王曉旭，林哲旭，鮑坤，徐超，王凱英，劉志杰※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.吉林省東豐縣梅花鹿科技服務(wù)中心，吉林 東豐 136300）

緩慢葡萄球菌（Straphylococcus lentus）屬于凝固酶陰性葡萄球菌，曾被認(rèn)為不具有致病性，但越來越多的資料表明該菌可引起人類和多種動(dòng)物發(fā)病，尤其是新生兒、免疫力低下的人群和動(dòng)物更容易致病，是一種不可忽視的人獸共患致病菌[1,2]。該菌感染人可以引起人的慢性鼻竇炎[3]，此外還可感染豬、鵝和羊等多種動(dòng)物。劉富來等[4]報(bào)道，佛山市某養(yǎng)豬場(chǎng)因緩慢葡萄球菌感染，引起全場(chǎng)豬發(fā)病，死亡率達(dá)23%，主要癥狀為體溫升高和呼吸道癥狀。朱思明等[5]報(bào)道，緩慢葡萄球菌可以引起雛鵝發(fā)病死亡，發(fā)病率為100%，死亡率為89%，死亡后雛鵝以肝臟顯著腫大并出血、肺臟廣泛出血壞死等多種內(nèi)臟器官廣泛出血現(xiàn)象。該菌還可以引起山羊、倉鼠、鴨子及眼鏡蛇等感染，多以肝臟腫大、肺臟水腫和脾臟壞死為主要特征[6,7]。

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是革蘭氏陰性菌，具有鞭毛和菌毛，廣泛存在于水、土壤以及動(dòng)物和人類腸道菌群中。奇異桿菌是一種條件致病菌，通常對(duì)人無致病力[8]。然而，當(dāng)機(jī)體免疫力減弱時(shí)，可引起嚴(yán)重疾病，如膀胱炎、敗血癥、腹膜炎和腦膜炎等[9,10]。奇異桿菌是引起人類尿道感染的第三大常見原因，僅次于肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌。據(jù)報(bào)道，奇異變形桿菌在不與任何其他病原體混合感染的情況下，可引起魚類的大規(guī)模死亡[11]。此外，奇異變形桿菌感染也可引起禽類的繁殖障礙[12]、牛和家禽的腹瀉[13]以及狗的慢性外耳炎[14]。

近年來，緩慢葡萄球菌感染水貂的報(bào)道較少，朱麗霞等[15]報(bào)道緩慢葡萄球菌感染水貂后出現(xiàn)肺炎和腎臟腫大等病變，Schwarz 等[16]在泌尿系統(tǒng)和周圍環(huán)境中分離出具有多種耐藥性的緩慢葡萄球菌。而水貂發(fā)生奇異變形桿菌感染的報(bào)道卻日益增多，其發(fā)病率和死亡率均較高，剖檢可見肺臟炎癥、腎臟、脾臟及肝臟顯著腫大[17-20]。目前，尚未見緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌混合感染引起水貂發(fā)病的報(bào)道。緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌作為人獸共患細(xì)菌病病原，不僅在養(yǎng)殖業(yè)上造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還有感染人類的風(fēng)險(xiǎn)，因此，應(yīng)引起重視。2021 年遼寧省大連市某養(yǎng)殖場(chǎng)送檢病死水貂，發(fā)病率在30%左右，死亡率在10%左右，共同特點(diǎn)均為先發(fā)生趾間潰爛，之后引起死亡。本研究通過對(duì)病原菌的分離，確定病原菌為緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌混合感染，篩選敏感藥物，為我國水貂細(xì)菌性疾病早期的科學(xué)診斷和治療工作提供了一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 無菌采取死亡水貂趾間潰爛分泌物和內(nèi)臟器官，帶回實(shí)驗(yàn)室，置4 ℃冰箱中保存，備用。小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。小鼠為封閉群小鼠（SPF），品種為KM鼠，日齡為5 周齡，體重為（18±2）g。

1.1.2 主要試劑 Ex Taq DNA 聚合酶、pMD18-T 載體、E.coli DH5感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程（大連）有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自AXYGEN 公司；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司；PCR 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；革蘭氏染色液購于天根生化科技（北京）有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧培養(yǎng)罐購于三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀和病理變化 通過臨床癥狀和病理剖檢，了解水貂的臨床癥狀和病理變化。

1.2.2 病原菌分離和16S rRNA 分子鑒定 無菌挑取趾間潰爛分泌物和水貂肺臟、肝臟、脾臟及腎臟樣品，在胰蛋白胨大豆肉湯固體培養(yǎng)基上劃線，置于37 ℃培養(yǎng)24～72 h，挑取可疑菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基。根據(jù)GenBank 已發(fā)表的細(xì)菌16S rRNA 基因設(shè)計(jì)通用引物，上游T1：5'-AGAGTTTGATC(A/C)-3'，下游T2：5'-GGACTAC(A/T/C)AGGGTATCTAAT-3。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4 生化鑒定 按照王建科等報(bào)道的方法進(jìn)行操作[17]。

