蔡家洛，朱銳秋，李 森，曹亦軍，黃 坊

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院普外科，上海 200062；

2. 華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237；

3. 安徽醫(yī)科大學(xué)上海普陀中心臨床學(xué)院，上海 200062；

4. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院病理科，上海 200062

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。盡管針對癌癥進(jìn)展的新藥不斷涌現(xiàn)，但耐藥性問題仍然是該領(lǐng)域的一個(gè)挑戰(zhàn)［2］。近年來，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）在化療耐藥中的重要性已廣受關(guān)注［3］。癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblast，CAF）是TME的主要組成成分，其分泌的細(xì)胞因子、趨化因子等參與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥過程。CAF具有異質(zhì)性，分為肌成纖維CAF（myofibroblastic CAF，myCAF）、炎癥CAF（inflammatory CAF，iCAF）和抗原提呈CAF（antigenpresenting CAF，apCAF）［4］。CAF因其獨(dú)特的細(xì)胞狀態(tài)和多種機(jī)制介導(dǎo)的促腫瘤功能，成為分析TME在化療耐藥中作用的重要靶點(diǎn)［5］。iCAF作為CAF的炎癥亞型，通過產(chǎn)生細(xì)胞因子等物質(zhì)參與腫瘤的耐藥過程［6］。然而，iCAF對CRC耐藥的影響還有待確定。本研究以iCAF無血清培養(yǎng)刺激iCAF分泌炎癥因子以獲得條件培養(yǎng)基，再以iCAF條件培養(yǎng)基（iCAF-conditioned medium，iCAF-CM）刺激CRC細(xì)胞，探討iCAF與CRC細(xì)胞耐藥的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞、HCT116細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）細(xì)胞庫，人腸成纖維細(xì)胞（human intestinal fibroblast，HIF）購自美國ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室，CRC組織來源的CAF從CRC患者（于2022年8月-2022年9月在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除）的癌組織中分離得到。細(xì)胞培養(yǎng)條件是37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%。組織標(biāo)本的使用均征得患者的知情許可。本研究獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［倫理批件編號(hào)：PTEC-A-2023-5（S）-1］。

1.1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、雙抗、胰酶均購自美國Gibco公司，上樣緩沖液、RIPA裂解液均購自美國CST公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin Ⅴ-EGFP/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，TritonX-100、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulphate，SDS）、免疫染色固定液、細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒均購自上海Beyotime公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒購自美國EZBioscience公司。

1.1.3 儀器

酶標(biāo)儀、PCR儀均購自美國Thermo Fisher公司，凝膠電泳儀購自美國Bio-Rad公司，共聚焦顯微鏡購自德國Zeiss公司，CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

分別用RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基［加入100 U/L青霉素+鏈霉素，10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）］對凍存的HCT116、RKO和HIF細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，以1h105個(gè)/cm2進(jìn)行培養(yǎng)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%）。待細(xì)胞數(shù)量長至對數(shù)期時(shí)，進(jìn)行傳 代。

1.2.2 提取原代CAF

取患者新鮮CRC組織標(biāo)本，采用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)CAF。

1.2.3 免疫熒光

CAF（2h104）在顯微鏡玻片上接種培養(yǎng)過夜。用PBS洗滌2次，甲醇固定15 min，0.2% TritonX-100滲透5 min，在室溫下使用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉1 h后，4 ℃下一抗［FAP（1∶100稀釋，兔源）、血小板源性生長因子受體α（platelet derived growth factor receptor alpha，PDGFRA）（1∶500稀釋，兔源）］溫育過夜，然后與二抗［山羊抗小鼠IgGH&L（AlexaFluor?488）］和［山羊抗兔IgGH&L（AlexaFluor?594）］溫育2 h。用DAPI進(jìn)行核定位評估。

1.2.4 篩選iCAF并獲得iCAF-CM

從參考文獻(xiàn)［7］可知，PDGFRA是iCAF的標(biāo)志物，因此本研究使用PDGFRA作為篩選iCAF的標(biāo)志物，通過免疫熒光，從CAF中篩選出高表達(dá)PDGFRA的CAF，即為iCAF。

