張紅勐 高園 楊自云 陳龍清 吳 田

關(guān)鍵詞：金花茶；種質(zhì)資源；葉片；功能性成分；礦質(zhì)元素；聚類分析

金花茶組植物（Camelliasect.Chrysantha）是山茶科山茶屬中唯一開(kāi)黃花的植物類群，不僅是珍貴的觀賞植物，還具有較高的藥用保健價(jià)值。金花茶組植物體內(nèi)含有超過(guò)400種不同種類的成分[1-2]，其中的微量元素以及茶多酚、茶多糖、黃酮、皂苷等功能性成分對(duì)人體有重要保健作用，屬于極具開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值的優(yōu)勢(shì)資源[3]。金花茶可以延緩機(jī)體衰老[4]，具有一定的防癌、治癌的功效[5-6]，能預(yù)防人體動(dòng)脈粥樣硬化，有利于降低血脂[7]和控制血壓[8]，有利于降低血糖[9]等。

目前在世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的金花茶組植物有42種5個(gè)變種，而我國(guó)有29種5個(gè)變種[10]。前人在對(duì)不同種金花茶內(nèi)含成分進(jìn)行了一些分析，發(fā)現(xiàn)不同的金花茶組植物內(nèi)含的活性成分存在較大差異[11-16]。2010年5月，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布2010年第9號(hào)公告，批準(zhǔn)金花茶[Camelliachrysantha（Hu）Tuyama]為新資源食品，并且隨著人們對(duì)健康的關(guān)注和保健品市場(chǎng)的繁榮，近年來(lái)，越來(lái)越多的金花茶產(chǎn)品被開(kāi)發(fā)，如金花茶茶飲料、袋泡茶、濃縮液和口服液等一系列營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)品，市場(chǎng)前景較好。但除金花茶外的其他金花茶組植物鮮見(jiàn)被用于營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，癥結(jié)在于對(duì)內(nèi)含成分的了解不夠全面和深入。

金花茶首次發(fā)現(xiàn)于1933年，當(dāng)時(shí)還沒(méi)有人給它一個(gè)合適的名稱。1948年，我國(guó)科學(xué)家在廣西防城港發(fā)現(xiàn)了開(kāi)黃花的山茶科植物后，便根據(jù)花的顏色將其命名為“金花茶”，于1960年對(duì)外公布。1988年，科學(xué)家又在云南大圍山發(fā)現(xiàn)了不同植物學(xué)性狀的金花茶新種，命名為云南金花茶（CamelliafascicularisH.T.Chang），又叫簇蕊金花茶，為云南特有﹑極小種群植物[17]，與薄葉金花茶、顯脈金花茶、凹脈金花茶﹑毛瓣金花茶、東興金花茶等均屬于“極危種”（criticallyendangered，CR），并被列入中國(guó)物種紅色名錄[18]。大圍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于云南省東南部，屬森林生態(tài)系統(tǒng)類型的自然保護(hù)區(qū)[19]，降水量較大，氣候濕潤(rùn)，云霧繚繞，極其適宜金花茶的生長(zhǎng)繁育。

為了加強(qiáng)對(duì)金花茶資源的保護(hù)和研究，尤其希望進(jìn)一步摸清云南省的金花茶資源，本課題組前期對(duì)云南大圍山金花茶組植物進(jìn)行考察，考察過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一些植物學(xué)性狀特異的金花茶種質(zhì)資源，并通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)這些金花茶組植物種質(zhì)間存在豐富的遺傳多樣性，和普通金花茶也有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系[20]。為便于對(duì)金花茶種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)觀察和評(píng)價(jià)鑒定，本課題組前期將20余份金花茶種質(zhì)資源遷地保護(hù)于西南林業(yè)大學(xué)樹(shù)木園，并模擬原生地條件（半陰半涼、潮濕、通風(fēng)）對(duì)其進(jìn)行栽培管理，至2021年有8份來(lái)自大圍山、種源不甚清晰的金花茶種質(zhì)（命名為JHC-1～8）長(zhǎng)成成齡苗，植株?duì)顟B(tài)良好。在觀測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)這8份金花茶種質(zhì)資源表型如葉形、葉色、花量、新稍萌發(fā)特征等表現(xiàn)差異。本研究以這8份金花茶種質(zhì)資源為材料，以普通金花茶（CamellianitidissimaChi）、云南金花茶（C.fascicularisH.T.Chang）等5份種源清楚的金花茶為對(duì)照，對(duì)其葉片中礦質(zhì)元素含量及功能性成分進(jìn)行檢測(cè)，為合理開(kāi)發(fā)和利用金花茶組植物資源提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

