余光書(shū)　林焱斌　王松清　吳春玲

【摘 要】目的：觀察補(bǔ)骨顆粒對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡及對(duì)Trx2/ASK1/Caspase-3表達(dá)的影響，從而探討補(bǔ)骨顆粒對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡影響機(jī)制，為進(jìn)一步研究補(bǔ)骨顆粒防治骨關(guān)節(jié)炎奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：將20只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，補(bǔ)骨顆粒低、中、高劑量組，每組5只。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，空白對(duì)照組給予蒸餾水2 mL·kg-1灌胃，補(bǔ)骨顆粒低、中、高劑量組給予補(bǔ)骨顆粒1.54 g·kg-1、3.08 g·kg-1、6.16 g·kg-1灌胃。干預(yù)14 d后，抽取血液經(jīng)離心獲得血清。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中Trx2、ASK1、Caspase-3表達(dá)量，采用MTT法檢測(cè)血清干預(yù)后的細(xì)胞增殖活性，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血清干預(yù)后的軟骨細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，補(bǔ)骨顆粒低、中、高劑量組Trx2、ASK1與Caspase-3含量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與補(bǔ)骨顆粒中劑量組比較，補(bǔ)骨顆粒低劑量組和高劑量組Trx2與ASK1含量明顯增多，補(bǔ)骨顆粒低劑量組Caspase-3含量明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與空白對(duì)照組比較，補(bǔ)骨顆粒低、中、高劑量組OD值明顯升高（P < 0.05）；補(bǔ)骨顆粒低、中、高劑量組組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不加入硝普鈉時(shí)（對(duì)照組1）軟骨細(xì)胞的凋亡率最低為4.25%，加入硝普鈉后（空白對(duì)照組1）軟骨細(xì)胞的凋亡率變?yōu)?6.86%，補(bǔ)骨顆粒低劑量組1軟骨細(xì)胞的凋亡率（30.15%）高于補(bǔ)骨顆粒中劑量組1（27.77%）和高劑量組1（27.41%）。結(jié)論：補(bǔ)骨顆粒將會(huì)調(diào)控Trx2表達(dá)，并且不同劑量補(bǔ)骨顆粒將會(huì)通過(guò)Trx2-ASK1解離度調(diào)控Caspase-3活化程度而影響軟骨細(xì)胞的凋亡，這將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)補(bǔ)骨顆粒對(duì)骨關(guān)節(jié)炎防治過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；補(bǔ)骨顆粒；Trx2/ASK1信號(hào)通路；軟骨細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；大鼠

Exploring the Regulatory Mechanism of Bugu Keli（補(bǔ)骨顆粒）on Chondrocyte Apoptosis Based on the Trx2/ASK1 Signaling Pathway

YU Guang-shu，LIN Yan-bin，WANG Song-qing，WU Chun-ling

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Bugu Keli（補(bǔ)骨顆粒）on chondrocyte apoptosis and Trx2/ASK1/Caspase-3 expression，in order to explore its mechanism on chondrocyte apoptosis and lay an experimental foundation for further research on the prevention and treatment of osteoarthritis by Bugu Keli.Methods：Twenty SD rats were randomly divided into a blank control group and low，medium，and high dose groups of Bugu Keli，with 5 rats in each group.Adaptive feeding for 7 days，the blank control group was given?2 mL·kg-1 of distilled water by gavage，while the low，medium，and high dose groups were given 1.54 g·kg-1，

