(xiàng)。通過Image GP 平臺(tái)（http://www.ehbio.com/ImageGP/）將上述中藥活性成分靶點(diǎn)與OP 相關(guān)靶點(diǎn)映射，繪制韋恩圖，交集即為鹿茸治療OP 潛在核心靶點(diǎn)。

1.5 GO功能分析與KEGG通路富集

通過Cytoscape 3.7.1 軟件中的Clue Go 插件對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能進(jìn)行富集分析（P≤0.01），分析藥物作用靶點(diǎn)的PPI 及生物學(xué)過程，闡明靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的主要作用。另外，將篩選的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1），選擇KEGG 通路，物種設(shè)置為人，通路富集分析，闡明核心靶點(diǎn)在信號(hào)通路中的作用，得到抗骨質(zhì)疏松癥主要作用通路及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.6 構(gòu)建“中藥成分疾病靶點(diǎn)通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將鹿茸、疾病、活性成分、核心靶點(diǎn)、KEGG 通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件中，以五者為節(jié)點(diǎn)，點(diǎn)擊Merge 功能，相互關(guān)系分別用邊相連，構(gòu)建“中藥成分—疾病靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，P-value 值作為考察分析主要節(jié)點(diǎn)，確定主要成分、靶點(diǎn)與KEGG 通路。

1.7 分子對(duì)接計(jì)算與繪圖

應(yīng)用AutoDock 4.2.6 軟件將拓?fù)鋮?shù)靠前的化學(xué)成分作為配體，與拓?fù)鋮?shù)靠前的靶點(diǎn)作為受體進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能。受體結(jié)構(gòu)從蛋白數(shù)據(jù)庫中得到（PDB http://www.rcsb.org/pdb），應(yīng)用ChemBio3D Ultra（Cambridge soft Corp，Waltham，MA，USA）進(jìn)行配體的三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換使用，采用PyMOL 軟件查看分子對(duì)接復(fù)合體的3D 空間構(gòu)象。

1.8 體外細(xì)胞驗(yàn)證

1.8.1 鹿茸組分的制備 取鹿茸10 g，加10 倍量的水，粉碎，4 ℃浸提24 h 后閃提3 次，離心取上清，選用3 kDa 的Millipore 超濾膜對(duì)提取液進(jìn)行超濾，收集不同質(zhì)量范圍的溶液，凍干，得到鹿茸＜3 kDa 組分[12]。

1.8.2 MC3T3-E1 細(xì)胞存活率的測定 CCK8 法測定細(xì)胞存活率，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板，隨機(jī)分為空白組、模型組和給藥組，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞模型組和給藥組加入100mol/L 地塞米松造模24 h后，分別加入濃度為25g/mL、50g/mL、100g/mL、200g/mL 和300g/mL 樣品，每組5 個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10L CCK8 試劑，37 ℃避光孵育1 h，在酶標(biāo)儀450 nm 處檢測各組OD值。根據(jù)所測得吸光度，計(jì)算每組細(xì)胞存活率。

細(xì)胞熒光顯色觀察，MC3T3-E1 細(xì)胞在6 孔培養(yǎng)板中孵育，隨機(jī)分為空白組、模型組和給藥組，用100mol/L 地塞米松造模24 h 后，藥物分別加入50g/mL、100g/mL、200g/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。樣品處理后進(jìn)行DAPI 染色，每孔加入10L 細(xì)胞染色液DAPI，25 ℃孵育10 min，PBS 洗滌若干次，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)[13]。