1.2.5 獲得條件培養(yǎng)基

單獨(dú)培養(yǎng)HIF和iCAF，當(dāng)細(xì)胞生長至80%時(shí)，將培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。處理48 h后，收集細(xì)胞懸液作為條件培養(yǎng)基。高速離心后收集條件培養(yǎng)基，用0.22 μm微孔膜過濾，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)分組

將腫瘤細(xì)胞分為對照組（僅加入培養(yǎng)基）、實(shí)驗(yàn)組1［加入HIF條件培養(yǎng)基（HIF-conditioned medium，HIF-CM）］和實(shí)驗(yàn)組2（加入iCAFCM）。每組均設(shè)置HCT116和RKO兩種腫瘤細(xì)胞。

1.2.7 CCK-8法檢測腫瘤細(xì)胞存活率

以2h104個(gè)/孔分別接種HCT116和RKO細(xì)胞到96孔板中培養(yǎng)24 h，隨后分別使用奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）和5-FU藥物作用24 h，以每孔100 μL CCK-8溶液加入孔中，培養(yǎng)溫育30 min，于450 nm波長處檢測吸光度（D）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞凋亡率

選擇各組中對照組的1/2半數(shù)抑制濃度（half inhibition concentration，IC50）作為誘導(dǎo)凋亡的藥物濃度，給藥24 h后，使用Annexin Ⅴ/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，根據(jù)兩種染料不同的激發(fā)波長，分別使用流式細(xì)胞儀所帶的異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和PE通道對樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin蛋白水平

分別用HIF-CM和iCAF-CM對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行刺激。48 h后，用對照組IC50濃度的OXA和5-FU分別對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行處理。24 h后，PBS沖洗且在冰上裂解后，4 ℃超速離心，提取上清液，定量。隨后沸水中煮5 min，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝膠分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，在5%脫脂奶粉中封閉1.5 h后加入一抗鼠抗β-actin（1∶5 000）、兔抗caspase-3（1∶1 000）、鼠抗Bcl-2（1∶1 000）、兔抗Bcl-xL（1∶1 000）、兔抗survivin（1∶500）于4 ℃搖床溫育過夜，用含有吐溫-20三乙醇胺緩沖鹽溶液（tris-buffered saline Tween，TBST）漂洗后，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（1∶20 000）和山羊抗兔IgG（1∶20 000）室溫溫育1 h，隨后用TBST漂洗，采用電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）法，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光檢測，用Image J 軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.2.10 用RTFQ-PCR法檢測caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的mRNA表達(dá)水平

裂解液裂解細(xì)胞后，使用RNA快速提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后用RTFQ-PCR檢測caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的mRNA表達(dá)，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min進(jìn)入循環(huán)，95 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，以β-actin為內(nèi)參基因。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)量，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。引物設(shè)計(jì)時(shí)，β-actin的上游引物序列為5'-CCC AGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3'，下游引物序列為5'-ATCTGCTGGAAGGTGGACAG CGA-3'；Caspase-3的上游引物序列為5'-CCAAAGATCATACATGGAAGCG-3'，下游引物序列為5'-CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG-3'；Bcl-2的上游引物序列為5'-GACTTCGCCGAGATG TCCAG-3'，下游引物序列為5'-GAACT CAAAGAAGGCCACAATC-3'；Bcl-xL的上游引物序列為5'-GCATATCAGAGCTTT GAACAGG-3'，下游引物序列為5'-GAAGGAGAAAAAGGC CACAATG-3'；Survivin的上游引物序列為5'-CCGCATCTCTACATTCAAGAAC-3'，下游引物序列為5'-CTCCTTGAAGCAGAAGAAACAC-3'。

1.2.11 通過Western blot探究iCAF對Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