3.08 g·kg-1，6.16 g·kg-1 of Bugu Keli by gavage.After 14 days of intervention，blood was extracted and centrifuged to obtain serum.The expression levels of Trx2，ASK1，and Caspase-3 in serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Cell proliferation activity was detected by MTT method after serum intervention，and chondrocyte apoptosis rate was detected by flow cytometry after serum intervention.Results：Compared with the blank control group，the contents of Trx2，ASK1，and Caspase-3 in the low，medium，and high dose groups were significantly reduced，with statistical significance（P < 0.05）;compared with the medium dose group，the low dose and high dose group showed a significant increase in Trx2 and ASK1 content，while the low dose group of Bugu Granules showed a significant increase in Caspase-3 content，with statistical significance（P < 0.05）.Compared with the blank control group，the OD values of the low，medium，and high dose groups were significantly increased（P < 0.05）;there was no statistically significant difference between the low，medium，and high dose groups（P > 0.05）.Flow cytometry detection showed that the lowest apoptosis rate of chondrocytes was 4.25% in control group 1 without the addition of sodium nitroprusside.After the addition of sodium nitroprusside，the apoptosis rate of chondrocytes in blank control group 1 increased to 46.86%.The apoptosis rate of chondrocytes in the low dose group 1（30.15%）was higher than that in the medium dose group 1（27.77%）and the high dose group 1（27.41%）.Conclusion：Bugu Keli will regulate the expression of Trx2，and different doses of it will affect the apoptosis of chondrocytes by regulating the degree of Caspase-3 activation through the dissociation of?Trx2-ASK1.This will help to further understand the prevention and treatment process of Bugu Keli on osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis;Bugu Keli（補(bǔ)骨顆粒）;Trx2/ASK1 signaling pathway;chondrocytes;cell?apoptosis;rats

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨退行性變?yōu)橹饕±硖卣鞯穆怨顷P(guān)節(jié)疾病，其發(fā)生、發(fā)展是軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及軟骨下骨三者降解和合成失衡的結(jié)果。目前研究表明，軟骨細(xì)胞凋亡是骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，阻止或延緩軟骨細(xì)胞凋亡是防治OA的一條有效途徑［1-2］。然而，軟骨細(xì)胞凋亡受外源性通路和內(nèi)源性通路相互影響，具體作用機(jī)制復(fù)雜，但在激發(fā)軟骨細(xì)胞凋亡中的級(jí)聯(lián)反應(yīng)往往相輔相成，其中經(jīng)過(guò)細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生是目前研究的方向，尤其通過(guò)中藥對(duì)機(jī)體功能調(diào)控后所產(chǎn)生的有效成分調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡是目前研究的熱點(diǎn)［3］。基于既往研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨顆?？梢酝ㄟ^(guò)硫氧還蛋白2/凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（Trx2/ASK1）信號(hào)通路抑制軟骨細(xì)胞凋亡［4-5］，擬進(jìn)一步從補(bǔ)骨顆粒與軟骨細(xì)胞凋亡的量效關(guān)系探討補(bǔ)骨顆粒對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制，這將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)補(bǔ)骨顆粒對(duì)OA防治過(guò)程。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠20只，體質(zhì)量（160±20）g，由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度70%左右，自由進(jìn)食，自由飲水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（湘）2017-0002，用于制備血清；大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞由武漢普諾賽生命科技有限公司提供（批號(hào)CP-R092），通過(guò)Ⅱ型膠原蛋白行免疫熒光鑒定，紅色熒光為Collagen Ⅱ陽(yáng)性［5］。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)骨顆粒（藥物組成：骨碎補(bǔ)20 g、鹿銜草12 g、淫羊藿12 g、黨參15 g、茯苓20 g、三七3 g、川牛膝9 g、當(dāng)歸9 g、川芎6 g、女貞子15 g、枸杞子9 g、生地黃15 g、甘草3 g），由福州市第二醫(yī)院藥劑科加工制備，每克顆粒藥含原生藥9.8 g，使用時(shí)用蒸餾水加熱溶解成1 g·mL-1的水溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 MTT試劑盒（Sigma公司，批號(hào)M2128）；凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)KGA1030）；Trx2試劑盒、ASK1試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)bs-4256R、bs-3029R）；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）（Proteintech公司，批號(hào)ab44976）；硝普鈉（索萊寶科技有限公司，批號(hào)HY-A0119）；DMEM培養(yǎng)基（Sigma公司，批號(hào)D5796）；胰酶消化液（Abiowell公司，批號(hào)AWC0232）；胎牛血清（Gibco公司，批號(hào)10099141）；雙抗（青鏈霉素，碧云天生物科技有限公司，批號(hào)SV30010）；PBS（Abiowell公司，批號(hào)AWC0409）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)（北京亞泰隆儀器技術(shù)有限公司，型號(hào)YT-CJ-2NB）；直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海三騰儀器有限公司，型號(hào)DH-160I）；倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司，型號(hào)DSZ2000X）；低速離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司，型號(hào)SL02）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)H1650R）；多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)MB-530）；流式細(xì)胞儀（Beckman，型號(hào)A00-1-1102）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號(hào)DHP-500）；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)PW-812）。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組與血清制備 將20只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組，補(bǔ)骨顆粒低、中、高劑量組，每組5只。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，空白對(duì)照組給予蒸餾水2 mL·kg-1灌胃，補(bǔ)骨顆粒低、中、高劑量組給予補(bǔ)骨顆粒1.54 g·kg-1、3.08 g·kg-1、

