王文祥，唐曉翠,2，李寧，楊策，陳蕓彤，陳春宇※

（1.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學校藥學院，重慶 404120；2.重慶文理學院，重慶 402160）

膽汁淤積型肝炎（Cholestatic Hepatitis,CH）又稱膽汁淤積性肝病，是由藥源性損傷、免疫性疾病和酒精中毒等病因?qū)е碌拿毮懝芑蚋渭毎δ墚惓?、膽汁生成、分泌和排泄障礙而導致的肝臟疾病，甚至引發(fā)肝硬化、肝衰竭等疾病，臨床將1.5 倍血清堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）數(shù)值作為臨界判斷的指標[1,2]。CH 病因復雜，歐洲肝病學會出版的《膽汁淤積性肝病臨床指南》指出CH 病因涉及肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、妊娠性膽汁淤積、原發(fā)性膽汁性膽管炎等[3]。CH 發(fā)病隱匿且無有效診斷手段，發(fā)病率很難精確統(tǒng)計，可能占總?cè)丝诘?0%～20%[4]。藥物治療及肝移植是治療CH 的主要方法。熊去氧膽酸（Ursodeoxycholic acid,UDCA）作為首選藥物被FDA 批準治療CH，但療效欠佳[5]。奧貝膽酸（Obeticholic acid,OCA）是法呢醇X 受體（Farnesyl X receptor,FXR）激動劑，能調(diào)節(jié)膽汁流速和膽酸鹽重吸收，改善CH 癥狀，作為備選藥物用于對UDCA 無應答的患者，但OCA 會增加瘙癢、腹痛等副作用[6]。因此，尋找新的靶點和臨床有效且副作用小的藥物治療CH 十分重要。

赤芍[Paeoniae Rubra Radix（PRR）]是毛茛科植物川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）或芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，其味苦，性微寒，有清熱涼血等功效[7]。現(xiàn)代藥理學研究表明，赤芍具有保肝、抗炎及抑制自身免疫反應等多種藥理作用，臨床常用來治療膽汁淤積尤其是重度黃疸，有明顯療效[8]。

然而，對于PRR 治療CH 的分子機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于生物信息學、系統(tǒng)生物學及中藥藥理學等多學科理論和技術(shù)，揭示中藥及復方治療疾病的作用機制[9]，因此，本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接探討中藥赤芍治療膽汁淤積性肝炎的分子機制，為赤芍治療膽汁淤積性肝炎等相關(guān)癥狀的臨床研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PRR潛在活性成分及靶點的篩選

從TCMSP[10]數(shù)據(jù)庫獲得PRR 的化學成分，根據(jù)藥物代謝（ADME）原理，將篩選條件設(shè)置為口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%，類藥性（Drug likeness,DL）≥0.18，篩選出PRR 的潛在活性成分。從PubChem 數(shù)據(jù)庫中下載潛在活性成分結(jié)構(gòu)的SDF格式和SMILES 格式文件。通過PharmMapper[11]和Swiss Target Prediction[12]數(shù)據(jù)庫獲得潛在活性成分的靶點。每個化學成分選擇前20 個靶點，刪除重復項，得到潛在活性成分靶點信息。將得到的靶點信息在Uniprot[13]數(shù)據(jù)庫中進行基因名校正。

1.2 CH疾病相關(guān)靶點篩選

通過Drugbank[14]、TTD（Therapeutic Target Database）[15]和Genecards[16]數(shù)據(jù)庫，以“Cholestatic”，“Cholestatic Hepatitis”，“Cholestatic liver disease”為檢索詞，其中在Genecards 數(shù)據(jù)庫取前300 個靶點，去除3 個數(shù)據(jù)庫重復項后，獲得CH 疾病靶點信息。

1.3 蛋白互作（Protein protein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選的PRR 潛在活性成分的靶點和膽汁淤積性肝病相關(guān)靶點，通過在線工作平臺Venny2.1.0 得到PRR 治療CH 的作用靶點，將其導入STRING[17]數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”，置信度設(shè)置為“medium confidence=0.4”，在network display options 中勾選hide disconnected nodes in the network，刪除游離節(jié)點（GPR35 和AMD1），構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscape3.7.2軟件[18]對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行可視化，通過Network Analysis 模塊進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析，根據(jù)degree 值選擇PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通過DAVID[19]數(shù)據(jù)庫進一步研究PRR 治療CH的生物學過程及代謝通路，Identifier 選擇為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，物種選擇為“Homo sapiens”，進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。根據(jù)P 值大小，將GO 功能富集分析的前10 個生物過程（Biological process,BP）、細胞組分（Cellular component,CC）、分子功能（Molecularfunction,MF）利用在線分析平臺微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化分析，將KEGG 通路富集分析的前20 個代謝通路利用Omicshare 在線平臺（https://www.omicshare.com/tools/）進行可視化分析。