前期收集了13份金花茶種質(zhì)資源，5～6年生，均保存于西南林業(yè)大學(xué)樹(shù)木園（250347.20N，102467.43E，海拔1891m），該環(huán)境條件能夠滿足供試金花茶組植物的良好生長(zhǎng)。在相同的生長(zhǎng)環(huán)境中，將13種不同的種質(zhì)資源分別開(kāi)溝種植，采用相同的田間管理。其中，5份種源清楚，分別為普通金花茶（CamellianitidissimaChi）、紅河1號(hào)金花茶（C.nitidissima‘Honghel）、云南金花茶（C.fascicularisH.T.Chang）、凹脈金花茶（C.impressinervisChangetS.Y.Liang）和毛瓣金花茶（C.pubipetalaY.WanetS.Z.Huang），其中，紅河1號(hào)金花茶是由云南省林木品種審定委員會(huì)于2016年12月認(rèn)定通過(guò)的金花茶良種，目前在云南省紅河州大量種植。另外8份金花茶種質(zhì)資源JHC-1～8均來(lái)源于大圍山。

2021年8月21日進(jìn)行葉片取樣，分別取植株中部成熟葉片，設(shè)3個(gè)重復(fù)。采集的葉片經(jīng)蒸餾水洗凈后擦去表面水分，60℃烘干至恒重，用植物粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，密封保存于?80℃冰箱中，用于茶多酚、總黃酮、總皂苷及總多糖等功能性成分檢測(cè)及金花茶中代表性礦質(zhì)元素（Cu、Zn、Fe、Mn、Ca、Mg）含量測(cè)定。

1.2方法

1.2.1葉片含水率測(cè)定葉片含水量測(cè)定采用烘干稱重法。將采集的3片葉片稱鮮重（FW），60℃烘干至恒重，稱干重（DW）。葉片含水率=（FW-DW）/FW×100%。

1.2.2微量元素檢測(cè)取粉碎樣品0.3g（精確至0.0001g）于消解罐，加入混合酸（硝酸和高氯酸體積比為4∶1）搖勻后，置于電熱板上低溫加熱至完全消解至近干，補(bǔ)加硝酸和過(guò)氧化氫，混勻后微波消解，趕酸后定容搖勻待測(cè)定其他元素。取消解液8mL，加入濃鹽酸，硫脲加抗壞血酸搖勻反應(yīng)后待測(cè)，應(yīng)用電感耦合離子光譜儀ICP-OES，測(cè)定方法采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LY/T1270—1999。測(cè)定的礦質(zhì)元素有鈣（Ca）、鎂（Mg）、鐵（Fe）、錳（Mn）、銅（Cu）、鋅（Zn），試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值，同法做空白。測(cè)試設(shè)備為等離子體發(fā)射光譜儀（德國(guó)斯派克分析儀器公司）、ZEEnit.700P火焰原子吸收分光光度計(jì)（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）。標(biāo)準(zhǔn)溶液由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000μg/mL）配制而成，每個(gè)標(biāo)曲R均在0.995以上。水為超純水，試劑藥品均為優(yōu)級(jí)純。

1.2.3功能性成分檢測(cè)采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定金花茶葉片中茶多酚、總黃酮、總多糖、總皂苷含量。茶多酚測(cè)定參照《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》（GB/T8313—2008），得到的茶多酚待測(cè)液按福林酚氧化法測(cè)定?？傸S酮的測(cè)定參考黃興賢[21]的方法，并稍作修改：稱取0.5g樣品粉末于50mL錐形瓶中，加40mL75%乙醇，20℃下超聲提取0.5h，過(guò)濾，用75%乙醇洗滌殘?jiān)?，合并濾液定容于50mL容量瓶中，得總黃酮待測(cè)液，按亞硝酸鈉－硝酸鋁－氫氧化鈉顯色法測(cè)定。總多糖測(cè)定參考韋璐[22]的方法稍作修改，在提取總黃酮后，將殘?jiān)?5mL水于75℃超聲提取1h，過(guò)濾，用水洗滌濾渣，合并濾液定容于50mL容量瓶中，得多糖待測(cè)液，按苯酚－硫酸法測(cè)定。總皂苷測(cè)定參考高麗萍等[23]的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，稱取樣品粉末0.5g于錐形瓶中，加入50mL75%乙醇，20℃下超聲0.5h，過(guò)濾，濾液旋蒸至無(wú)醇味，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入適量水飽和，正丁醇萃取2次，合并正丁醇層，旋蒸至干，加入甲醇復(fù)溶并定容至10mL容量瓶中，搖勻，作為皂苷待測(cè)液香草醛－冰醋酸－高氯酸法進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)礦質(zhì)元素和功能性成分等試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA），并用最小顯著差數(shù)法（LSD法）進(jìn)行多重比較。用Excel2007軟件進(jìn)行圖表制作。對(duì)13份不同的金花茶礦質(zhì)元素、功能性成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，運(yùn)用SPSS20.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析及聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1葉片表型性狀分析

