孫云龍,王喜甲,孟哲,高路

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科,河南 鄭州 450052)

糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥是目前糖尿病治療的主要臨床問(wèn)題[1]。糖尿病患者的冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)病率相比于正常人群增加2～4 倍,外周血管疾病的發(fā)病率增加10倍[2]。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是糖尿病患者發(fā)生心血管疾病的始動(dòng)機(jī)制。內(nèi)皮功能受損源于活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增加而導(dǎo)致一氧化氮 (nitric oxide,NO) 被大量清除,是血管疾病狀態(tài)的標(biāo)志[3]。內(nèi)皮功能障礙可引起內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)、血小板和凝血因子活化增強(qiáng)導(dǎo)致促凝狀態(tài),最終導(dǎo)致血管生長(zhǎng)和內(nèi)皮重塑缺陷,最終引起心肌缺血,出現(xiàn)急性心肌梗死[1]。高達(dá)75%的糖尿病患者死于血管疾病和內(nèi)皮功能障礙[4]。內(nèi)皮功能障礙貫穿于糖尿病疾病的整個(gè)周期,盡管部分患者血糖控制良好,但是高血糖損傷后血管功能障礙仍會(huì)進(jìn)展[5],因此深入了解高血糖引起內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制,對(duì)治療糖尿病的血管并發(fā)癥有重要意義。

含溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(Bromodomain 4,BRD4)是溴結(jié)構(gòu)域和末端外結(jié)構(gòu)域家族成員,可作為組蛋白乙?；嚢彼峄鶊F(tuán)的調(diào)節(jié)劑并調(diào)節(jié)表觀遺傳學(xué)[6]。目前已證實(shí)BRD4與多種癌癥有關(guān),如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺癌[7-8]。BRD4也與心血管疾病密切相關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn),心臟BRD4敲除小鼠表現(xiàn)出進(jìn)行性心功能不全和心室擴(kuò)張[9-10]。Sanders等[11]發(fā)現(xiàn)BRD4可以抑制與年齡相關(guān)的肺纖維化。BRD4促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移和增殖,通過(guò)調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,NRF2)介導(dǎo)的氧化還原代謝來(lái)調(diào)控小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展[12-13]。本研究旨在探討B(tài)RD4對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

以下試劑購(gòu)買(mǎi)于碧云天公司(上海):ROS試劑盒、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase,SOD2)檢試劑盒、CCK-8試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, Gpx)、丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒。以下試劑購(gòu)買(mǎi)于Gibco公司(美國(guó)):胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、血清。TUNEL染色試劑盒來(lái)自于美國(guó)Millipore公司。山羊抗兔IRdye@488 CW IgG購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司。ELISA試劑盒來(lái)自于BioLegend公司(美國(guó))。NRF2抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)自于美國(guó)羅氏公司。

1.2 細(xì)胞分組和處理

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)購(gòu)買(mǎi)于上海中科院細(xì)胞典藏中心,HUVEC采用含有10 g·L-1的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),采用胰蛋白酶消化細(xì)胞用于傳代,將細(xì)胞隨機(jī)分為4組。(1)對(duì)照組:細(xì)胞在正常葡萄糖(5.5 mmol·L-1)條件下培養(yǎng),轉(zhuǎn)染空載體ScRNA同時(shí)給予27.5 mmol·L-1的甘露醇處理48 h。(2)高糖組(HG組):細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體ScRNA12 h,同時(shí)給予高糖(33.5 mmol·L-1)刺激48 h。(3)BRD4 siRNA組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染BRD4 siRNA 12 h,給予27.5 mmol·L-1的甘露醇處理48 h。(4)BRD4 siRNA+HG組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染BRD4 siRNA,孵育12 h,同時(shí)給予高糖(33.5 mmol·L-1)刺激48 h 。

1.3 HUVEC中促炎因子水平檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞中的炎癥因子水平,細(xì)胞分組處理后采用PBS清洗3次,每孔加入50 μL蛋白裂解液,在冰上孵育15 min,采用細(xì)胞刮刀收集裂解的細(xì)胞液,采用1 200 r·min-1離心30 min,采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-1,IL-6)的水平。

