喬同同 張宇 李梓芃 喬木 秦振洋 彭先文 吳俊靜

摘要：在硒都黑豬群體中發(fā)現(xiàn)豬NARS2基因第9內(nèi)含子中存在g.101284 C>T突變位點(diǎn)，采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法進(jìn)行基因分型后，與23個(gè)胴體和肉質(zhì)類性狀表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，NASR2基因g.101284 C>T位點(diǎn)極顯著影響豬胴體皮厚（P<0.01），且顯著影響豬肉眼肌面積、滴水損失48 h和肌內(nèi)脂肪含量性狀（P<0.05）。CC基因型個(gè)體皮厚極顯著低于TT基因型個(gè)體（P<0.01）；CC基因型個(gè)體滴水損失48 h和肌內(nèi)脂肪含量顯著高于其他基因型個(gè)體，而TT基因型個(gè)體胴體眼肌面積顯著小于其他基因型個(gè)體（P<0.05）。而這4個(gè)性狀中，除皮厚與眼肌面積性狀不存在顯著相關(guān)外，其他各性狀之間存在一定程度的相關(guān)性。其中，滴水損失48 h與肌內(nèi)脂肪含量性狀相關(guān)性最高（r2=0.882，P<0.01）。因此，該標(biāo)記在育種應(yīng)用中應(yīng)當(dāng)結(jié)合育種目標(biāo)合理利用，針對(duì)不同主選性狀，選留或淘汰不同基因型個(gè)體。

關(guān)鍵詞：硒都黑豬；胴體性狀；肉質(zhì)性狀；NARS2基因；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)：S828；S813? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）12-0195-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.034 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Association analysis of NARS2 gene variation and carcass and meat quality traits

in selenium black pig

QIAO Tong-tong， ZHANG Yu， LI Zi-peng， QIAO Mu， QIN Zhen-yang， PENG Xian-wen， WU Jun-jing

（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan? 430064，China）

Abstract： A g.101284 C>T mutation site was found in intron 9 of the NARS2 gene in the selenium black pig population. After genotyping using PCR product direct sequencing， association analysis was conducted with 23 phenotypes of carcass and meat quality traits.The results showed that the g.101284 C>T locus of the NASR2 gene significantly affected the skin thickness of pig carcasses （P<0.01）， and significantly affected the eye muscle area， drip loss for 48 hours， and intramuscular fat content traits of pork （P<0.05）. The skin thickness of individuals with CC genotype was significantly lower than that of individuals with TT genotype （P<0.01）；the 48 hours drip loss and intramuscular fat content of individuals with CC genotype were significantly higher than those with other genotypes， while the carcass eye muscle area of individuals with TT genotype was significantly smaller than that of individuals with other genotypes （P<0.05）. Among these four personality traits， there was a certain degree of correlation between other traits except for skin thickness and eye muscle area traits， which were not significantly correlated. Among them， the 48 hours drip loss had the highest correlation with intramuscular fat content traits （r2=0.882， P<0.01）. Therefore， this marker should be reasonably utilized in breeding applications in conjunction with breeding objectives， and individuals of different genotypes should be selected or eliminated for different main selected traits.

Key words： selenium black pig； carcass traits； meat quality traits； NARS2 gene； association analysis

中國是全球豬肉生產(chǎn)大國，無論是養(yǎng)殖規(guī)模還是消費(fèi)量都居于世界前列。胴體和肉質(zhì)是豬育種行業(yè)中的重要經(jīng)濟(jì)特征，胴體質(zhì)量及豬肉品質(zhì)的高低直接影響著養(yǎng)殖場的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益。胴體和肉質(zhì)的大多數(shù)性狀屬于中高等遺傳力［1-3］，如肌內(nèi)脂肪含量性狀遺傳力可達(dá)0.49～0.86［4］。目前，人們對(duì)影響肉質(zhì)特征的關(guān)鍵基因了解仍然不足。因此，尋找控制豬肉質(zhì)量的關(guān)鍵分子遺傳標(biāo)記，并將其應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種，對(duì)于提高豬的肉質(zhì)特征、增加經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶2（NARS2）是一種?；鵷RNA合成酶，其在細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成過程中起著重要作用。在人類相關(guān)研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，NARS2基因變異在聯(lián)合氧化磷酸化缺陷24（OXPD24）中引起神經(jīng)退行性和肌病綜合征［5，6］，與非綜合征性常染色體隱性耳聾94（DFNB94）［7］、利氏綜合征［8］等疾病相關(guān)。而有關(guān)該基因在動(dòng)物中的研究報(bào)道較少。