采用條件培養(yǎng)基和對照組IC50濃度的OXA和5-FU處理細(xì)胞，使用細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒提取核內(nèi)蛋白。采用Western blot檢測腫瘤細(xì)胞總蛋白的表達(dá)水平以及細(xì)胞核中β-catenin和Lamin B1蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7和SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示，用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey’s multiple comparisons test進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代CAF提取及亞型鑒定

首先使用CRC組織標(biāo)本提取原代CAF，對細(xì)胞株命名為CAF-71和CAF-95。鏡下觀察其形態(tài)呈長梭形（圖1）。提取的原代細(xì)胞表達(dá)CAF常見表面標(biāo)志物FAP和PDGFRA，表明提取的原代細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，其中CAF-95對PDGFRA高表達(dá)，為iCAF，因此選用CAF-95細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并獲得條件培養(yǎng)基（95-CM），以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

圖1 原代CAF驗(yàn)證及篩選Fig. 1 Primary CAF verification and screening

2.2 CRC細(xì)胞的IC50升高

隨著OXA和5-FU藥物濃度的上升，HCT116和RKO細(xì)胞的存活率不斷下降。結(jié)果顯示，HCT116細(xì)胞中，對照組OXA的IC50為10.701 4 μmol/L，HIF-CM組OXA的IC50為12.972 2 μmol/L，95-CM組OXA的IC50為30.380 4 μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）；RKO細(xì)胞中，對照組OXA的IC50為29.785 5 μmol/L，HIF-CM組OXA的IC50為32.536 8 μmol/L，95-CM組OXA的IC50為55.690 8 μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。HCT116細(xì)胞中，對照組5-FU的IC50為87.531 2 μmol/L，HIF-CM組5-FU的IC50為86.861 9 μmol/L，95-CM組5-FU的IC50為135.781 0 μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；RKO細(xì)胞中，對照組5-FU的IC50為18.235 5 μmol/L，HIF-CM組5-FU的IC50為21.732 0 μmol/L，95-CM組5-FU的IC50為36.817 9 μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖2）。95-CM培養(yǎng)后，HCT116和RKO細(xì)胞對OXA和5-FU的IC50明顯升高，存活率升高，說明經(jīng)iCAF刺激后，CRC細(xì)胞可能產(chǎn)生了耐藥。

圖2 CCK-8檢測加入95-CM前后腫瘤細(xì)胞的存活率變化Fig. 2 Cell viability of tumor cells treated with or without 95-CM tested by CCK-8

2.3 iCAF抑制CRC細(xì)胞凋亡

兩種癌細(xì)胞在兩種抗腫瘤藥物的分別作用下，相較于對照組和HIF-CM組，95-CM組中的細(xì)胞凋亡水平明顯下 降（圖3）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測加入95-CM前后腫瘤細(xì)胞的凋亡水平變化Fig. 3 Apoptosis rate of tumor cells treated with or without 95-CM tested by flow cytometry

為驗(yàn)證以上結(jié)果，我們進(jìn)一步檢測了iCAF刺激的腫瘤細(xì)胞中凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的表達(dá)水平變化（圖4）。與對照組和HIF-CM組相比，95-CM組中，凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)水平明顯下降，而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL和survivin的表達(dá)水平均有所上升（P＜0.05）。采用RTFQPCR檢測了以上幾種蛋白的mRNA水平，所得結(jié)果與Western blot一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。上述結(jié)果說明經(jīng)iCAF刺激后，腫瘤細(xì)胞的凋亡減少，也就證明iCAF能夠介導(dǎo)CRC細(xì)胞耐藥。

圖4 Western blot檢測β-actin、caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的表達(dá)Fig. 4 The expressions of β-actin, caspase-3, Bcl-2, Bcl-xL and survivin tested by Western blot

圖5 RTFQ-PCR檢測caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的mRNA水平Fig. 5 The mRNA expressions of caspase-3, Bcl-2, Bcl-xL and survivin tested by RTFQ-PCR

