趙北川 宣若恒 楊桂濤 凌耿強(qiáng) 夏之柏

膠質(zhì)瘤因其高死亡率給社會(huì)和家庭均帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)，識(shí)別更好的生物標(biāo)志物，建立更準(zhǔn)確的預(yù)后模型在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床診治中具有十分重要的意義。碳水化合物磺基轉(zhuǎn)移酶6（carbohydrate sulfotransferase 6，CHST6）作為一種催化硫酸基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因，通過(guò)參與子宮內(nèi)膜癌[1]、甲狀腺癌[2]、腎透明細(xì)胞癌[3]的糖酵解途徑，影響腫瘤的侵襲，其高表達(dá)與上述腫瘤較差的預(yù)后密切相關(guān)。同時(shí)在GRANT等[4]對(duì)437例胰腺癌患者和1922例正常人的全外顯子測(cè)序中發(fā)現(xiàn)，CHST6在胰腺癌患者中具有罕見(jiàn)的破壞性變異富集。目前，CHST6基因在正常組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤，以及不同神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床亞型中的表達(dá)差異水平及預(yù)后作用仍不清楚，本研究旨在分析CHST6基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的差異表達(dá)情況，以及與膠質(zhì)瘤的預(yù)后關(guān)系，并探尋膠質(zhì)瘤可能的新作用靶點(diǎn)，為進(jìn)一步探尋神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展機(jī)制及治療提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象各種神經(jīng)膠質(zhì)瘤類型的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)來(lái)自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov)和中國(guó)膠質(zhì)瘤基因組圖譜(Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)（http://www.cgga.org.cn/）325和693數(shù)據(jù)庫(kù)。正常樣本RNA表達(dá)數(shù)據(jù)則來(lái)自于基因型和基因表達(dá)量關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)（The Genotype-Tissue Expression，GTEx）中標(biāo)簽為“Brain”的1152例樣本。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本納入標(biāo)準(zhǔn)：①行顱腦腫瘤切除術(shù)；②病理診斷明確，世界衛(wèi)生組織（World health organization，WHO）分級(jí)為II～I(xiàn)V級(jí)的彌漫性膠質(zhì)瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①生存狀態(tài)及術(shù)后生存時(shí)間缺失或不完整；②生存期<60 d或隨訪<60 d；③異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變、1號(hào)染色體短臂和19號(hào)染色體長(zhǎng)臂（1p19q）共缺失和O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（methyl guanine methyl transferase，MGMT）甲基化狀態(tài)、性別、年齡或分級(jí)信息缺失或不明確。共獲得TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)501例樣本、CGGA_325和CGGA_693數(shù)據(jù)庫(kù)共703例樣本。所有樣本將轉(zhuǎn)錄本定量（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments，F(xiàn)PKM）格式的RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為TPM（Transcripts Per Million）格式，其中CGGA_325和CGGA_693 RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)合并時(shí)行批次校正處理。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用GraphPad Prism 9.4.1軟件行統(tǒng)計(jì)分析。用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對(duì)比非正態(tài)分布定量變量CHST6在正常樣本與膠質(zhì)瘤樣本間差異表達(dá)情況。

以TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中501例膠質(zhì)瘤樣本為訓(xùn)練集，CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中703例膠質(zhì)瘤樣本為外部驗(yàn)證集，以TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CHST6表達(dá)值中位數(shù)為界限，分為CHST6高表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)組與低表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)組，行Kaplan-Meier預(yù)后差異分析及外部驗(yàn)證。并分別做受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析，以ROC曲線下面積（area under curve，AUC）值>0.7表示其有較好的辨別能力，分別驗(yàn)證CHST6在TCGA與CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)膠質(zhì)瘤患者1年、3年、5年生存期預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

使用R語(yǔ)言survival軟件包，基于單因素和多因素比例風(fēng)險(xiǎn)（Cox）回歸分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CHST6表達(dá)量與性別、年齡、WHO腫瘤分級(jí)、IDH突變狀態(tài)、1p19q共缺失情況和MGMT甲基化狀態(tài)等不同臨床特征是否為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的獨(dú)立預(yù)后因素，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。基于結(jié)果構(gòu)建改進(jìn)預(yù)測(cè)模型的列線圖（Nomogram）和預(yù)測(cè)模型的校準(zhǔn)圖（Calibration），以C指數(shù)（C-Index）>0.75認(rèn)為該模型有較好預(yù)測(cè)效度。以納入CHST6表達(dá)量的預(yù)測(cè)模型為改進(jìn)模型，未納入CHST6表達(dá)量的預(yù)測(cè)模型為對(duì)照模型，以CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)為驗(yàn)證集，帶入TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)改進(jìn)模型與對(duì)照模型參數(shù)，Bootstrap法比較納入CHST6后，AUC變化情況。

