郝秀華，張莉，趙麗穎，杜小蓉，楊錦竹

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021）

糖尿病（Diabetes mellitas,DM）是一種由多種影響因素共同作用的慢性代謝性疾病，具有慢性高血糖、多器質(zhì)性及系統(tǒng)靶向性損害的特征[1]，臨床上通過胰島素（Insulin,INS）的絕對或相對缺乏將其分為兩類[2]：胰島素依賴性的一型糖尿?。═1DM）和非胰島素依賴性的二型糖尿病（T2DM）。糖尿病患者所具有的慢性高血糖和代謝功能異常，一定程度上會引起多器質(zhì)性功能障礙甚至衰竭及系統(tǒng)靶向性損害，并伴有多種并發(fā)癥[3]。目前，糖尿病的具體分子作用機(jī)制尚不明確[4]。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)及多途徑的作用特點(diǎn)，可從多個方面干預(yù)疾病的進(jìn)程。生脈散是《醫(yī)學(xué)啟源》中的一劑藥方，由人參、麥冬和五味子組成[5]。方劑中人參甘溫補(bǔ)氣生津?yàn)榫畸湺识⒑?，養(yǎng)陰生津?yàn)槌?；五味子味酸而咸，擅長固津攝氣為佐。三藥合用，一補(bǔ)一潤一斂，益氣養(yǎng)陰生津，是治療氣陰兩虛的經(jīng)典名方。研究表明，生脈散對胰島素抵抗有改善作用[6]，對炎癥介質(zhì)也有一定影響[7]，這為生脈散防治糖尿病提供了一定的科學(xué)依據(jù)。同時，生脈散加減方在治療糖尿病[8]、糖尿病合并心絞痛[9,10]中應(yīng)用廣泛，生脈散治療糖尿病，大多是從單一角度解釋其作用機(jī)制，缺乏系統(tǒng)性研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種將藥物作用網(wǎng)絡(luò)和生物網(wǎng)絡(luò)整合到一起的研究方法，系統(tǒng)性地反映藥物對疾病的作用機(jī)制[11,12]。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接，探究生脈散治療糖尿病的作用機(jī)制，為臨床治療糖尿病提供理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與統(tǒng)計學(xué)處理軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP數(shù)據(jù)庫[13（]https://tcmsp-e.com/），BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫[14]（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫[15（]http://swisstargetprediction.ch/），Uniprot數(shù)據(jù)庫[16（]https://www.uniprot.org/），OMIM 數(shù)據(jù)庫[17（]https://www.omim.org/），GeneCards數(shù)據(jù)庫[18]（https://www.genecards.org/），Drugbank 數(shù)據(jù)庫[19（]https://go.drugbank.com/），STRING 數(shù)據(jù)庫[20]（https://stringdb.org/），Venny2.1 在線作圖平臺[21]（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/），Cytoscape3.7.2 軟件[22]，Graphpad Prism軟件，DAVID數(shù)據(jù)庫[23（]https://david.ncifcrf.gov/），AutoDock Tools1.5.6，AutoDock vina1.1.2，PyMOL。

1.2 生脈散活性成分與潛在靶點(diǎn)篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中輸入生脈散中的3 味中藥名：麥冬、人參、五味子，搜索3 味中藥有效成分，通過藥物代謝動力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)篩選條件：口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 進(jìn)行活性成分的篩選[24,25]，并獲取相對應(yīng)的靶點(diǎn)，使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范統(tǒng)一。由于在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中沒有“麥冬”的相關(guān)成分，故通過中醫(yī)分子機(jī)理生物學(xué)信息分析工具BATMAN-TCM進(jìn)行檢索，篩選條件是Score cutoff ≥20、P-value cutoff ＜0.05[26-28]。通過上述2 個數(shù)據(jù)庫檢索及結(jié)合《中國藥典》記載，得到生脈散3 味中藥的化合物和靶點(diǎn)，建立生脈散成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 糖尿病疾病靶點(diǎn)的確定