1.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將PRR 潛在活性成分、潛在活性成分的靶點和前20 個信號通路導入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，分析主要活性成分和核心靶點。

1.6 動物試驗驗證

1.6.1 試驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量180～220 g[湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019-004]。動物飼養(yǎng)于重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校實驗動物觀察室，室內(nèi)光照12 h/黑暗12 h，濕度40%～60%，溫度18～22 ℃，自由進食、飲水。

1.6.2 試驗藥材 赤芍藥材（批號：20201203）購于哈爾濱普方藥業(yè)飲片有限公司，由重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校張建海教授鑒定為毛茛科植物川赤芍的干燥根。

1.6.3 動物分組、造模與給藥 32 只SPF 級雄性SD大鼠（體重在180～220 g），適應性喂養(yǎng)1 周稱重后隨機分4 組，每組8 只：（1）空白對照組（Control）；（2）模型對照組（ANIT）；（3）陽性藥組（熊去氧膽酸，60 mg/kg）；（4）赤芍提取物組（2.8 g/kg），相當于2倍臨床等效劑量。

第1～6 天，陽性藥組和赤芍提取物組分別預防性灌胃給藥，空白對照組和模型對照組給予0.5% CMCNa溶液灌胃。第7 天上午，陽性藥組和赤芍提取物組分別預防性灌胃給藥；空白對照組和模型組給予0.5%CMC-Na 溶液灌胃。第7 天下午，陽性藥組和赤芍提取物組以及模型對照組灌胃給予ANIT 60 mg/kg 造模[20]，ANIT 單次急性造模要求大鼠給藥前后都禁食12 h，自由飲水，空白對照組給予等體積橄欖油溶液。第8 天，各組按原劑量繼續(xù)給藥。第9 天，用40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，以多聚甲醛心臟灌注后，取肝組織于多聚甲醛中固定備用，樣本采集前12h禁食不禁水。

1.6.4 免疫組化檢測相關(guān)蛋白表達 將固定的肝臟組織進行取材、修塊、脫水、石蠟包埋，對肝臟組織的石蠟塊進行切片，厚約4m，然后對切片進行IHC 染色。經(jīng)過二甲苯脫蠟、乙醇復水、抗原修復、淬滅、血清封閉、抗體孵育及DAB 顯色（鏡下觀察至棕色）、自來水終止染色，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、樹膠封片、SPOT（5.0）高級顯微技術(shù)軟件鏡下觀察。Image-pro Plus 6.0 軟件分析蛋白的相對表達水平，以相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析得出陽性的累積光密度值（IOD）和組織的像素面積（AREA），并求出平均光密度值（Average optical,AO），AO=IOD/AREA，AO 值越大表明陽性表達水平越高。

1.6.5 統(tǒng)計方法 使用GraphPad Prism 8.0 軟件處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差ANOVA 分析。P ＜0.05 視為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRR潛在活性成分及靶點的篩選

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索得到119 個PRR 化學成分，經(jīng)OB 和DL 篩選后獲得28 個潛在活性成分，見表1。

表1 赤芍潛在活性成分Table 1 Underlying active components of PRR

將PRR 活性成分的SMILES 格式文件導入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中預測PRR 中潛在活性成分的靶點信息，將PRR活性成分的SDF格式導入Pharm Mapper 數(shù)據(jù)庫中預測PRR 中潛在活性成分的靶點信息，整合兩個數(shù)據(jù)庫中靶點信息并刪除重復項后得到602 個PRR 潛在活性成分的預測靶點。

2.2 CH疾病相關(guān)靶點篩選

在DrugBank、TTD和Genecards數(shù)據(jù)庫中以“cholestatis”、“Cholestatic hepatitis”、“Cholestatic liver disease”為關(guān)鍵詞進行檢索，去除3 個數(shù)據(jù)庫重復項后，獲得433 個CH 疾病靶點信息。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Venny2.1.0 在線工具篩選出PRR 潛在活性成分的作用靶點和CH 靶基因有34 個交集靶點（圖1），這34 個靶基因可能是PRR 治療CH 的靶點，主要包括白蛋白（Albumin,ALB）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor,TNF）、血管內(nèi)皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor,EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metallope ptidase 9,MMP9）等，見表2。