1.4 HUVEC中氧化應(yīng)激因子水平檢測(cè)

ROS檢側(cè)采用熒光探針DCFH-DA法。將分組處理后的細(xì)胞采用DMEM清洗3次后每孔加入1 μL DCFH-DA熒光探針,孵育20 min,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的熒光強(qiáng)度。分組處理的細(xì)胞每孔加入50 μL蛋白裂解液,在冰上孵育15 min,采用細(xì)胞刮刀收集裂解的細(xì)胞液,分別采用試劑盒在酶標(biāo)儀下檢測(cè)檢測(cè)MDA、SOD2和GPx的活性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 HUVEC活性檢測(cè)

采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。將分組處理的細(xì)胞用PBS清洗3次,每孔加入10 μL CCK-8溶液,室溫孵育30 min,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每組細(xì)胞在450 nm處的光密度值。

1.6 HUVEC凋亡檢測(cè)

采用Tunel染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。分組處理的細(xì)胞采用40 g·L-1的多聚甲醛固定后采用Triton-X-100通透打孔,細(xì)胞加入TdT酶工作液孵育1 h,采用Anti-Digoxigenin 熒光工作液孵育30 min后采用DAPI進(jìn)行細(xì)胞和染色和封片,采用熒光顯微鏡拍照。

1.7 NRF2免疫熒光染色

分組處理的細(xì)胞采用甲醛固定后采用Triton-X-100通透打孔,采用8 g·L-1的羊血清進(jìn)行封閉1 h,采用抗NRF2一抗(1∶100稀釋)孵育過(guò)夜,使用Alexa-488標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育1 h,采用DAPI染色細(xì)胞核后封片,采用熒光顯微鏡拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BRD4沉默對(duì)高糖刺激下HUVEC炎癥因子水平的影響

對(duì)照組和BRD4 siRNA組細(xì)胞促炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HG組及BRD4 siRNA+HG組細(xì)胞促炎癥因子水平高于對(duì)照組(P<0.05),且BRD4 siRNA+HG組細(xì)胞促炎癥因子水平低于HG組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組細(xì)胞中炎癥因子水平的比較

2.2 BRD4沉默對(duì)高糖刺激下HUVEC氧化應(yīng)激的影響

對(duì)照組和BRD4 siRNA組ROS和MDA水平、抗氧化酶SOD2和Gpx活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HG組及BRD4 siRNA+HG組細(xì)胞ROS和MDA水平高于對(duì)照組,抗氧化酶SOD2和Gpx水平低于對(duì)照組(P<0.05);且BRD4 siRNA+HG組細(xì)胞ROS和MDA水平低于HG組(P<0.05),SOD2和Gpx水平高于HG組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 BRD4沉默減輕HG誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)

2.3 BRD4沉默對(duì)高糖刺激下細(xì)胞活性及凋亡的影響

對(duì)照組和BRD4 siRNA組細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HG組及BRD4 siRNA+HG組細(xì)胞活性低于對(duì)照組(P<0.05);與HG組相比,BRD4 siRNA+HG組細(xì)胞活性升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。Tunel染色結(jié)果顯示:對(duì)照組和BRD4 siRNA組細(xì)胞凋亡數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HG組及BRD4 siRNA+HG組細(xì)胞凋亡數(shù)量多于對(duì)照組(P<0.05);與HG組相比,BRD4 siRNA+HG組細(xì)胞凋亡數(shù)量減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表3。

A圖為對(duì)照組;B圖為HG組;C圖為BRD4 siRNA組;D圖為BRD4 siRNA+HG組;綠色為T(mén)unel陽(yáng)性;藍(lán)色為細(xì)胞核;箭頭所指為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。

表3 細(xì)胞增殖、凋亡及NRF2核轉(zhuǎn)位水平比較

2.4 BRD4沉默對(duì)高糖刺激下細(xì)胞NO水平的影響

對(duì)照組和BRD4 siRNA組NO水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HG組及BRD4 siRNA+HG組細(xì)胞NO水平低于對(duì)照組(P<0.05);與HG組相比,BRD4 siRNA+HG組細(xì)胞NO水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.5 BRD4沉默對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NRF2表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位的影響