以“Diabetes”為關(guān)鍵詞在OMIM、GeneCardsDrugbank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將結(jié)果合并后刪除其中的重復(fù)疾病靶點(diǎn)，最終得到糖尿病疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 繪制韋恩圖

運(yùn)用Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺對獲得的生脈散藥物靶點(diǎn)和糖尿病疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分析處理，最終得到藥物與疾病之間的共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.5 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.2 軟件對所獲得的生脈散有效成分、交集靶點(diǎn)進(jìn)行計算分析，構(gòu)建生脈散有效成分-糖尿病靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?！肮?jié)點(diǎn)”代表藥物活性成分和作用靶點(diǎn)，“邊”代表節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

1.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將生脈散與糖尿病的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，限定研究物種為“Homo sapiens”，以置信度分?jǐn)?shù)Score>0.4 為條件進(jìn)行篩選，將網(wǎng)絡(luò)中無關(guān)或游離蛋白去掉，其余參數(shù)按照默認(rèn)設(shè)定值，將得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，最終得到生脈散治療糖尿病的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 基因本體（GO）功能和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將獲得的PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入功能注釋（Functional annotation）工具DAVID 數(shù)據(jù)庫，限定研究物種為人類（Homo sapiens），選擇基因本體（GO）分析下的分子功能（MF）、生物過程（BP）和細(xì)胞組分（CC）部分進(jìn)行GO 功能富集分析，選擇Pathway 分析中京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，設(shè)定P ＜0.05，進(jìn)一步尋找有效成分靶點(diǎn)顯著富集的主要功能與體內(nèi)通路，利用Graphpad Prism 軟件將Count 值排名前十名的BP、CC、MF 進(jìn)行可視化。在微生信平臺對KEGG 通路（P ＜0.05）的結(jié)果進(jìn)行可視化[29]。

1.8 分子對接

在蛋白質(zhì)PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB（https://www.rcsb.org/）找到7 個核心靶點(diǎn)蛋白，保存為PDB 格式文件，在AutoDock v4.2 軟件中對晶體蛋白進(jìn)行去除結(jié)晶水、加氫和去除側(cè)鏈殘基處理。有配體的蛋白晶體根據(jù)配體活性位點(diǎn)生成活性口袋，無配體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)采用自動模式生成活性口袋。將4 個核心潛在化合物和7 個核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果通過PyMOL 進(jìn)行分子間作用力可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 生脈散活性成分篩選結(jié)果

通過中藥數(shù)據(jù)庫篩選和結(jié)合《中國藥典》記載，共得到生脈散48 個成分，591 個潛在靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后共獲得352 個藥物相關(guān)靶點(diǎn)。

2.2 核心靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

檢索GeneCards、OMIM、Drugbank 疾病數(shù)據(jù)庫，得到糖尿病靶點(diǎn)個數(shù)分別為1 111 個、225 個、30 個，篩選并去除重復(fù)值后得到靶點(diǎn)1 269 個。得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)91 個，繪制venn 圖，見圖1。

圖1 藥疾病靶點(diǎn)venn 圖Fig.1 Distribution of drug targets and disease targets

表1 生脈散中藥—成分—靶標(biāo)基本信息統(tǒng)計表Table 1 Basic information statistics of Shengmai powder traditional Chinese medicine-ingredients-targets

2.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將生脈散活性成分和作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建生脈散治療糖尿病的“成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖2 生脈散治療糖尿病的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Ingredient-target network of Shengmai powder in the treatment of diabetes

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)