8份金花茶種質(zhì)資源JHC-1～8表型與5份對(duì)照種質(zhì)資源有明顯差異（表1），葉長(zhǎng)為11.0～17.7cm，葉寬為4.7～9.7cm，葉長(zhǎng)與葉寬的比值為1.69～2.74。根據(jù)葉長(zhǎng)葉寬比，可將13份金花茶葉片形狀劃分為橢圓形和長(zhǎng)橢圓形2種類型，其中橢圓形資源有5份，占38.5%，長(zhǎng)橢圓形資源有8份，占總種源量的61.5%；其中，JHC-1、JHC-4、JHC-6的葉長(zhǎng)/葉寬比值均超過(guò)2.5，呈長(zhǎng)橢圓形，而JHC-7葉長(zhǎng)/葉寬比值僅為1.73，呈橢圓形。成熟葉片葉面積介于55.00～162.96cm2之間，借鑒茶樹(shù)葉片大小的分類方法[24]，普通金花茶、云南金花茶、毛瓣金花茶、JHC-1、JHC-2、JHC-6、JHC-7、JHC-8可劃分為大葉型，其余劃分為中小葉型。由表1可知，13份金花茶種質(zhì)資源葉色分為深綠色、綠色及黃綠色，且只有JHC-7葉片為黃綠色，葉片橢圓或長(zhǎng)橢圓形較為普遍，葉長(zhǎng)/葉寬比值在1.69～2.74之間，除毛瓣金花茶與JHC-7的葉質(zhì)為薄革質(zhì)，其余葉質(zhì)均為革質(zhì)。13份金花茶種質(zhì)資源中，只有凹脈金花茶以及毛瓣金花茶具有絨毛。葉緣特征全為具鋸齒，部分種質(zhì)資源葉片只有上半部有細(xì)鋸齒。13份金花茶種質(zhì)資源的葉片平均含水率的為55.7%，含水率最高的種質(zhì)是凹脈金花茶，含水率最低的種質(zhì)是JHC-8，極差為17.66%。其中普通金花茶、凹脈金花茶、JHC-3含水率較高，分別為61.7%、62.1%、60.7%，而JHC-4、JHC-8含水率較低，只有46.1%、44.5%（表1）。

2.2礦質(zhì)元素含量分析

13份金花茶種質(zhì)資源的葉片中，凹脈金花茶的Cu含量最高，達(dá)7.69mg/kg，最低的為JHC-5，僅3.59mg/kg，前者是后者的2.1倍；Zn含量最高的是毛瓣金花茶，達(dá)19.07mg/kg，最低的為JHC-6，僅10.21mg/kg，前者是后者的1.9倍；Fe含量最高的是JHC-1，達(dá)318.4mg/kg，最低的為JHC-5，僅74.6mg/kg，前者是后者的4.3倍；Mn含量最高的是JHC-2，達(dá)581.4mg/kg，最低的為JHC-7，僅88.5mg/kg，前者是后者的6.6倍；Ca含量最高的是云南金花茶，達(dá)10.11g/kg，最低的為JHC-6，僅7.45g/kg，前者是后者的1.4倍；Mg含量最高的也是云南金花茶，達(dá)4.51mg/kg，最低的為JHC-7，僅2.54mg/kg，前者是后者的1.8倍（圖1）。

不同金花茶種質(zhì)資源葉片中礦質(zhì)元素含量間存在差異，Cu含量較高的有云南金花茶、紅河1號(hào)毛瓣金花茶、凹脈金花茶，含量較低的有JHC-5、JHC-7、JHC-6、JHC-8；Zn含量較高的有JHC-8、云南金花茶、毛瓣金花茶，含量較低的有JHC-6、JHC-2、JHC-1；Fe含量較高的有普通金花茶、JHC-8、毛瓣金花茶、JHC-1，含量較低的有JHC-5、JHC-6、JHC-2；Mn含量較高的有JHC-4、紅河1號(hào)、JHC-3、JHC-2，含量較低的有JHC-7、JHC-5、云南金花茶；Ca含量較高的有JHC-2、JHC-8、云南金花茶，含量較低的有JHC-6、JHC-5、凹脈金花茶、JHC-7；Mg含量較高的有JHC-1、JHC-8、云南金花茶，含量較低的有JHC-7、JHC-2、JHC-3、凹脈金花茶。