對(duì)照組和BRD4 siRNA組NRF2表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HG組及BRD4 siRNA+HG組NRF2表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位水平低于對(duì)照組(P<0.05);與HG組相比,BRD4 siRNA+HG組細(xì)胞NRF2表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位水平升高。見(jiàn)圖2和表3。

A圖為對(duì)照組;B圖為HG組;C圖為BRD4 siRNA組;D圖為BRD4 siRNA+HG組;綠色為NRF2陽(yáng)性;藍(lán)色為細(xì)胞核;箭頭所指為NRF2核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性細(xì)胞。

3 討論

氧化應(yīng)激為ROS的增加和/或抗氧化防御機(jī)制的減少,導(dǎo)致細(xì)胞損傷,在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用,如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓以及與糖尿病相關(guān)的大血管和微血管疾病。1型和2型糖尿病中ROS來(lái)源包括葡萄糖的自動(dòng)氧化、通過(guò)多元醇途徑增加底物通量和降低NADPH水平、晚期糖基化終產(chǎn)物的形成以及與細(xì)胞靶標(biāo)的相互作用,這可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激[14]。BRD4可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng),抑制BRD4可以促進(jìn)老年小鼠肺纖維化的消退[11]。本研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞中沉默BRD4可以減少高糖刺激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平,降低ROS和脂代謝中間產(chǎn)物MDA的水平,增加抗氧化酶SOD2和Gpx的活性,從而減少內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,減輕內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

NO是內(nèi)皮細(xì)胞釋放的因子,可舒張內(nèi)皮細(xì)胞,減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙時(shí),生成的NO減少,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷,形成惡性循環(huán)。NO在控制血管穩(wěn)態(tài)中起核心作用[15],不僅調(diào)節(jié)血管舒縮張力,還可抑制單核細(xì)胞趨化肽-1的表達(dá),降低血管細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá),阻止脂質(zhì)氧化的傳播,抑制血管平滑肌增殖,降低血小板聚集。在糖尿病中,胰島素抵抗、高血糖均導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生減少[16]。超氧化物還可以與NO結(jié)合形成過(guò)氧亞硝酸根陰離子,加重內(nèi)皮細(xì)胞的損害[16]。本研究發(fā)現(xiàn)BRD4沉默可以升高內(nèi)皮細(xì)胞中NO水平,降低ROS的水平,從而減少內(nèi)皮氧化損傷,發(fā)揮NO對(duì)內(nèi)皮的保護(hù)作用。

NRF2是一種轉(zhuǎn)錄因子,可協(xié)調(diào)大量細(xì)胞保護(hù)基因的基礎(chǔ)激活和應(yīng)激誘導(dǎo)的激活[17]。NRF2調(diào)節(jié)谷胱甘肽GSH和硫氧還蛋白抗氧化系統(tǒng)成分的轉(zhuǎn)錄,以及參與Ⅰ期和Ⅱ期外源性和內(nèi)源性產(chǎn)物解毒、NADPH再生和血紅素代謝的酶[17],調(diào)控氧化應(yīng)激的細(xì)胞防御機(jī)制關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄。NRF2還參與細(xì)胞其他過(guò)程,如自噬、中間代謝、干細(xì)胞靜止和未折疊蛋白反應(yīng)[18]。以往研究發(fā)現(xiàn)BRD4在心臟中調(diào)控線粒體相關(guān)蛋白[9]。本研究發(fā)現(xiàn)BRD4可以抑制NRF2的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位,BRD4沉默能使高糖刺激下的NRF2核轉(zhuǎn)位細(xì)胞占比增加,在內(nèi)皮細(xì)胞中可能通過(guò)對(duì)NRF2的抑制作用發(fā)揮促進(jìn)氧化應(yīng)激損傷作用。

4 結(jié)論

在高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷中,BRD4促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激,加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。內(nèi)皮細(xì)胞中沉默BRD4可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞在高糖刺激下的損傷。因此,針對(duì)BRD4的小干擾RNA可能成為治療糖尿病血管并發(fā)癥的手段。