借助STRING 在線數(shù)據(jù)庫，按照網(wǎng)站默認(rèn)設(shè)置參數(shù)值，對生脈散與糖尿病的97 個交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。其中，節(jié)點(diǎn)的大小、顏色及其深淺變化代表Degree值的大小。利用Network analyzer 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，得到潛在靶點(diǎn)基因拓?fù)鋮?shù)自由度（Degree）、介度中心度（Betweenness）和接近中心度（Closeness），以這3 個參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)，通過Degree 值排序，選取分值大于中位數(shù)的基因作為核心靶點(diǎn)，篩選過程見圖4；將結(jié)果繪制條形圖，可見核心靶點(diǎn)有AKT1、TNF、CASP3 和PTGS2等，見圖5。

圖3 生脈散-糖尿病PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Shengmai powder-diabetes PPI network

圖4 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的篩選策略圖Fig.4 Screening strategy diagram of key nodes

2.5 GO功能富集分析

在DAVID 數(shù)據(jù)庫中對生脈散和糖尿病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析，共得到293 個BP 條目，29 個CC條目，55 個MF條目（P＜0.05）。利用Graphpad Prism 軟件將Count 值排名前十名的BP、CC 和MF進(jìn)行可視化（圖6）。涉及細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外、質(zhì)膜外區(qū)及細(xì)胞凋亡過程等多方面主要有：RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、對雌二醇的負(fù)調(diào)節(jié)、對缺氧的反應(yīng)、藥物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂多糖的反應(yīng)；同二聚化活性酶、血紅素、氧化還原酶活性受體及活性鐵離子的結(jié)合等方面，推測生脈散可能通過調(diào)節(jié)這些生物過程來起到治療糖尿病的作用。

圖6 GO 功能富集分析條形圖（BP、CC、MF 各取前10）Fig.6 Bar graph of GO function enrichment analysis (BP,CC,MF each take the top 10)

2.6 KEGG富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對97 個靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析得到105 條通路，主要包括TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、胰島素抵抗通路、細(xì)胞凋亡通路、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂解通路、5-羥色胺能突觸、Toll 樣受體信號通路和脂肪細(xì)胞因子信號通路等。根據(jù)P-value 值大小，對排列前20 位的通路結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖7和表3。

圖7 KEGG 富集分析氣泡圖（前20）Fig.7 KEGG enrichment analysis bubble chart (Top 20)

表3 KEGG 富集分析數(shù)據(jù)表（前20）Table 3 KEGG enrichment analysis data table (Top 20)

2.7 分子對接

將4 個潛在核心化合物與7 個核心靶點(diǎn)AKT1（PDB ID:6CCY）、CASP3（PDB ID:5IAB）、JUN（PDB ID:5T01）、LEP（PDB ID: 1AX8）、MAPK8（PDB ID:3ELJ）、TNF（PDB ID:5UUI）和PTGS2（PDB ID:）進(jìn)行分子對接，最終得到28 組受體-配體對接結(jié)果。28 組對接結(jié)果Affinity 均小于 20.92 kJ/mol，Affinity<-29.288 kJ/mol的有17 組，占60%。其中，對接得分最高的是Stigmasterol-CASP3，分值為-44.768 8 kJ/mol，對接得分最低的是Uridine-TNF，分值為-23.8488kJ/mol，這表明篩選的核心化合物和核心靶點(diǎn)之間有較好的結(jié)合活性。網(wǎng)外對接排名前3 的是：Stigmasterol-CASP3（-44.7688kJ/mol），Stigmasterol-PTGS2（-41.0032kJ/mol），Kaempferol-PTGS2（-38.911 2 kJ/mol）。