2.4 iCAF激活Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

本研究進(jìn)一步探索了Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化。結(jié)果顯示，3組的腫瘤細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)水平相比較，總蛋白未見明顯差異，核內(nèi)蛋白表達(dá)產(chǎn)生明顯差異（P＜0.05，圖6）。從圖中可以看出，95-CM組中，β-catenin發(fā)生轉(zhuǎn)移，在β-catenin總蛋白不變的情況下，細(xì)胞核中的β-catenin增多，說明經(jīng)iCAF刺激后，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，從而導(dǎo)致CRC細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生。

圖6 經(jīng)95-CM刺激后CRC細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)變化Fig. 6 Changes of Wnt/β-catenin signalling pathway in CRC cells stimulated by 95-CM

3 討 論

CRC發(fā)病率在惡性腫瘤中重高居第3位，病死率高居第2位［8］。

近年來，TME在腫瘤耐藥中的作用逐漸引起人們注意并被廣泛研究［9］。其中，CAF是TME的重要組成部分，在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用［10］。CAF可以通過多種途徑介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥［11］：① 抑制腫瘤細(xì)胞凋亡；② 重塑細(xì)胞外基質(zhì)；③ 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）；④ 驅(qū)動(dòng)免疫抑制；⑤ 增強(qiáng)腫瘤代謝；⑥ 調(diào)控腫瘤干細(xì)胞。

本研究通過免疫熒光，從原代CAF中篩選出iCAF即CAF-95后，使用95-CM刺激CRC細(xì)胞，運(yùn)用CCK-8法檢測到經(jīng)刺激后，CRC細(xì)胞對抗癌藥物OXA作用的存活率上升。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CAF-95刺激后，凋亡蛋白caspase-3及其mRNA的水平明顯下降，抗凋亡蛋白Bcl-2、BclxL和survivin及其mRNA的水平均有所上升，證實(shí)iCAF能夠促進(jìn)CRC耐藥。

Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對腫瘤細(xì)胞的凋亡有一定作用，同時(shí)也參與EMT的過程。有研究［12］發(fā)現(xiàn)，CAF激活Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過抑制細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑1和含F(xiàn)框WD重復(fù)域蛋白7進(jìn)而抑制線粒體凋亡，增強(qiáng)CRC細(xì)胞對抗癌藥5-FU的耐藥性。另外有研究［13］發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CAF上清液培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平更低，且CAF分泌的CXCL12可以激活腫瘤細(xì)胞中的CXCR4/Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)EMT，導(dǎo)致順鉑抗性增強(qiáng)。

Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種腫瘤中都被高度激活，有許多對癌癥具有潛在治療效果的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑藥物的研究正在進(jìn)行［14］。有研究［15］顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在CRC間質(zhì)的CAF中高表達(dá)。因此我們推測iCAF介導(dǎo)CRC細(xì)胞耐藥可能與Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。本研究通過Western blot對95-CM刺激下的CRC細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)進(jìn)行檢測，觀察到細(xì)胞質(zhì)中β-catenin減少，進(jìn)入細(xì)胞核增加，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，參與了耐藥過程。

本研究仍存在一定局限性。首先，CAF具有異質(zhì)性，不同表型具有不同的功能，本研究僅研究iCAF對CRC耐藥的影響，但CAF的其他表型（如myCAF）是否也具備同樣的功能及可能存在的機(jī)制尚不清楚。其次，本研究證明了iCAF通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)一系列凋亡蛋白的變化，從而介導(dǎo)CRC耐藥，研究還不夠深入，具體機(jī)制仍有待探索。之后的研究可將重點(diǎn)放在Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如何參與耐藥過程，如發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上。另外，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與癌癥發(fā)生密切相關(guān)，但既往研究［14］表明，阻斷Wnt信號(hào)往往會(huì)伴隨著不良反應(yīng)的發(fā)生，如破壞組織穩(wěn)態(tài)和再生等。

綜上所屬， iCAF可能是通過Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過程，進(jìn)而誘導(dǎo)CRC細(xì)胞耐藥。因此未來可以將iCAF視作設(shè)計(jì)抗癌藥物的潛在靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。