6.16 g·kg-1灌胃（中劑量組濃度依據(jù)臨床常用量按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積折算的等效劑量比值換算［6］，低劑量組濃度為中劑量組1/2，高劑量組濃度為中劑量組2倍），每日1次，連續(xù)14 d。于最后一次灌胃后2 h腹主動(dòng)脈無(wú)菌取血，常溫下靜置60 min，離心機(jī)以2000 r·min-1離心10 min，離心半徑為21 cm，后取同組血清混合，再離心1次，56 ℃滅活30 min，過(guò)濾除菌后用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清中Trx2、ASK1、Caspase-3含量 取上述4組適量血清按照ELISA檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)：將50 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋5倍的蛋白質(zhì)樣品加入每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品孔中；接著加入100 μL酶標(biāo)試劑，用封板膜封板后于37 ℃孵育60 min。然后，小心揭掉封板膜，棄去液體后用吸水紙拍干，每孔加入洗滌液350 μL，浸泡1 min，洗板；重復(fù)5次后，每孔加入50 μL底物A和B，37 ℃避光孵育15 min。然后，在每個(gè)孔中加入50 μL終止溶液，并根據(jù)Trx2、ASK1、Caspase-3 ELISA說(shuō)明書(shū)，在450 nm處依次測(cè)量每個(gè)孔的光密度（OD）值。每組樣品平行重復(fù)5次。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸曲線，根據(jù)曲線方程計(jì)算各樣品的濃度值。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清（FBS）加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的雙抗DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第3代SD大鼠軟骨細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，以5×103個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h貼壁。加入不含小牛血清的單純DMEM培養(yǎng)基，饑餓24 h，使細(xì)胞同步化于G0或G1期。取上述4組血清分別稀釋為體積分?jǐn)?shù)為15%［3］，然后再分別進(jìn)一步培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，各組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后更換完全培養(yǎng)基100 μL，每孔加入5 mg·mL-1 MTT（每孔10 μL），37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。吸去含MTT和舊的培養(yǎng)基溶液，加入二甲基亞砜每孔150 μL，充分混勻，于Bio-Tek酶標(biāo)儀分析490 nm處OD值，取均值并繪制生長(zhǎng)曲線。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡率 取第3代SD大鼠軟骨細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，以1×105個(gè)細(xì)胞種植于24孔板，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h貼壁后加入不含小牛血清的單純DMEM培養(yǎng)基，饑餓24 h，使軟骨細(xì)胞同步化于G0或G1期。然后，在培養(yǎng)體系中分別加入2 mol·L-1硝普鈉及體積分?jǐn)?shù)為15%的血清（分組：不加硝普鈉為對(duì)照組1，加入硝普鈉及空白對(duì)照組血清為空白對(duì)照組1，加入硝普鈉及低劑量組血清為補(bǔ)骨顆粒低劑量組1，加入硝普鈉及中劑量組血清為補(bǔ)骨顆粒中劑量組1，加入硝普鈉及高劑量組血清為補(bǔ)骨顆粒高劑量組1）。將上述分組的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)24 h，然后用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集軟骨細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次，離心機(jī)以2000 r·min-1離心10 min，離心半徑為21 cm，收集約3.2×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μL的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞。然后，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-APC混勻后加入5 μL碘化丙啶，混勻，室溫、避光反應(yīng)10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡，在488 nm處分析細(xì)胞凋亡。膜聯(lián)蛋白V-FITC（激發(fā)波長(zhǎng)Ex = 488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em = 530 nm）的綠色熒光通過(guò)FITC通道（FL1）檢測(cè)；PI紅色熒光（流式Ex = 488 nm，Em≥ 630 nm）通過(guò)FL2檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料符合正態(tài)分布以表示，多組間的成對(duì)比較（F檢驗(yàn)）采用單因素方差分析，方差齊時(shí)使用LSD法，方差不齊時(shí)使用Tamhane's T2；