將對接結(jié)果在PyMOL 軟件中可視化，發(fā)現(xiàn)化合物Orchinol與靶點(diǎn)AKT1 的1 個氨基酸殘基ALA-230形成1 個氫鍵，化合物Kaempferol 與AKT1 的3 個氨基酸殘基（ARG-241，ARG-249，TYR-437）形成4 個氫鍵，化合物Uridine 與AKT1 的3 個氨基酸殘基（TYR-175，TYR-229，ASP-285）形成7 個氫鍵，化合物Orchinol 與CASP3 的4 個氨基酸殘基（ASN-35，GLN-225，TYR-226，ARG-241）形成4 個氫鍵，化合物Uridine與CASP3的3個氨基酸殘基（TYR-37，MET-39，TYR-276）形成3 個氫鍵，化合物Uridine 與JUN 的3 個氨基酸殘基（DC-12，DG-30，DG-32）形成5 個氫鍵，化合物Kaempferol 與TNF 的3 個氨基酸殘基（TYR-119，GLY-148，TYR-151）形成3 個氫鍵，見圖8和圖9。

圖8 分子對接結(jié)果Fig.8 Molecule docking results

3 討論

目前西醫(yī)臨床上治療糖尿病的藥物主要分為以下幾類：注射用胰島素以及胰島素類似物（Insulin analogue）[30]-糖苷酶抑制劑[31]（Alpha-glucosidase inhibitor）、磺酰脲類（Sulfonylureas）、雙胍類（Biguanides）、PPAR激動劑[32]、GLP-1 類似物（GLP-1 analogue）和DPP-4 抑制[33]（DPP-4 inhibitors）和SGLT-2（Sodiumdependent glucose transporters 2）抑制劑等，但治療過程中常伴隨不良反應(yīng)的發(fā)生，效果不甚理想。中藥基于整體性治療方法在糖尿病及其多種并發(fā)癥的治療中具有一定的優(yōu)勢。

生脈散作為中藥復(fù)方中的經(jīng)典方劑，用于糖尿病的治療有顯著成效，方劑中人參，麥冬等單味藥經(jīng)研究均有治療糖尿病的作用[34,35]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，建立生脈散有效成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并通過生物富集分析得到生脈散治療糖尿病相關(guān)生物過程、分子功能、細(xì)胞組成和信號通路等信息，探討生脈散治療糖尿病及其并發(fā)癥可能的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，生脈散中豆甾醇、-谷甾醇、尿苷和山柰酚等與糖尿病及其并發(fā)癥的治療相關(guān)性最強(qiáng)，并且生脈散中的活性成分能通過調(diào)節(jié)AKT1、TNF、CASP3 和PTGS2等多個靶點(diǎn)，及介入TNF 信號通路、HIF-1 信號通路和細(xì)胞凋亡信號通路等多種途徑來干預(yù)糖尿病的發(fā)展進(jìn)程，從而發(fā)揮對糖尿病及其并發(fā)癥的治療作用。