硒都黑豬是以恩施黑豬、梅山豬、湖北白豬等為基礎(chǔ)，歷經(jīng)12年培育而成的黑豬新品種。課題組前期利用基因組重測(cè)序技術(shù)對(duì)比分析了硒都黑豬肌內(nèi)脂肪含量極端差異個(gè)體的基因組群體分化信號(hào)，發(fā)現(xiàn)NARS2基因在高、低肌內(nèi)脂肪組中存在顯著分化位點(diǎn)。因此，本研究擴(kuò)增了豬NARS2基因序列，利用該序列進(jìn)行遺傳變異位點(diǎn)的篩選鑒定及與胴體和肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期獲得與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的新分子育種標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

275頭健康硒都黑豬飼養(yǎng)于湖北華健硒園農(nóng)牧科技有限公司硒都黑豬育種基地，在體重達(dá)100 kg左右時(shí)，進(jìn)行屠宰測(cè)定，采集背最長肌（背?。┙M織黃豆大小樣本，置于2 mL凍存管，液氮保存。同時(shí)收集并記錄屠宰日齡、屠宰日期、屠宰體重、系譜等基本信息。隨機(jī)選取少量個(gè)體，采集腰肌、比目魚肌、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背脂、腹脂、結(jié)腸、回腸、盲腸等組織黃豆大小樣本，置于2 mL凍存管，液氮保存。

1.2 胴體和肉質(zhì)性狀檢測(cè)

屠宰率、胴體長、平均背膘厚、皮厚、肋骨對(duì)數(shù)、眼肌面積、腿臀比例、皮率、肥肉率、瘦肉率、骨率等胴體性狀按照國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 825—2004《瘦肉型豬胴體性狀測(cè)定技術(shù)規(guī)范》規(guī)定方法測(cè)定。肉色評(píng)分1、肉色評(píng)分24、肌肉色值L1、肌肉色值L24、大理石紋評(píng)分、pH1、滴水損失48 h、系水力、肌內(nèi)脂肪、水分、嫩度等肉質(zhì)性狀表型按照國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 821—2019《豬肉品質(zhì)測(cè)定技術(shù)規(guī)程》規(guī)定方法測(cè)定。

1.3 基因組DNA和RNA提取

基因組DNA的提取采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的基因組DNA提取試劑盒（按該試劑盒說明書進(jìn)行操作）提??；組織總RNA利用Invitrogen TRIzol和氯仿提取。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸質(zhì)量，并用Nanodrop 2000型分光光度計(jì)檢測(cè)核酸濃度。

1.4 豬NARS2基因熒光定量檢測(cè)

取1 μg的RNA樣本，利用Thermo ScientificTM RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA。采用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix試劑盒，使用QuantStudio 6熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）進(jìn)行qPCR檢測(cè)。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每組試驗(yàn)做3個(gè)平行，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息見表1。采用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40次；熔解曲線：95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，96 ℃ 1 s。

1.5 豬NARS2基因多態(tài)性檢測(cè)

以40頭硒都黑豬的DNA樣本混合池為模板，進(jìn)行豬NARS2基因第9內(nèi)含子片段序列PCR擴(kuò)增，上游引物：5′-TGTGCATTTATGTGTATTTCGGGG-3′，下游引物：5′-GGTCAAATGACGATGCTGCT-3′。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：100 ng模板DNA、10×Buffer （含Mg2+） 4 μL、上下游引物各0.5 μmol/L、2.5 μmol/L dNTPs、1 U Taq DNA聚合酶。PCR運(yùn)行程序：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，65～55 ℃退火40 s（每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃），72 ℃延伸60 s，共20個(gè)循環(huán)；94 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共15個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，采用Gel Extraction Kit試劑盒進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物直接送到北京奧科公司進(jìn)行DNA測(cè)序，對(duì)比篩選基因變異位點(diǎn)。