2.3功能性成分含量分析

金花茶種質(zhì)JHC-7的茶多酚含量最高，達(dá)10.67%，低于2.00%的有JHC-2和JHC-3，僅為1.91%和1.84%，前者是后者的5.0倍以上；JHC-8的總多糖含量最高，達(dá)10.20%，JHC-1和毛瓣金花茶的總多糖含量次之，分別為9.97%和9.50%，云南金花茶中僅含2.02%，最高和最低相差達(dá)5.0倍；總皂苷含量最高的是凹脈金花茶，達(dá)6.53%，最低的為JHC-1，僅0.60%，前者是后者的10.9倍；總黃酮含量最高的是JHC-2，達(dá)4.30%，最低的為JHC-7，僅2.13%，相差2.0倍（圖2）。

不同金花茶種質(zhì)資源葉片中功能性成分含量間存在顯著性差異，茶多酚含量較高的有毛瓣金花茶、JHC-7，含量較低的有JHC-3、JHC-2；總多糖含量較高的有毛瓣金花茶、JHC-1、JHC-8，含量較低的有云南金花茶、JHC-4；總皂苷含量較高的有JHC-2、JHC-4、凹脈金花茶，含量較低的有JHC-1、JHC-7；總黃酮含量較高的有JHC-5、JHC-2，含量較低的有JHC-7、紅河1號(hào)。

2.4葉片表型性狀與礦質(zhì)元素、功能成分的相關(guān)性分析13份金花茶種質(zhì)資源葉片表型性狀與礦質(zhì)元素、功能性成分的相關(guān)性結(jié)果見(jiàn)表2，其中葉長(zhǎng)/葉寬與茶多酚、鋅元素含量呈顯著（P<0.05）負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為?0.561、?0.655，葉質(zhì)、葉色與茶多酚含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.856、0.835，葉色與錳元素含量呈極顯著（P<0.01）負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.687，絨毛與銅含量元素呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.623。其余礦質(zhì)元素及功能成分與葉片表型性狀之間無(wú)顯著相關(guān)性。

2.5聚類分析

以13種金花茶葉片中4種功能性成分及6種礦質(zhì)元素含量為參數(shù)組合，對(duì)其進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)在距離系數(shù)為4.5時(shí)，可以將這13種金花茶劃分為5組，其中第Ⅰ組包括：紅河1號(hào)、JHC-2、JHC-3、JHC-4；第Ⅱ組有云南金花茶、JHC-5、JHC-7；第Ⅲ組有凹脈金花茶和JHC-6；第Ⅳ組有普通金花茶、JHC-8、毛瓣金花茶；而第Ⅴ組只有JHC-1（圖3）。第Ⅰ組和第Ⅳ組中的金花茶微量元素和功能性成分含量相對(duì)較高，可能具有更高的藥用和保健功能；而第Ⅲ組金花茶的微量元素和功能性成分含量在各種金花茶中相對(duì)較低，其藥用和保健功能可能相對(duì)較低。聚類圖進(jìn)一步表明JHC-1～8是區(qū)別于普通金花茶、紅河1號(hào)、云南金花茶、凹脈金花茶和毛瓣金花茶等已知種源的新的金花茶組植物。

3討論

大多數(shù)植物葉片含水率占組織鮮重的65%～90%，而本研究中13種金花茶種質(zhì)資源的葉片含水率均在62%以下。通常葉片含水量越低，蒸騰強(qiáng)度越小，故葉片含水率是一個(gè)可靠的植物耐旱鑒定指標(biāo)[25]，且金花茶成熟葉片一般呈革質(zhì)化，可見(jiàn)金花茶植株整體耐旱，因此并不適于頻繁澆水。尤其本研究中JHC-4、JHC-8的葉片含水率低于50%，更暗示了其強(qiáng)耐旱性，為后續(xù)選育強(qiáng)耐旱性株系提供了材料。不僅含水率，來(lái)自云南大圍山的JHC-1～8表型表現(xiàn)出不同于已知種源的金花茶，其葉色、葉鋸齒、葉面積也都發(fā)生了較大變化，猜測(cè)其內(nèi)含成分也發(fā)生了一定的變化，經(jīng)實(shí)際檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，礦質(zhì)元素、功能性成分的差異達(dá)到顯著水平。而高礦質(zhì)元素含量及高功能性成分含量的種質(zhì)是金花茶育種取得成功的物質(zhì)基礎(chǔ)，性狀遺傳變異的評(píng)估是提高遺傳改良效率的重要內(nèi)容。這也進(jìn)一步表明云南大圍山蘊(yùn)含著豐富的金花茶資源，是金花茶資源的寶庫(kù)。