不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)；采用Kruskal-Wallis方法進(jìn)行多組間比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠血清中Trx2、ASK1和Caspase-3含量比較 與空白對(duì)照組比較，補(bǔ)骨顆粒低、中、高劑量組Trx2、ASK1和Caspase-3含量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與補(bǔ)骨顆粒中劑量組比較，補(bǔ)骨顆粒低劑量組和高劑量組Trx2、ASK1含量明顯增多，低劑量組Caspase-3含量明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

3.2 各組大鼠軟骨細(xì)胞活性比較 與空白對(duì)照組比較，補(bǔ)骨顆粒低、中、高劑量組軟骨細(xì)胞OD值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；補(bǔ)骨顆粒各劑量組組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

3.3 各組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組1軟骨細(xì)胞凋亡率最低為4.25%；空白對(duì)照組1軟骨細(xì)胞凋亡率為46.86%；補(bǔ)骨顆粒低劑量組1軟骨細(xì)胞凋亡率為30.15%，高于補(bǔ)骨顆粒中劑量組1的27.77%和高劑量組1的27.41%。見(jiàn)圖1。

4 討 論

軟骨細(xì)胞的大量凋亡是導(dǎo)致OA發(fā)展的重要因素，抑制軟骨細(xì)胞凋亡是防治OA的重要方法之一；但是，不同劑量的藥物對(duì)體內(nèi)經(jīng)吸收代謝后出現(xiàn)的新成分和產(chǎn)物存在一定的差異，這可能對(duì)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或者無(wú)法起到有效作用［7］。因此，本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究補(bǔ)骨顆粒含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞及Trx2/ASK1信號(hào)通路影響的量效關(guān)系［4，8］。通過(guò)不同劑量的補(bǔ)骨顆粒干預(yù)大鼠獲得的血清培養(yǎng)軟骨細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨顆粒中劑量組與補(bǔ)骨顆粒高劑量組的軟骨細(xì)胞活性更強(qiáng)且抑制軟骨細(xì)胞凋亡率更好，說(shuō)明過(guò)低劑量的補(bǔ)骨顆粒對(duì)軟骨細(xì)胞的作用較弱，在使用補(bǔ)骨顆粒治療OA時(shí)需要注意足夠的劑量及合適的療程。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，低劑量的補(bǔ)骨顆粒對(duì)Trx2/ASK1/Caspase- 3蛋白表達(dá)的影響明顯低于中劑量組及高劑量組，說(shuō)明足夠劑量的補(bǔ)骨顆粒將促進(jìn)Trx2/ASK1信號(hào)通路發(fā)揮其對(duì)軟骨細(xì)胞的影響。但是，文中未涉及足夠的陽(yáng)性對(duì)照，這使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析存在一定的不足。

軟骨細(xì)胞的凋亡通路主要有外源性通路和內(nèi)源性通路兩種，其中外源性通路主要為死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路，內(nèi)源性通路主要為線粒體介導(dǎo)的凋亡通路。既往研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨顆粒可以通過(guò)影響線粒體的活性氧含量，從而通過(guò)Trx2/ASK1信號(hào)通路引起Caspase-3瀑布式活化和軟骨細(xì)胞凋亡［4-5］。