1.3 功能與免疫差異分析使用R語(yǔ)言GSEA軟件包對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)CHST6高低表達(dá)組（中位值為界限）行差異基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）。通過(guò)R語(yǔ)言ClusteProfiler軟件包分別作為基因本體（Gene Ontology，GO）功能注釋分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，獲得差異富集的分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）和細(xì)胞成分（cellular component，CC），以及KEGG通路富集情況。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征本研究納入501例TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和703例CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)膠質(zhì)瘤樣本，臨床特征見(jiàn)表1，1152例GETx數(shù)據(jù)庫(kù)正常樣本。結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤樣本CHST6表達(dá)值[TCGA 4.27（2.37，8.73）,CGGA 6.61（3.37,18.17）]較正常樣本[GTEx 1.81（1.32，2.23）]明顯升高（TCGAvs.GTEx，Z=2.457，P<0.001；CGGAvs.GTEx,Z=4.800，P<0.001）。

表1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本臨床特征分組情況 例

2.2 預(yù)后分析Kaplan-Meier分析顯示，CHST6高表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)組（中位值4.277為界限）在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中總生存期均較低表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)組明顯下調(diào)（P<0.0001）。見(jiàn)圖1。ROC曲線分析顯示，CHST6在TCGA與CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)膠質(zhì)瘤患者1年、3年、5年生存期預(yù)測(cè)有較好的準(zhǔn)確性（TCGA 1年AUC 0.820，3年AUC 0.748，5年AUC 0.760；CGGA 1年AUC 0.724，3年AUC 0.769，5年AUC 0.760）。見(jiàn)圖2。單因素與多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，CHST6與年齡、WHO級(jí)別、IDH突變狀態(tài)、1p19q共缺失等臨床特征共同作為膠質(zhì)瘤患者的獨(dú)立預(yù)后因素。見(jiàn)表2。根據(jù)多因素Cox回歸分析結(jié)果，我們將上述獨(dú)立預(yù)后因素共同納入預(yù)后分析，構(gòu)建出改進(jìn)預(yù)測(cè)模型的列線圖（Nomogram）和預(yù)測(cè)模型的校準(zhǔn)圖（Calibration）（C-Index 0.885，95%CI0.862～0.908）。見(jiàn)圖3、4。納入CHST6表達(dá)量的改進(jìn)模型較未納入CHST6表達(dá)量的對(duì)照模型有著更高的效度（TCGA改進(jìn)模型1、3、5年AUC 0.900，0.886，0.850；對(duì)照模型AUC 0.874，0.865，0.822；改進(jìn)模型vs.對(duì)照模型d=0.036±0.004，SE=0.002，P=0.007；CGGA改進(jìn)模型1、3、5年AUC：0.719，0.758，0.752；對(duì)照模型AUC：0.663，0.666,0.668；改進(jìn)模型vs.對(duì)照模型d=0.087±0.004，SE=0.002，P=0.001）。見(jiàn)圖5。

圖1 TCGA與CGGA Kaplan-Meier分析曲線 mOS，中位總生存期(median overall survival)；HR，風(fēng)險(xiǎn)比率(hazard ratio)；95%CI，95%置信區(qū)間（95% confidence interval）

圖2 TCGA與CGGA ROC分析曲線 TCGA與CGGA ROC模型閾值=4.277，AUC>0.7認(rèn)為有較好的預(yù)測(cè)效度

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)樣本預(yù)測(cè)模型列線圖

圖4 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)樣本預(yù)測(cè)模型校準(zhǔn)圖 C-index，C指數(shù)；Observed OS，觀測(cè)生存期；Nomogram-predicted OS，預(yù)測(cè)生存期。C指數(shù)>0.75，表示有著較好的預(yù)測(cè)效度

表2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)樣本多因素Cox回歸分析結(jié)果

2.3 功能與免疫差異分析GSEA富集分析顯示，CHST6高表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)組GO主要富集于胞外結(jié)構(gòu)（圖6紅色標(biāo)記），如含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、外部封裝結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞粘附的正向調(diào)節(jié)（表3）；KEGG主要富集于PI3KAkt信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、黏著斑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、人乳頭瘤病毒感染（圖7紅色標(biāo)記，表4），此外還有癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、ECM-受體相互作用（ECM-receptor interaction）等通路（圖7紫色標(biāo)記）。