1.6 基因分型

利用上述引物分別擴(kuò)增硒都黑豬DNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)Sanger測(cè)序分析后進(jìn)行基因分型。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中一般線性模型GLM進(jìn)行基因型與性狀表型值的關(guān)聯(lián)分析。一般線性模型GLM的表達(dá)式如下：

Yijklm=μ+Gi+Aj+Xk+Sl+eijklm （1）

式中，Yijklm表示性狀表型值；μ表示群體均值；Gi表示基因型效應(yīng)；Aj表示年季效應(yīng)；Xk表示性別效應(yīng)；Sl表示父本效應(yīng)；eijklm表示隨機(jī)誤差，結(jié)果以最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

利用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中的相關(guān)分析模型計(jì)算表型性狀的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。P<0.05判定為顯著差異，P<0.01判定為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬NARS2基因組織表達(dá)譜

利用qPCR方法檢測(cè)了豬NARS2基因組織表達(dá)譜情況，發(fā)現(xiàn)該基因在肌肉、脂肪、各內(nèi)臟器官等組織中廣泛表達(dá)，在肝臟組織中表達(dá)量最高，其次是背肌、腰肌、比目魚肌等肌肉組織，在盲腸組織中表達(dá)量最低（圖1）。

2.2 豬NARS2基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

通過對(duì)40個(gè)硒都黑豬DNA混合樣本池進(jìn)行NARS2基因片段擴(kuò)增測(cè)序，發(fā)現(xiàn)豬NARS2基因第9內(nèi)含子中存在1個(gè)單堿基突變位點(diǎn)，即位于該基因序列第101 359 bp處的C>T堿基突變（g.101284 C>T），如圖2所示。

2.3 豬NARS2基因變異與胴體和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

將275頭硒都黑豬NARS2基因g.101284 C>T基因型與其胴體和肉質(zhì)等23個(gè)表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表2所示。NASR2基因g.101284 C>T位點(diǎn)極顯著影響豬胴體皮厚，CC基因型個(gè)體皮厚極顯著低于TT基因型個(gè)體（P<0.01）。同時(shí)，該位點(diǎn)還顯著影響豬肉眼肌面積、滴水損失48 h和肌內(nèi)脂肪含量性狀，CC基因型個(gè)體48 h滴水損失和肌內(nèi)脂肪含量顯著高于其他基因型個(gè)體，而TT基因型個(gè)體胴體眼肌面積顯著小于其他基因型個(gè)體（P<0.05）。

2.4 顯著相關(guān)性狀表型值相關(guān)性分析

由于豬NARS2基因g.101284 C>T突變顯著影響多個(gè)胴體和肉質(zhì)性狀，因此將該位點(diǎn)顯著影響的皮厚、眼肌面積、滴水損失48 h、肌內(nèi)脂肪含量4個(gè)性狀的表型值相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果如表3所示。滴水損失48 h和肌內(nèi)脂肪含量分別與皮厚存在顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；滴水損失48 h和肌內(nèi)脂肪含量分別與眼肌面積存在極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；滴水損失48 h與肌內(nèi)脂肪含量存在極顯著正相關(guān)（P<0.01）。

3 小結(jié)與討論

氨基?；磻?yīng)主要由氨基酰化tRNA合成酶家族酶催化［9］，參與生物蛋白質(zhì)合成。NARS2最先在酵母中被發(fā)現(xiàn)［10］，屬于II類氨基?；?tRNA合成酶，是一種由細(xì)胞核編碼，但是可以到達(dá)線粒體發(fā)揮功能的線粒體型天冬酰胺酰tRNA合成酶［11］。研究發(fā)現(xiàn)NARS2基因突變可導(dǎo)致tRNA天冬氨酸水平降低，線粒體復(fù)合物I、III和IV的活性受損，并對(duì)成纖維細(xì)胞的耗氧率產(chǎn)生負(fù)面影響［12］。在人類研究中，發(fā)現(xiàn)該基因突變與嬰兒癲癇發(fā)作、生長發(fā)育遲緩、智力發(fā)育遲緩、肌張力低下和聽力障礙、腎臟疾病或肝臟異常等病例相關(guān)［6，12-14］。在動(dòng)物中，有關(guān)NARS2基因的研究較少，本研究探討了豬NARS2基因?qū)π誀畋硇偷挠绊?。發(fā)現(xiàn)豬NARS2基因在豬的各內(nèi)臟器官、肌肉、脂肪組織中廣泛表達(dá)，與其廣泛參與蛋白質(zhì)合成過程有關(guān)。在硒都黑豬群體中，豬NARS2基因外顯子區(qū)域并未找到關(guān)鍵突變位點(diǎn)，這也可能是因?yàn)橥怙@子突變對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)影響較大，會(huì)導(dǎo)致個(gè)體發(fā)育不正常，因而在群體選育中逐漸被自然淘汰。