因此，認(rèn)為補(bǔ)骨顆?？梢酝ㄟ^(guò)Trx2/ASK1信號(hào)通路調(diào)控軟骨細(xì)胞的凋亡。為了進(jìn)一步研究補(bǔ)骨顆粒對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡影響的有效含量，本研究采用不同劑量的補(bǔ)骨顆粒對(duì)大鼠血清中Trx2/ASK1/Caspase-3表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨顆?？梢砸种芓rx2/ASK1/Caspase-3表達(dá)，但是補(bǔ)骨顆粒中劑量對(duì)Trx2和ASK1表達(dá)的抑制作用更強(qiáng)，而補(bǔ)骨顆粒中劑量與高劑量對(duì)Caspase-3的表達(dá)無(wú)明顯差異，結(jié)合補(bǔ)骨顆粒對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響，認(rèn)為中等劑量的補(bǔ)骨顆粒即可通過(guò)Trx2/ASK1/Caspase-3相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制軟骨細(xì)胞凋亡，過(guò)高劑量的補(bǔ)骨顆粒在一定程度上影響線粒體內(nèi)Trx2/ASK1表達(dá)的活性，但這仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。另外，本研究中只使用了ELISA方法檢測(cè)Trx2/ASK1/Caspase-3表達(dá)量，沒(méi)有進(jìn)行Western印跡法定性觀察，這也使實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的不足。

Trx2是線粒體內(nèi)膜蛋白中清除活性氧簇的主要蛋白，所以Trx2在維持細(xì)胞存活、降低氧化應(yīng)激以及調(diào)節(jié)線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用［9-10］。在正常情況下，Trx2與ASK1相結(jié)合并且抑制其活性；在氧化應(yīng)激情況下，ASK1將從Trx2-ASK1復(fù)合體中釋放，并且激活凋亡前因子Caspase-3而觸發(fā)凋亡通路［11］。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨顆粒能夠抑制Trx2-ASK1復(fù)合物中Trx2的解離，進(jìn)而起到抑制Caspase-3所誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，并且在中劑量與高劑量補(bǔ)骨顆粒干預(yù)下效果更明顯。因此，認(rèn)為一定劑量補(bǔ)骨顆?？赏ㄟ^(guò)Trx2信號(hào)通路抑制軟骨細(xì)胞凋亡。另外，今后還可以應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶定量聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)Trx2/ASK1/Caspase-3基因表達(dá)情況探討補(bǔ)骨顆粒的作用，這將更有利于探討補(bǔ)骨顆粒是否通過(guò)調(diào)控線粒體影響軟骨細(xì)胞的凋亡。

OA屬中醫(yī)學(xué)“痿證”“痹證”“骨痹”范疇，其病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，其中肝腎虧損是致病的內(nèi)在因素，風(fēng)寒濕邪外襲是外在因素，經(jīng)絡(luò)氣血阻滯則是痹證的主要病機(jī)，這與西醫(yī)學(xué)OA的病理變化是相通的。早期OA主要是關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而出現(xiàn)軟骨細(xì)胞凋亡、關(guān)節(jié)軟骨破壞，關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)是標(biāo)痹的微觀表現(xiàn)，軟骨細(xì)胞凋亡則是本痿的微觀表現(xiàn)，而該過(guò)程受到多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路的調(diào)控?；诩韧R床上補(bǔ)骨顆粒治療OA具有良好效果［9］，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨顆粒可通過(guò)Trx2信號(hào)通路抑制軟骨細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步了解OA的發(fā)病機(jī)制提供思路，為尋找補(bǔ)腎活血方藥對(duì)OA作用靶點(diǎn)提供依據(jù)。

補(bǔ)骨顆粒由骨碎補(bǔ)、鹿銜草、淫羊藿、黨參、茯苓、三七、川牛膝、當(dāng)歸、川芎、女貞子、枸杞子、生地黃等藥物組成。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，骨碎補(bǔ)、淫羊藿、鹿銜草等補(bǔ)益肝腎中藥可以調(diào)控蛋白質(zhì)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖［12-13］。黨參、茯苓等補(bǔ)氣健脾中藥可以提高抗氧化酶的活性，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力［14］。三七、當(dāng)歸、川牛膝等活血藥物可以通過(guò)調(diào)控線粒體信號(hào)通路控制細(xì)胞凋亡［15-16］。所以，補(bǔ)骨顆粒具有促進(jìn)細(xì)胞增殖與抑制細(xì)胞凋亡的功效。結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的補(bǔ)骨顆粒能夠抑制軟骨細(xì)胞凋亡，補(bǔ)骨顆粒將會(huì)通過(guò)Trx2表達(dá)以及Trx2-ASK1解離度調(diào)控Caspase-3活化程度而影響軟骨細(xì)胞的凋亡，這將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)補(bǔ)骨顆粒對(duì)OA的防治過(guò)程。

參考文獻(xiàn)

［1］ WANG BEN，SHAO ZHENXUAN，GU MINGBAO，et al.