圖6 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)GSEA GO富集差異分析結(jié)果 MF，分子功能（molecular function）；BP，生物學(xué)過(guò)程（biological process）；CC，細(xì)胞成分（cellular component）

圖7 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)GSEA KEGG富集差異分析結(jié)果 注：Count，核心基因的數(shù)目，值越大，差異富集越顯著；GeneRatio，核心基因（Count）與該GO條目中包含表達(dá)數(shù)據(jù)集中的基因數(shù)目（setSize）的比值，值越大，差異富集越顯著；qValue，校準(zhǔn)后P值

表3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)GSEA GO差異富集分析結(jié)果

表4 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)GSEA KEGG差異富集分析結(jié)果

3 討論

CHST6編碼一種催化硫酸基轉(zhuǎn)移酶，相關(guān)研究認(rèn)為CHST6通過(guò)參與糖酵解途徑，與子宮內(nèi)膜癌[1]、甲狀腺癌[2]、腎透明細(xì)胞癌[3]的預(yù)后密切相關(guān)。LIU等[5]在對(duì)能量代謝基因的研究中發(fā)現(xiàn)，CHST6與低級(jí)別膠質(zhì)瘤的預(yù)后密切相關(guān)。本研究經(jīng)TCGA與CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)Kaplan-Meier分析和ROC曲線分析，證實(shí)CHST6對(duì)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。多因素Cox回歸分析提示，CHST6與年齡、WHO級(jí)別、IDH突變狀態(tài)和1p19q共缺失情況，共同作為膠質(zhì)瘤的獨(dú)立預(yù)后因素，并繪制生存預(yù)測(cè)列線圖，提示臨床可通過(guò)該模型圖，對(duì)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后進(jìn)行預(yù)判，從而指導(dǎo)臨床盡早展開(kāi)針對(duì)性治療。

糖酵解作為一種成熟的代謝途徑，在癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。其中異檸檬酸脫氫酶（IDH）作為參與糖酵解途徑的關(guān)鍵限速酶之一，其突變情況是膠質(zhì)瘤的重要臨床預(yù)后特征，相比于IDH野生型，IDH突變型膠質(zhì)瘤有著更低水平的糖酵解和更好的預(yù)后[6-7]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，腫瘤細(xì)胞主要通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解[7-11]。本研究的GSEA分析結(jié)果也顯示，CHST6高表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)組在PI3K-Akt信號(hào)通路有顯著的富集，這提示CHST6可能通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的糖酵解水平，并在臨床特征中表現(xiàn)為更少的IDH突變，從而影響膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。

在本研究的GSEA分析中，CHST6高表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)組還在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、黏著斑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、ECM-受體相互作用中顯著富集。在神經(jīng)活性配體-受體相互作用中，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，其中的GABRP與胰腺癌的趨化因子信號(hào)、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和腫瘤進(jìn)展有關(guān)[12]，小膠質(zhì)細(xì)胞和骨髓來(lái)源的髓系細(xì)胞分泌的CCL5，與NF1相關(guān)的低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGGs）生長(zhǎng)有關(guān)[13]。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）是腫瘤微環(huán)境中的一個(gè)高度活躍的部分，影響腫瘤細(xì)胞的行為和轉(zhuǎn)移能力，對(duì)腫瘤的診斷、靶向治療、預(yù)后有著重要意義[14-15]。其中，ECM可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞死亡和抗原的釋放、感染腫瘤抗原提呈、影響效應(yīng)T細(xì)胞啟動(dòng)和激活、調(diào)節(jié)T細(xì)胞的遷移，干擾T細(xì)胞識(shí)別和殺死癌細(xì)胞等免疫途徑，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)逃逸和腫瘤生長(zhǎng)[16]。黏著斑是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)粘附結(jié)構(gòu)，對(duì)于細(xì)胞的伸展，粘附，遷移和免疫應(yīng)答都有不可替代的作用，在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲性中具有重要作用[17-18]。以上GSEA分析表明，CHST6在通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖同時(shí)，還可能通過(guò)神經(jīng)活性配體的內(nèi)分泌途徑，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)；通過(guò)影響ECM和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)如黏著斑，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和免疫系統(tǒng)逃逸。

綜上所述，本研究揭示了CHST6的高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)，并制作出的風(fēng)險(xiǎn)因素預(yù)后列線圖。此外，本研究還對(duì)CHST6造成神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的可能通路進(jìn)行分析，表明CHST6可能作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)。但CHST6作用于糖酵解的調(diào)控機(jī)制、與膠質(zhì)瘤相關(guān)通路的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及腫瘤樣本中驗(yàn)證。