1.8.3 MC3T3-E1 細(xì)胞SRC、IL6 和TNFmRNA 表達(dá)測定 提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA 濃度后，以1g總RNA 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法操作，將反轉(zhuǎn)錄體系稀釋10 倍后進(jìn)行Real-time PCR 反應(yīng)，檢測SRC、IL-6、TNF 基因的表達(dá)影響，以GAPDH 作為內(nèi)參，最后表達(dá)水平的差異倍數(shù)用2-Ct方法分析；引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，SRC 上引物序列（5'-3'）：GAACCCGAGAGGGACCTTC,下引物序列（5'-3'）：GAGGCAGTAGGCACCTTTTGT；IL-6 上引物序列（5'-3'）：CTGCAAGAGACTTCCATCCAG，下引物序列（5'-3'）：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG；TNF 上引物序列（5'-3'）：CAGGCGGTGCCTATGTCTC，下引物序列（5'-3'）：CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG。

1.8.4 數(shù)理統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組之間采用單因素方差分析（One-way ANOVA），柱形圖由GraphPad Prism 5.0 軟件生成，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿茸化學(xué)成分信息

檢索BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫共有14 種鹿茸化合物，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，整理后確定了58 種化合物，包括氨基酸、肽類、核苷酸、激素類和生長因子等，見表1。

表1 檢索的鹿茸化學(xué)成分主要信息Table 1 Main information of chemical constituents of pilose antler retrieved

2.2 鹿茸抗OP的核心靶點(diǎn)確定

成分經(jīng)數(shù)據(jù)庫預(yù)測對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，整理和查重后共有1 331 個(gè)靶點(diǎn)；數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點(diǎn)，整理后共得到121個(gè)疾病靶點(diǎn)。將鹿茸成分預(yù)測靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集，整理確定其核心靶點(diǎn)為33 個(gè)，見圖1；登陸DisGeNET 網(wǎng)站，輸入U(xiǎn)niprot 確定其蛋白歸屬，核心靶點(diǎn)，見表2。

圖1 鹿茸和OP 交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of intersection target of pilose antler and OP

表2 鹿茸治療OP 疾病的核心靶點(diǎn)信息Table 2 Core target information of pilose antler in treating OP disease

2.3 GO功能富集分析

核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，得到流體剪切應(yīng)力的細(xì)胞反應(yīng)（Cellular response to fluid shear stress）、一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)節(jié)（Positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、單加氧酶活性的調(diào)節(jié)（Regulation of monooxygenase activity）和藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（Drug transmembrane transport）等4 大類生物學(xué)過程，流體剪切應(yīng)力是可以促進(jìn)類成骨細(xì)胞向成骨方向進(jìn)一步分化且與Cbfa1/Runx2 的表達(dá)相關(guān)聯(lián)的過程；生物過程主要富集在維生素D生物合成過程（Vitamin D biosynthetic process）、三磷酸腺苷水解偶聯(lián)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（ATP hydrolysis coupled anion transmembrane transport）等生物過程，見圖2 和圖3。

圖2 GO 功能分析餅狀圖Fig.2 Pie chart of GO functional analysis

圖3 GO 功能分析具體分類圖Fig.3 Specific classification diagram of GO functional analysis

通過ClueGO 功能分析生物學(xué)過程互作網(wǎng)絡(luò)，可發(fā)現(xiàn)生物過程之間的相互作用關(guān)系。圖4 顯示了4 大類不同生物過程的相互作用，不同顏色代表不同生物過程，其中流體剪切應(yīng)力的細(xì)胞反應(yīng)（Cellular response to fluid shear stress）生物過程顏色最深，節(jié)點(diǎn)也較多，節(jié)點(diǎn)的大小代表調(diào)控的強(qiáng)弱，節(jié)點(diǎn)間的連線代表相互作用，可見骨吸收的調(diào)節(jié)（Regulation of bone resorption）、組織重塑調(diào)節(jié)（Regulation of tissue remodeling）和骨吸收（Bone resorption）等生物過程相互作用密切。

圖4 生物學(xué)過程互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network diagram of biological process interaction relationship

2.4 KEGG通路分析

通過核心靶點(diǎn)的KEGG 分析，得到膽汁分泌通路（Bile secretion）、類固醇激素生物合成通路（Steroid hormonebiosynthesis）和雌激素信號(hào)通路（Estrogensignaling pathway）等7 大類通路，見圖5。另外，核心靶點(diǎn)主要富集在ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC transporters）、催乳素信號(hào)通路（Prolactin signaling pathway）和內(nèi)分泌抵抗通路（Endocrineresistance）等41 條KEGG通路及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。