內(nèi)含子序列占哺乳動(dòng)物基因組的24%，雖然其不編碼蛋白質(zhì)，但與編碼序列一起轉(zhuǎn)錄，共剪接形成成熟mRNA后，內(nèi)含子才與mRNA脫離［15］。內(nèi)含子作為pre-mRNA被剪接后的產(chǎn)物，具有復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能。例如，內(nèi)含子參與可變剪接的調(diào)控，可變剪接增加了蛋白質(zhì)的多樣性［16，17］；可通過提高轉(zhuǎn)錄速率、介導(dǎo)增強(qiáng)效應(yīng)、介導(dǎo)mRNA降解、提高mRNA翻譯速率等途徑促進(jìn)基因表達(dá)［15］。有研究證實(shí)內(nèi)含子變異會(huì)導(dǎo)致表型性狀發(fā)生變化，例如，人類研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子變異與苯丙酮尿癥、癌癥等疾病密切相關(guān)［18-20］；湖羊STAT5a基因第10內(nèi)含子變異影響泌乳性狀［21］；松遼黑豬KPNA7基因內(nèi)含子變異影響繁殖性狀［22］。

本研究在豬NASR2基因第9內(nèi)含子中鑒定到1個(gè)單堿基突變位點(diǎn)g.101284 C>T，其顯著影響皮厚、豬肉眼肌面積、滴水損失48 h和肌內(nèi)脂肪含量4個(gè)胴體和肉質(zhì)性狀。而這4個(gè)性狀中，除皮厚與眼肌面積性狀不存在顯著相關(guān)外，其他各性狀之間存在一定程度的相關(guān)性，有的是正相關(guān)，而有的是負(fù)相關(guān)。其中滴水損失48 h與肌內(nèi)脂肪含量性狀相關(guān)性最高（r2=0.882，P<0.01）。g.101284 C>T位點(diǎn)對(duì)不同性狀影響趨勢(shì)存在一定差異。例如，CC基因型個(gè)體皮厚極顯著低于TT基因型個(gè)體（P<0.01）；CC基因型個(gè)體滴水損失48 h和肌內(nèi)脂肪含量顯著高于其他基因型個(gè)體，而TT基因型個(gè)體胴體眼肌面積顯著小于其他基因型個(gè)體（P<0.05）。因此，該標(biāo)記在育種應(yīng)用中應(yīng)結(jié)合該育種群體的既定育種目標(biāo)及主選性狀合理利用。例如，若要選擇眼肌面積大且肌內(nèi)脂肪含量高的群體，應(yīng)予以保留攜帶CC基因型個(gè)體；若要選擇滴水損失48 h小的群體，應(yīng)淘汰攜帶CC基因型的個(gè)體。

綜上，本研究鑒定了豬NASR2基因第9內(nèi)含子中一個(gè)顯著影響豬胴體和肉質(zhì)性狀的新育種標(biāo)記，今后將對(duì)其具體作用機(jī)制開展更深入的研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 陳 輝.豬重要經(jīng)濟(jì)性狀選擇的遺傳進(jìn)展［J］.豬業(yè)科學(xué)， 2019， 36（1）：116-118.

［2］ 劉 航，侯黎明，王彬彬，等.顯性效應(yīng)對(duì)蘇淮豬肉色性狀遺傳評(píng)估和基因組選擇的影響［J］.畜牧與獸醫(yī)， 2021， 53（6）：1-6.

［3］ 廖印長， 張躍博， 何 俊.豬肉質(zhì)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī)， 2022， 54（8）：125-131.