圖1 赤芍-膽汁淤積共同靶點的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of PRR and CH disease targets

表2 赤芍與疾病交集靶點信息Table 2 Common targets of PRR and CH

將篩選得到的交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，將得到的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件導入Cytoscape 3.7.2軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化（圖2），通過Network Analysis 模塊進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析，根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值選取關(guān)鍵靶點6 個（表3），依次為TNF、ALB、VEGFA、EGFR、MMP9、ERBB2，以上靶點在PPI 網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置，是PRR 治療CH 的關(guān)鍵靶點。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network

圖3 GO 功能富集分析Fig.3 GO function enrichment analysis

表3 PPI 網(wǎng)絡(luò)中的拓撲學分析Table 3 Topological analysis in PPI network

2.4 富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對PRR 治療CH 的潛在作用靶點進行GO 功能富集分析，共富集到306 條生物學過程，其中56 條與分子功能（MF）相關(guān)，28 條與細胞組分（CC）相關(guān)，222 條與生物過程（BP）相關(guān)，根據(jù)P Value 值選取各自前10 個條目，通過微生信在線分析平臺進行可視化分析。赤芍的潛在活性成分參與眾多生物學過程，生物過程主要涉及了轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控DNA 模板、蛋白激酶B 信號的正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、細胞遷移的正調(diào)控等過程；細胞組分主要涉及到質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成部分、細胞外間隙、受體復合體等；分子功能主要涉及到相同蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合、ATP結(jié)合、DNA 結(jié)合等。

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對PRR 治療CH 的潛在作用靶點進行KEGG 富集分析，共富集得到92 條代謝通路，主要涉及MAPK信號通路、癌癥中的蛋白多糖、癌癥的通路、松弛素信號通路、肝細胞癌等。根據(jù)P 值選取前20 條通路，通過Omicshare 在線平臺進行可視化分析得氣泡圖，見圖4。

圖4 KEGG 通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis

2.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)P 值選取前20 條通路，通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PRR 治療CH 的“成分靶點通路”網(wǎng)絡(luò)（圖5），根據(jù)Edge Betweenness 值來確定各節(jié)點的作用強度，通過Network Analysis 模塊進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析，根據(jù)Degree 值選擇網(wǎng)絡(luò)中的核心成分。由該網(wǎng)絡(luò)進行分析可以充分體現(xiàn)PRR 治療CH 符合中藥治療疾病的多成分、多靶點、多通路的特征，說明PRR 是通過多成分、多靶點、多通路對CH 起到治療作用的。

2.6 動物試驗驗證

2.6.1 赤芍對ANIT 誘導的膽汁淤積大鼠的藥效學評價 TBA、TBIl、DBIL連同肝功能受損異常的ALP、ALT、AST均是反映膽汁淤積性肝炎的常規(guī)指標。赤芍提取物對膽汁淤積大鼠血清生化指標檢測結(jié)果如圖6，與空白組相比，模型組AST、ALT、ALP 的活性及TBA、TBIL、DBIL 的含量極顯著升高（P ＜0.01）。與模型對照組比較，赤芍提取物組[2.8 g/（kg·d）]和陽性藥組（UDCA）AST、ALT、ALP 的活性及TBA、TBIL、DBIL 的含量顯著降低（P ＜0.05）。

圖6 各組大鼠血清中肝功能指標變化（,n=8）Fig.6 Effects of PRR on serum liver function parameters in ANIT-induced cholestasis rats (,n=8)

2.6.2 赤芍對ANIT 誘導的膽汁淤積大鼠的作用機制驗證 通過測定各組大鼠肝組織中陽性區(qū)域的IOD值進行比較，與空白組相比，模型組肝組織中TNF-、EGFR、VEGFA 蛋白的表達量明顯增加（P ＜0.001）；與模型對照組相比，赤芍提取物組與陽性藥組肝組織中TNF-、EGFR、VEGFA 蛋白的表達量均顯著降低（P ＜0.05），如圖7。

圖7 各組大鼠肝臟組織內(nèi)TNF-、EGFR、VEGFA 蛋白表達的免疫組化分析（,n=8,200）Fig.7 Effects of PRR on immunohistochemical analysis of TNF-,EGFR and VEGFA protein expression in ANIT-induced cholestasis rats(,n=8,200)