圖5 KEGG 信號(hào)通路圖Fig.5 KEGG signal path diagram

2.5 構(gòu)建“中藥—成分—疾病靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 “鹿茸活性成分疾病靶點(diǎn)通路”治療OP 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 OP network diagram of"velvet antleractive ingredientdisease targetpathway treatment"

2.6 鹿茸成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

圖7 分子對(duì)接3D 圖Fig.7 3D diagram of molecular docking

表3 分子對(duì)接受體蛋白信息Table 3 Information related to molecular docking receptor protein

表4 關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果Table 4 Docking results of components and target molecules

2.7 細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證

2.7.1 鹿茸提取物對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞存活率影響不同濃度的鹿茸提取物對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞存活率的影響，見圖8。地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞的模型組與空白組相比，細(xì)胞存活率極顯著下降（P＜0.01），表明模型造模成功。與模型組相比，給藥組在25～300g/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均不同程度地促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)濃度依賴性，在300g/mL 質(zhì)量濃度下促進(jìn)作用最強(qiáng)，存活率達(dá)80.37%，與模型組有極顯著差異（P＜0.01）。

圖8 鹿茸提取物對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞存活率影響Fig.8 Effect of pilose antler extract on survival rate of MC3T3-E1 cells

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（圖9 A），空白組的細(xì)胞存活率最高，狀態(tài)較好；模型組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞出現(xiàn)了皺縮、不規(guī)則現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)量少；給藥后與模型組相比細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且細(xì)胞狀態(tài)較好，表明鹿茸的提取物對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1 模型有促進(jìn)增殖作用。DAPI染色后，模型組存活細(xì)胞熒光顯色不強(qiáng)，與空白組相比明顯數(shù)量減少，給藥組細(xì)胞數(shù)量逐漸增多（圖9 B）。

圖9 鹿茸提取物對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞的存活率影響（200）Fig.9 Micrograph of the effect of pilose antler extract on survival rate of MC3T3-E1 cells (200)

2.7.2 鹿茸對(duì)核心靶點(diǎn)SRC、IL-6 和TNF 的mRNA表達(dá)水平影響 如圖10 所示，與空白組相比，地塞米松造模組基因表達(dá)明顯升高，基因表達(dá)出現(xiàn)了明顯異常，但在鹿茸提取物給藥影響下，SRC、IL-6 和TNF基因表達(dá)水平下降，幾乎都恢復(fù)了基因正常表達(dá)水平，通過q-PCR 進(jìn)一步驗(yàn)證了鹿茸對(duì)SRC、IL-6 和TNF 核心靶點(diǎn)的調(diào)控作用，與模型組相比均具有抑制作用，利于骨形成。

圖10 鹿茸提取物對(duì)核心靶點(diǎn)的mRNA 表達(dá)水平的影響（，n=3）Fig.10 Effect of pilose antler extract on mRNA expression of core targets (,n=3)

3 討論

隨著OP 患病人群的增多，特別是老年人和絕經(jīng)婦女[24]，治療OP 的藥物需求量很大。天然產(chǎn)物治療OP不僅療效高[25]，且比西藥副作用少，深受患者青睞。鹿茸是名貴的中藥，《中藥大辭典》中曾記載鹿茸“壯元陽、補(bǔ)氣血、益精髓、強(qiáng)筋骨”，可見，鹿茸是補(bǔ)腎健骨之良藥。