［4］ 陳艷珍.豬肉品質(zhì)的評(píng)定及影響因素［J］.中國畜牧獸醫(yī)， 2012， 39（7）：155-158.

［5］ VAFAEE-SHAHI M，F(xiàn)ARHADI M，RAZMARA E，et al. Novel phenotype and genotype spectrum of NARS2 and literature review of previous mutations［J］. Irish journal of medical science，2022，191（4）：1877-1890.

［6］ ZHANG Y， ZHAO X， XU Y， et al. Study of novel NARS2 variants in patient of combined oxidative phosphorylation deficiency 24［J］. Translational pediatrics， 2022， 11： 448-457.

［7］ AL-SHARIF F， ALSADEQ H， ROZAN A， et al. Bilateral nonsyndromic sensorineural hearing loss caused by a NARS2 mutation［J］. Cureus， 2022， 14（11）： e31467.

［8］ TANAKA R， TAKEGUCHI R， KURODA M， et al. Novel NARS2 variant causing leigh syndrome with normal lactate levels［J］. Human genome variation， 2022， 9（1）：12.

［9］ WEI N， ZHAGN Q， YANG X L. Neurodegenerative charcot-marie-tooth disease as a case study to decipher novel functions of aminoacyl-tRNA synthetases［J］. Journal of biological chemistry， 2019， 294（14）：5321-5339.

［10］ LANDRIEU I， VANDENBOL M， HARTLEIN M， et al. Mitochondrial asparaginyl-tRNA synthetase is encoded by the yeast nuclear gene YCR24c［J］. European journal of biochemistry， 1997， 243： 268-273.

［11］ HU W， FANG H， PENG Y， et al. Clinical and genetic analyses of premature mitochondrial encephalopathy with epilepsia partialis continua caused by novel biallelic NARS2 mutations［J］. Frontiers in neuroscience， 2022， 16：1076183.

［12］ SIMON M， RICHARD E M， WANG X， et al. Mutations of human NARS2， encoding the mitochondrial asparaginyl-tRNA synthetase， cause nonsyndromic deafness and leigh syndrome［J］. PLoS genetics， 2015， 11（3）： e1005097.

［13］ SOFOU K， KOLLBERG G， HOLMSTROM M， et al. Whole exome sequencing reveals mutations in NARS2 and PARS2， encoding the mitochondrial asparaginyl-tRNA synthetase and prolyl-tRNA synthetase， in patients with alpers syndrome［J］. Molecular genetics & genomic medicine， 2015， 3：59-68.

［14］ MIZUGUCHI T，NAKASHIMA M，KATO M，et al. PARS2 and NARS2 mutations in infantile-onset neurodegenerative disorder［J］. Journal of human genetics， 2017， 62：525-529.

［15］ 曹艷娟.不同表達(dá)水平基因內(nèi)含子與mRNA序列的匹配特征［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2023.

［16］ OLSON S， BLANCHETTE M， PARK J， et al. A regulator of dscam mutually exclusive splicing fidelity ［J］. Nature structural & molecular biology， 2007， 14（12）： 1134-1140.

［17］ WANG Z， BURGE C B. Splicing regulation： From a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code［J］. RNA， 2008， 14（5）： 802-813.

［18］ 張 釧.甘肅地區(qū)遺傳代謝病的遺傳圖譜及PAH基因深部內(nèi)含子變異致病性研究［D］.北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院， 2022.

［19］ SCIARRILLO R， WOJTUSZKIEWICZ A， ASSARAF Y G， et al. The role of alternative splicing in cancer： From oncogenesis to drug resistance ［J］. Drug resistance updates， 2020， 53： 100728.

［20］ PADGETT R A. New connections between splicing and human disease［J］. Trends in genetics， 2012， 28（4）： 147-154.

［21］ 劉 玉， 張林林， 房 義，等.湖羊STAT5a基因第10內(nèi)含子多態(tài)性及其與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)， 2023，? ?50（9）：3680-3687.

［22］ 張方瑋， 張 琪， 張?jiān)迄i，等.松遼黑豬KPNA7基因多態(tài)性及其與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析［J］.中國畜牧雜志， 2023， 59（9）： 235-239.