1.2.5 分離菌的致病性試驗(yàn) 將純化的菌株接種液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，BalB/C 小鼠腹腔注射分離菌株，每株菌株接種6只小鼠，菌液濃度均調(diào)整為1×109cfu/mL[15]，每只小鼠注射300L 菌液，對(duì)照組小鼠注射生理鹽水，連續(xù)觀察3 d 記錄小鼠死亡情況。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)根據(jù)美國臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦的方法進(jìn)行。

1.2.7 分離菌株16S rRNA 基因同源性分析及發(fā)育樹的構(gòu)建 測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，選出20 個(gè)與分離菌株測(cè)序結(jié)果相近的序列（參考菌株信息見表1），用DNAStar 軟件對(duì)序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，用Mega 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌參考菌株信息Table 1 Reference strain information of and

表1 緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌參考菌株信息Table 1 Reference strain information of and

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和病理變化

發(fā)病初期水貂表現(xiàn)出趾間紅腫，少量出血，采食、體溫均正常，隨時(shí)間推移趾間出現(xiàn)破潰、出血、糜爛的癥狀，有時(shí)會(huì)引起整只爪腫脹，如不及時(shí)治療病貂會(huì)出現(xiàn)精神沉郁，食欲減退或廢絕，體溫升高，多數(shù)于幾日內(nèi)死亡。

發(fā)病集中主要表現(xiàn)在肺臟和腎臟。肺出血、腫脹，氣管、支氣管內(nèi)呈現(xiàn)有粉紅色的泡沫狀液體；腎臟腫大、充血和出血，見圖1。

圖1 水貂臨床癥狀和病理變化Fig.1 Clinical symptoms and pathological changes of mink

2.2 細(xì)菌分離及形態(tài)特征

一種菌落大小均勻，呈白色或微黃色，不透明，形狀為隆起的圓形，光滑濕潤，邊緣整齊。革蘭氏染色鏡檢可見陽性、呈單個(gè)、成對(duì)和多個(gè)聚集的球菌。另一種游散生長，出現(xiàn)明顯的遷徙現(xiàn)象，細(xì)菌可以蔓延成擴(kuò)散的波紋狀薄膜，革蘭氏染色鏡檢可見陰性、中等大小桿菌，多單在，少數(shù)成對(duì)或短鏈排列，見圖2。

2.3 生化鑒定

分離得到的革蘭氏陽性菌分解七葉苷、山梨醇、水楊苷、甘露醇、蔗糖；不分解乳糖、核糖、阿拉伯糖、木糖和10%NaCl胰胨水；具有氨基酸脫羧酶活性；無賴氨酸尿素酶和脫羧酶活性，不分解西蒙氏枸鹽酸鹽、動(dòng)力硝酸鹽和丙二酸鹽。分離得到的革蘭氏陰性菌發(fā)酵蕈糖和葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、山梨醇和甘露醇，尿素酶、觸酶和MR 試驗(yàn)陽性。V-P、吲哚、七葉苷和氧化酶試驗(yàn)陰性，三糖鐵斜面陰性，底層陽性，產(chǎn)生H2S。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8 版），確定分離菌符合緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌的生化鑒定特性。

2.4 16S rRNA基因擴(kuò)增

由圖3 可知，以提取細(xì)菌基因組為模板，采用T1、T2 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖電泳可見約780 bp 處有一條特異的條帶，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小完全相符，且無雜帶。

圖3 分離菌株16S rRNA 基因PCR 鑒定結(jié)果Fig.3 16S rRNA gene amplification results of the isolated strain

2.5 細(xì)菌毒理試驗(yàn)

攻毒小鼠在48 h 內(nèi)死亡，對(duì)照組小鼠無變化。死亡小鼠剖檢可見肺臟有出血點(diǎn)，腎臟和肝臟均腫大、出血。將小鼠內(nèi)臟無菌涂板進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，鑒定結(jié)果為分離菌株和攻毒菌株培養(yǎng)特性和染色特性一致，16S rRNA 基因鑒定確定分離菌株和攻毒菌株為同一株菌株。

2.6 藥敏試驗(yàn)

分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，緩慢葡萄球菌對(duì)氨基糖苷類抗生素中丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素和新霉素敏感；四環(huán)素類抗生素只對(duì)米諾環(huán)素敏感；喹諾酮類抗生素只對(duì)氧氟沙星敏感；-內(nèi)酯胺類抗生素中對(duì)羧芐西林和哌拉西林敏感。奇異變形桿菌對(duì)-內(nèi)酯胺類抗生素中對(duì)羧芐西林、哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢他啶和頭孢曲松敏感；對(duì)氨基糖苷類抗生素中丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素和新霉素敏感；喹諾酮類抗生素只對(duì)氧氟沙星敏感，見表2。