由于檢索數(shù)據(jù)庫中鹿茸成分較少，因此，本研究結(jié)合文獻(xiàn)檢索的方法，共查找到鹿茸中58 種成分，核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)成分36 個(gè)，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析發(fā)現(xiàn)，其主要發(fā)揮治療OP 的成分為17--雌二醇、前列腺素E1、維生素a 醇、雌酮、膽固醇、睪酮和孕酮等。雌二醇可通過Wnt/-catenin 信號(hào)通路作用于骨成型蛋白-2，增加去卵巢OP 大鼠骨密度，改善骨組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而發(fā)揮抗OP 作用[26]；前列腺素E1 可促進(jìn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞抑制因子的表達(dá)，增加OPG mRNA 水平[27]；雌酮和孕酮等成分更是直接引起OP 的主要因素，特別是絕經(jīng)后婦女的雌激素降低容易導(dǎo)致骨量大量丟失[28]，雌激素通過激活Wnt/-catenin 信號(hào)通路途徑進(jìn)而影響B(tài)MP2 表達(dá)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖和分化，抑制凋亡，并調(diào)節(jié)和促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，提高骨密度，促進(jìn)新骨形成[29]；孕酮可誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞和人成骨樣細(xì)胞TGF-1 和TGF-2 mRNA 表達(dá)及蛋白質(zhì)分泌；雄激素也是促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收來維持骨量和調(diào)節(jié)骨代謝的重要因素[30]。

另外，SRC、IL-6、TNF、PTGS2 和CA2 的Degree值較高，表明它們是核心關(guān)鍵靶點(diǎn)，在鹿茸治療OP過程中參與較多。SRC 是由許多細(xì)胞外信號(hào)分子激活的非受體蛋白酪氨酸激酶，參與細(xì)胞代謝過程，SRC 可通過調(diào)控ER活性促進(jìn)人成骨細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)骨形成過程，目前，已將SRC蛋白抑制劑作為治療OP的一個(gè)重要研究方向[31]。IL-6 和TNF 均參與了病理性骨丟失的發(fā)生發(fā)展過程。湯雁利等[32]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-1和TNF-水平與大鼠椎體骨密度、椎間盤骨密度以及小關(guān)節(jié)骨密度均呈明顯負(fù)相關(guān)，IL-6 能激活I(lǐng)L-1、PGE2 等信號(hào)表達(dá)，升高RANKL 抑制OPG表達(dá)，從而促進(jìn)骨吸收[33]；而通過抑制TNF-誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡可促進(jìn)細(xì)胞增殖，保護(hù)成骨細(xì)胞。PTGS2蛋白主要參與炎癥和有絲分裂的發(fā)生，同時(shí)PTGS2 與其他預(yù)測所得出的靶點(diǎn)都有密切聯(lián)系[34]，是前列腺素生成的主要限速酶，前列腺素可以誘導(dǎo)M-CSF 以及RANKL 的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞功能[35]。CA2是破骨細(xì)胞骨吸收的重要標(biāo)志物，其中CA2與破骨細(xì)胞泌酸功能密切相關(guān)[36]，破骨細(xì)胞分泌酸主要是通過CA2 將CO2和H2O 結(jié)合成H2CO3，再分解為H+和HCO3-，為質(zhì)子泵提供H+[37]。分子對(duì)接結(jié)果也證明了鹿茸活性成分均可以與CA2 很好的結(jié)合從而起到較高抑制作用。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，MC3T3-E1 細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證了鹿茸是很好的抗OP 天然藥物，且對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)具有一定調(diào)控作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方法探討了鹿茸抗OP 疾病的主要成分與作用靶點(diǎn)，并應(yīng)用分子對(duì)接和細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證了鹿茸具有很好的抗OP 活性。本研究表明鹿茸是多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用發(fā)揮抗OP 療效，且闡明了其生物學(xué)過程與主要通路，本課題組將進(jìn)一步開展體內(nèi)和體外生物學(xué)試驗(yàn)，為鹿茸抗OP 作用提供科學(xué)依據(jù)。此外，隨著人們對(duì)傳統(tǒng)名貴藥材研發(fā)的特色保健食品需求的增多，可應(yīng)用酶工程等技術(shù)進(jìn)行鹿茸肽富集，為其在保健食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供新思路。