Ramur 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，豆甾醇和-谷甾醇具有再生細(xì)胞的功能，并刺激細(xì)胞分泌胰島素，從而發(fā)揮在糖尿病大鼠模型中的抗高血糖作用。同時Wang 等[37]研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，豆甾醇對2 型糖尿病小鼠有治療作用，其機(jī)制可能是增加葡萄糖轉(zhuǎn)移酶4（GLUT4）的轉(zhuǎn)位和表達(dá)。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，嘌呤能系統(tǒng)及其對血流調(diào)節(jié)的影響越來越受到關(guān)注，嘌呤能受體功能減弱與糖尿病等多種疾病有關(guān)。Thaning等[38]研究確定了2 型糖尿病患者的內(nèi)皮功能障礙與血管對細(xì)胞外核苷酸和核苷的敏感性受損有關(guān)。Spasov等[30]研究證明尿嘧啶及其衍生物是抑制糖尿病及其并發(fā)癥的物質(zhì)基礎(chǔ)。Cortes 等[31]通過小鼠動物試驗(yàn)驗(yàn)證，尿嘧啶可以通過抑制二肽基肽酶-IV（DPP-4）從而發(fā)揮治療糖尿病的作用。以上物質(zhì)均對糖尿病有一定的改善作用。Akt 亞型受胰島素刺激的差異調(diào)節(jié)，Akt1 將胰島素信號傳遞到線粒體并調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合體V 活性。在胰島素抵抗的2 型糖尿病模型中，Akt1 易位被鈍化[33]，只有Akt1 轉(zhuǎn)移到線粒體中，該信號通路的失調(diào)可能會加速糖尿病腎病的發(fā)展。Schreyer 等[39]基于對肥胖型嚙齒動物、糖尿病患者及細(xì)胞培養(yǎng)模型的研究表明，TNF-在介導(dǎo)與肥胖相關(guān)的胰島素抵抗中發(fā)揮作用。TNF-與妊娠期糖尿病病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可能通過損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞[40]，誘發(fā)妊娠型糖尿病，促進(jìn)病情發(fā)展。CASP3 激活后，通過破壞紅細(xì)胞形狀和功能，縮短2 型糖尿病患者紅細(xì)胞的壽命，引起血液流變學(xué)障礙[41]。You 等[42]研究結(jié)果表明miR-378 過表達(dá)通過靶向激活CASP3 和PI3K/Akt 信號通路減弱高葡萄糖抑制成骨分化，從而對糖尿病誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥有治療作用。PTGS2，也稱為環(huán)加氧酶2，在T2DM的發(fā)展中起到促進(jìn)作用[43]。PTGS2產(chǎn)生前列腺素，它對葡萄糖刺激的胰島素分泌產(chǎn)生負(fù)面調(diào)節(jié)，并作為炎癥反應(yīng)的介質(zhì)，這與胰島素敏感性降低有關(guān)?？傊?，生脈散調(diào)節(jié)糖尿病涉及細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外、質(zhì)膜外區(qū)和細(xì)胞凋亡過程等多方面，RNA聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、對雌二醇的負(fù)調(diào)節(jié)、對缺氧的反應(yīng)、藥物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂多糖的反應(yīng)；同二聚化活性酶、血紅素、氧化還原酶活性受體和活性鐵離子的結(jié)合等方面，推測生脈散可能通過調(diào)節(jié)這些生物過程來起到治療糖尿病的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，生脈散調(diào)節(jié)糖尿病的主要通路包括TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、胰島素抵抗、細(xì)胞凋亡通路、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂解通路、5-羥色胺能突觸、Toll 樣受體信號通路和脂肪細(xì)胞因子信號通路等。腫瘤壞死因子（TNF）是脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的TNF 增加可能導(dǎo)致肥胖和非胰島素依賴型糖尿?。∟IDDM）的胰島素抵抗[44]。TNF已被證明可抑制胰島素受體（IR）和胰島素受體底物（IRS-I）的胰島素模擬酪氨酸磷酸化，并刺激脂肪細(xì)胞中胰島素敏感性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4 的下調(diào)。缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）可激活下游多種靶基因在糖尿病并發(fā)癥中促進(jìn)疾病進(jìn)展[45]。HIF-1是HIF1的活性亞基，當(dāng)糖尿病腎病病情發(fā)展時，血糖高抑制HIF-1的生成，HIF-1保護(hù)腎臟的作用削弱，而ET-1等基因的表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)腎臟纖維化，HIF-1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用顯現(xiàn)，腎臟嚴(yán)重受損，疾病加劇進(jìn)展。在Toll樣受體激動劑存在條件下，新發(fā)糖尿病患者的血清IFN-2、IL-1、IFN-和CXCL-10水平升高[46]，證明先天免疫系統(tǒng)在引發(fā)胰島破壞的早期機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，探討生脈散治療糖尿病的作用機(jī)制，從整體上分析生脈散和糖尿病之間的關(guān)系，一定程度上揭示了生脈散及其主要成分的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，糖尿病的發(fā)生、發(fā)展涉及多種生物過程和信號通路，中醫(yī)藥“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”的藥物作用機(jī)制恰好與這一特點(diǎn)相契合，這為生脈散治療糖尿病相關(guān)的分子生物學(xué)研究及更深入的藥理學(xué)研究提供了理論參考。