表2 藥敏試驗(yàn)Table 2 Drug sensitivity test bacteriostatic zone test

2.7 分離株16S rRNA基因同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，緩慢葡萄球菌分離菌株與GenBank 中其他20 個(gè)緩慢葡萄球菌同源性在98%以上，與菌株1b 的同源性最高，為99.85%，但是菌株的來源不詳，而與高鹽環(huán)境中116SS2 菌株的同源性最低，為98.94%；奇異變形桿菌分離菌株與GenBank 中其他20 個(gè)奇異變形桿菌同源性在99%以上，與菌株R7、F22、F3、R1、G1 的同源性最高，為99.93%，而與菌株R10 的同源性最低，為99.51%，見圖4 至圖7。

圖4 緩慢葡萄球菌與參考菌株16S rRNA 序列的進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree based on 16SrRNA sequences of and other reference strains

圖6 緩慢葡萄球菌與參考菌株16S rRNA 序列同源性分析Fig.6 Homology analysis based on 16SrRNA sequences of and other reference strains

3 討論

近年來，關(guān)于緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌感染人和動(dòng)物的報(bào)道逐漸增多，兩種致病菌對(duì)人和動(dòng)物健康構(gòu)成新的威脅[21,22]。本實(shí)驗(yàn)室從送檢死亡水貂的趾間糜爛病灶、肺臟、脾臟和腎臟中分離得到2 株病原菌，采用細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明分離得到的緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌為致病菌，小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果表明二者均有較強(qiáng)致病性。在趾間和各臟器中分離到相同的病原菌，進(jìn)而推斷，緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌首先引起水貂爪子病變，沒有進(jìn)行及時(shí)治療，致使其進(jìn)入血液，引起菌血癥，最終導(dǎo)致動(dòng)物死亡。

應(yīng)用細(xì)菌高度保守的16S rRNA基因序列分析對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定已經(jīng)是國際上通用的鑒定技術(shù)[23]，因此本研究采用通用引物對(duì)分離菌株的16S rRNA部分基因進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序，經(jīng)過同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，從分子水平上確定分離的2 株菌為緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌。同源性比對(duì)結(jié)果顯示，緩慢葡萄球菌與b1 株的同源性最高，為99.85%，而與RCB409、RCB408 及RCB406 等株同源性最低，為98.95%，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，分離株與b1 在同一分支，但b1菌株來源不詳，分支最遠(yuǎn)的是RCB409 和RCB408 等菌株，均來自蝙蝠糞便。奇異變形桿菌與R1、G1 和F3等菌株同源性最高，為99.93%，這些菌株均來源于毛皮動(dòng)物，有趣的是與分支最遠(yuǎn)的R10 菌株也來自毛皮動(dòng)物，所以推測(cè)奇異變形桿菌的親緣關(guān)系與種屬特異性有關(guān)系，造成這一結(jié)果可能與該菌有多種血清型有關(guān)。

緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌作為人獸共患病原菌，可對(duì)人類和動(dòng)物的健康造成極大的威脅。本試驗(yàn)對(duì)分離的2 株病原菌用30 種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示緩慢葡萄球菌對(duì)其中的8 種抗生素敏感，氨基糖苷類比例最高，主要是丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素和新霉素，表明分離病原菌對(duì)多種抗生素均有較高的抗性，與朱麗霞等[15]報(bào)道的水貂感染緩慢葡萄球菌的藥敏結(jié)果一致。但與朱富來等[4]報(bào)道的豬源緩慢葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果不一致，與朱思明[5]報(bào)道的鵝源的藥敏試驗(yàn)結(jié)果也不一致。奇異變形桿菌對(duì)14 種抗生素敏感，主要集中在-內(nèi)酯胺類和氨基糖苷類抗生素，與王建科等[17]報(bào)道的貂源奇異變形桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，與石同瑞[18]和王麗萍[19]報(bào)道的藥敏試驗(yàn)結(jié)果差異較大，綜合參考近年來人和動(dòng)物緩慢葡萄球菌、奇異變形桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)[15,19]，2 種病原菌對(duì)絕大多數(shù)抗生素均有耐藥性，且宿主不同，其耐藥性也不同。近年來，抗生素的過度使用，造成了菌株耐藥性的增加和多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給水貂養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，養(yǎng)殖過程中若發(fā)生細(xì)菌性疾病，首先要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感藥物，必要時(shí)可聯(lián)合用藥，以增強(qiáng)殺菌效果，減少水貂的發(fā)病和死亡。

4 結(jié)論

本研究在死亡水貂趾間潰爛病灶和內(nèi)臟組織中均分離到相同病原菌，經(jīng)16S rRNA 基因序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，感染的病原菌為緩慢葡萄球菌和奇異變形桿菌，二者均有較強(qiáng)致病性和多重耐藥性。