3 討論與結(jié)論

膽汁淤積性肝炎是一種臨床常見的因膽汁形成、分泌或排泄障礙而引起的癥狀，主要表現(xiàn)為黃疸、皮膚瘙癢等，肝功明顯異常，如ALP、AST、ALT、TBA、TBIL等升高[21]。其發(fā)病機制可能與膽汁轉(zhuǎn)運體異常、膽汁調(diào)節(jié)機制紊亂等有關(guān)，繼續(xù)惡化會演變?yōu)楦斡不踔了劳?。目前，膽汁淤積相關(guān)動物模型成熟且多樣，ANIT是最常用的模型藥物，ANIT誘導的膽汁淤積模型以損傷膽管為主，且生化與病理改變與人膽汁淤積相近[22]。ANIT 造模后，在0～45 min 內(nèi)大鼠血清中各項肝功生化指標升高，肝細胞變性壞死，大量炎癥細胞浸潤[23]。尋找新的靶點和臨床有效且副作用小的藥物治療HC十分重要。赤芍為毛茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根，其味苦，性微寒，有清熱涼血等功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，赤芍具有保肝、抗炎等藥理作用，臨床上用于治療膽汁淤積性肝炎特別是重度黃疸有明顯療效[24]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合體內(nèi)試驗，明確了赤芍對膽汁淤積性肝炎大鼠的保護作用及可能的作用機制。通過數(shù)據(jù)庫的篩選，得到赤芍的活性成分有28 個，其中芍藥苷、芍藥新苷等可能是其活性成分，研究證明芍藥苷具有抗炎和肝保護作用，可能是通過調(diào)節(jié)NF-B信號通路，緩解炎癥，從而對肝臟起到保護作用[25]。在PPI 網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)中顯示，TNF、VEGFA、EGFR 等靶點可能是赤芍治療膽汁淤積性肝炎的核心靶點。腫瘤壞死因子（TNF）是引起細胞凋亡（壞死）的細胞因子，TNF 家族有TNF-，主要是由活化巨噬細胞產(chǎn)生，含有多種調(diào)節(jié)功能，TNF-在組織發(fā)生炎癥的發(fā)病機制具有重要作用。EGFR 是原癌基因C-erbB-1 的表達產(chǎn)物，研究顯示EGFR 能促使肌成纖維細胞產(chǎn)生膠原蛋白進而促進CH 的炎癥進程。通過赤芍對ANIT 誘導膽汁淤積性肝炎的藥效學評價，應用全自動生化分析儀檢測血清肝功指標的含量改變，結(jié)果表明，赤芍提取物可以顯著降低血清中TBIL、DBIL、TBA 含量及ALP、ALT、AST 酶活性，進而表明赤芍對ANIT 大鼠有明顯的保護作用。赤芍治療膽汁淤積性肝病的通路富集分析結(jié)果可以看出，赤芍中主要發(fā)揮作用的活性成分是芍藥苷、芍藥新苷、（2R，3R）-4-甲氧基二苯乙烯等，且主要作用在MAPK8、TNF、VEGFA、EGFR 等多個靶點，調(diào)節(jié)MAPK、胰島素抵抗等多條通路，通過多成分 多靶點 多通路來發(fā)揮治療膽汁淤積性肝病的作用。本研究通過免疫組化法檢測MAPK 信號通路及PPI 網(wǎng)絡(luò)中核心靶點TNF、VEGFA、EGFR 在ANIT大鼠肝臟中的表達情況，結(jié)果表明赤芍提取物可能是通過下調(diào)肝組織TNF、VEGFA 和EGFR 等蛋白的表達，對ANIT 誘導膽汁淤積性肝炎大鼠有明顯的保護作用。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學及體內(nèi)試驗，系統(tǒng)研究了赤芍治療膽汁淤積性肝病的作用機制，結(jié)果表明，赤芍中的單萜及其苷類對改善膽汁淤積性肝病具有一定的作用。研究結(jié)果表明了赤芍治療膽汁淤積性肝炎具有多成分、多靶點、多通路的特點，可能通過芍藥新苷、芍藥苷干預TNF、EGFR、VEGFA 等靶點進而調(diào)節(jié)MAPK 等信號通路發(fā)揮治療膽汁淤積性肝炎的作用，為赤芍治療膽汁淤積性肝病提供了研究基礎(chǔ)和科學依據(jù)。