動(dòng)物及臨床試驗(yàn)表明，金花茶葉提取物具有降血糖、降血壓、降血脂、降血清中膽固醇、抑制腫瘤生長(zhǎng)、防止動(dòng)脈粥樣硬化、激活人體多種酶、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力、延緩衰老等功能[26-31]，而金花茶葉片中所含的生理活性成分是這些功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。金花茶含有茶多酚、多糖、總黃酮、總皂苷等生理活性物質(zhì)，它們的含量均與其抗氧化活性相關(guān)。人工合成抗氧化劑可能引起癌變和肝臟損傷，因此，開(kāi)發(fā)高效無(wú)毒的天然抗氧化劑，已成為植物領(lǐng)域重要的研究?jī)?nèi)容。前人相關(guān)研究表明，在金花茶組植物中毛瓣金花茶（C.pubipetala）葉片茶多酚、總黃酮等含量更高，礦質(zhì)元素Ca、Mn、Fe、Zn、Cu等含量更為豐富[32]，同樣，在本研究中，毛瓣金花茶成熟葉片除總皂苷、Ca、Mg等在相應(yīng)各項(xiàng)平均值以下，其他各項(xiàng)指標(biāo)均高于平均值，確實(shí)表現(xiàn)優(yōu)異，因此毛瓣金花茶具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。若以毛瓣金花茶為參照，本研究發(fā)現(xiàn)JHC-7的茶多酚含量是毛瓣金花茶的1.5倍，JHC-1、JHC-2、JHC-8的總多糖含量和毛瓣金花茶的無(wú)顯著性差異、且都顯著高于其他金花茶，JHC-2、JHC-5的總黃酮含量顯著高于毛瓣金花茶，JHC-1的Fe含量是毛瓣金花茶的1.4倍，JHC-2、JHC-3、JHC-4的Mn含量顯著高于毛瓣金花茶，JHC-2、JHC-8的Ca含量顯著高于毛瓣金花茶，JHC-1、JHC-8的Mg含量顯著高于毛瓣金花茶。這些結(jié)果和聚類分析的樹(shù)狀圖一致?？梢?jiàn)，JHC-2、JHC-8的物質(zhì)含量總體上很高，暗示著有更高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，也可以作為后續(xù)重要的選育材料進(jìn)行其藥用和保健功能的研究。

極端植物材料的篩選是剖析復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)的一種重要研究基礎(chǔ)。通過(guò)本研究，還為后續(xù)在金花茶中解析重要功能性成分累積機(jī)理的研究篩選到極端材料，如總皂苷含量極高材料凹脈金花茶與極低材料JHC-1相差10.9倍；茶多酚含量極高材料JHC-7與極低材料JHC-3相差5.8倍；總多糖含量極高材料JHC-8與極低材料云南金花茶相差5.0倍；Mn含量極高材料JHC-2與極低材料JHC-7相差6.6倍；Fe含量極高材料JHC-1與極低材料JHC-5相差4.3倍。隨著高通量技術(shù)在植物領(lǐng)域的研究進(jìn)程，基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等多個(gè)層面的海量數(shù)據(jù)對(duì)植物極端材料進(jìn)行分析，將進(jìn)一步幫助我們更為全面、系統(tǒng)地解析金花茶種間的復(fù)雜變化與調(diào)控過(guò)程。

4結(jié)論

本研究對(duì)13種金花茶種質(zhì)資源葉片的微量元素及功能性成分含量進(jìn)行測(cè)定并分析，結(jié)果表明，13種金花茶種質(zhì)資源葉片的微量元素及功能性成分差異顯著（P<0.05），可根據(jù)各自特點(diǎn)，對(duì)所需營(yíng)養(yǎng)成分的需求進(jìn)行針對(duì)性的開(kāi)發(fā)利用。今后應(yīng)集中開(kāi)發(fā)價(jià)值更高的金花茶種類，更合理地開(kāi)發(fā)利用金花茶種質(zhì)資源，最大程度發(fā)揮其功效。