Hydrogen sulfide protects against IL-1β-induced inflammation and mitochondrial dysfunction-related apoptosis in chondrocytes and ameliorates osteoarth-ritis［J］.J Cell Physiol，2021，236（6）：4369-4386.

［2］ 王亮，張虎林，汪小敏，等.中藥干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞自噬的研究進(jìn)展［J］.風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2023，12（3）：71-75.

［3］ 謝新宇，梅陽(yáng)陽(yáng)，付長(zhǎng)龍，等.烏頭湯對(duì)脂多糖誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響［J］.風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2020，9（3）：1-5，11.

［4］ 余光書(shū)，林焱斌，熊?chē)?guó)勝，等.補(bǔ)骨顆粒含藥血清對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞凋亡及Trx2信號(hào)通路的影響［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2019，25（6）：753-757.

［5］ YU GUANG-SHU，LIN YAN-BIN，XU HONG-BIN，et al.Effect of Bugu Granules in a drug-containing serum on chondrocyte apoptosis and the Trx2 signaling path-way［J］.Z Rheumatol，2020，79（3）：304-311.

［6］ 賁長(zhǎng)恩.醫(yī)學(xué)科研思路方法與程序［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：162.

［7］ 張靈娜，林兵，宋洪濤.中藥血清藥理學(xué)、血清藥物化學(xué)的研究概況及展望［J］.中草藥，2015，46（17）：2662-2666.

［8］ 余光書(shū)，樂(lè)立盛，卓杰，等.補(bǔ)骨顆粒治療骨關(guān)節(jié)炎慢性疼痛的機(jī)制研究［J］.風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2019，8（3）：33-37.

［9］ CHEN CHAOFEI，CHEN HAIXUAN，ZHOU HUANJIAO JENNY，et al.Mechanistic role of thioredoxin 2 in heart failure［J］.Adv Exp Med Biol，2017，982（1）：265-276.

［10］ SCALCON VALERIA，BINDOLI ALBERTO，RIGOBELLO MARIA PIA，et al.Significance of the mitochondrial thioredoxin reductase in cancer cells：an update on role，targets and inhibitors［J］.Free Radic Biol Med，2018，127（1）：62-79.

［11］ YAN JD，XU J，F(xiàn)EI Y，et al.TrxR2 deficiencies promote chondrogenic differentiation and induce apoptosis of chondrocytes through mitochondrial reactive oxygen species［J］.Exp Cell Res，2016，344（1）：67-75.

［12］ LI FENGBO，SUN XIAOLEI，MA JIANXIONG，et al.Naringin prevents ovariectomy-induced osteoporosis and promotes osteoclasts apoptosis through the mitochondria-mediated apoptosis pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，452（3）：629-635.

［13］ PAN LIANHONG，ZHANG YONGHUI，CHEN NA，et al.Icariin regulates cellular functions and gene expression of osteoarthritis patient-derived human fibroblast-like synoviocytes［J］.Int J Mol Sci，2017，18（12）：2656-2666.

［14］ ZHENG YS，WU ZS，NI HB，et al.Codonopsis pilosula polysaccharide attenuates cecal ligation and puncture sepsis via circuiting regulatory T cells in mice［J］.Shock，2014，41（3）：250-255.

［15］ ZHOU LINGLING，ZHOU CONG，F(xiàn)ENG ZHE，et al.

Triptolide-induced hepatotoxicity can be alleviated when combined with Panax notoginseng saponins and Catapol［J］.J Ethnopharmacol，2018，214（1）：232-239.

［16］ ZHUANG CHAO，XU NAN-WEI，GAO GONG-MING，et al.Polysaccharide from Angelica sinensis protects chondrocytes from H2O2-induced apoptosis through its antioxidant effects in vitro［J］.Int J Biol Macromol，2016，87（1）：322-328.

收稿日期：2023-07-11；修回日期：2023-08-20