韓智 韓鈺潔 張海紅

(1 武威市中心血站,甘肅 武威 733000,2 中央民族大學(xué)理學(xué)院,3 甘肅省紅十字血液中心)

補(bǔ)體是血液或體液中正常存在的、參與免疫效應(yīng)的、并可具有酶活性的一組球蛋白分子[1]。在正常生理狀態(tài)下,絕大多數(shù)補(bǔ)體固有成分均以非活化形式存在,受某種激活劑作用后即出現(xiàn)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),各種補(bǔ)體固有成分依次活化,最終產(chǎn)生溶細(xì)胞性效應(yīng)。同時(shí),補(bǔ)體也可介導(dǎo)病理?yè)p傷,如引起過敏反應(yīng)、輸入紅細(xì)胞的血管內(nèi)溶血、溶解紅細(xì)胞或白細(xì)胞及血小板、活化血小板等[1]。因此,補(bǔ)體分子在輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有十分重要的作用[1]。

至今已知補(bǔ)體系統(tǒng)由20 余種成分組成。在血清中的含量以C3 為最高,其次為C4、S 蛋白和H 因子[2]。為了觀察成分血輸入人體前補(bǔ)體含量變化,我們從采血后6h 內(nèi)分離血漿開始分別留取－60℃、－40℃、4℃、22℃幾種不同保存溫度和制備工藝階段的血漿樣本,檢測(cè)本地區(qū)幾種常見血液制品在不同保存階段補(bǔ)體C3、C4 含量,以期反映成分血在臨床輸注前補(bǔ)體等蛋白成分含量變化情況,為循證輸血醫(yī)學(xué)積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取本站2022 年8—10 月期間來自于無償獻(xiàn)血者血液分離的血漿,其中20 人份普通血漿、20 人份新鮮冰凍血漿,分別留取新鮮冰凍血漿不同制備工藝階段標(biāo)本,共180 份,無償獻(xiàn)血者均符合?獻(xiàn)血者健康檢查要求?[3],檢測(cè)幾種常見成分血制品在不同制備工藝階段、不同保存溫度等條件下補(bǔ)體C3、C4 含量,下文所述新滅漿為新鮮冰凍血漿經(jīng)制備后的病毒滅活血漿,普滅漿為普通冰凍血漿經(jīng)制備后的病毒滅活血漿。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 補(bǔ)體C3、C4 均采用免疫比濁法檢測(cè)。

1.2.1 設(shè)備 日立008AS 全自動(dòng)生化分析儀。

1.2.2 試劑 補(bǔ)體C3、C4 均采用批號(hào)220817102 美康生物試劑盒,質(zhì)控品采用郎道HN1530,質(zhì)控品批號(hào)為1376UN。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 按照制備工藝、保存溫度和時(shí)間段不同,將本站來自于無償獻(xiàn)血者血漿在不同制備工藝階段留取各自的同源標(biāo)本共180 份,集中在同一批次實(shí)驗(yàn)檢測(cè),排除了不同批次檢測(cè)帶來的實(shí)驗(yàn)干擾,觀察不同保存溫度和不同工藝階段分組條件下補(bǔ)體C3、C4 含量變化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果分為九組,下文括號(hào)內(nèi)數(shù)字(一)～(九)為檢測(cè)結(jié)果分組號(hào),與表1 所示分組號(hào)相同。

1.3.1 血液采集后6 h 內(nèi)離心分離細(xì)胞和血漿 留取第1 批標(biāo)本,隨袋裝血漿速凍后分別保存于－40℃和－60℃,分別代表－40℃原始血漿(一)和－60℃原始血漿(二)。

1.3.2 普通血漿加亞甲藍(lán)6℃光照進(jìn)行病毒滅活 速凍前留取第二批標(biāo)本,隨血漿分別保存于－40℃和－60℃,在檢測(cè)前置4℃保存7 d,模擬全血在4℃保存7 d 狀態(tài),保存于－40℃普通滅漿(三)和－60℃普通滅漿(四)。

1.3.3 新鮮冰凍血漿經(jīng)分離冷沉淀后,加亞甲藍(lán)于6℃光照病毒滅活 速凍前留取第3 批標(biāo)本,隨血漿分別保存于－40℃和－60℃,代表新鮮冰凍血漿經(jīng)分離冷沉淀、病毒滅活工藝后－40℃新滅漿(五)和－60℃新滅漿,其中－60℃新滅漿在檢測(cè)前7 d 置于4℃,代表經(jīng)兩種工藝后4℃保存7 d 的新滅漿(六)。

1.3.4 新鮮冰凍血漿在保存30 d 后,于6℃水浴融化離心分離冷沉淀 在斷離前將血漿聯(lián)袋間管路熱合留取第四批標(biāo)本,分別保存于－40℃和－60℃,分別代表離心法分離制備的－40℃冷沉淀(七)和－60℃冷沉淀(八)。

1.3.5 將新鮮冰凍血漿經(jīng)分離冷沉淀 工藝后－60℃冷沉淀(八)標(biāo)本一分為二,分出的一份于檢測(cè)前置于22℃震蕩保存48h,模擬48h 濃縮血小板(九)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以(±s)表示,采用秩和檢驗(yàn)[4]中的Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,組間相關(guān)性比較采用Spearman 相關(guān)性分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)體C3、C4 含量檢測(cè)結(jié)果比較 用同一標(biāo)本檢測(cè)C3、C4 含量,將檢測(cè)結(jié)果按照分組條件整理為九組進(jìn)行比較,見表1。

冷沉淀(組)一二三四五六七八九C30.76±0.120.82±0.150.72±0.130.77±0.130.73±0.160.76±0.160.93±0.160.80±0.111.04±0.17 P①0.994 1②0.133 3③0.240 6④0.047 0⑤0.038 3⑥0.999 9⑦0.418 6⑧0.997 9⑨1.000 0 C40.24±0.050.25±0.050.22±0.040.23±0.040.22±0.050.22±0.040.27±0.040.25±0.040.31±0.06 P①0.957 1②0.027 3③0.025 1④0.042 6⑤0.012 1⑥0.998 7⑦0.564 0⑧0.996 8⑨0.999 7

2.1.1 不同階段血漿補(bǔ)體C3 含量比較 觀察不同保存溫度和時(shí)間段分組條件下補(bǔ)體含量檢測(cè)結(jié)果(表1)。表中可見:④保存在－40℃的原始新鮮冰凍血漿在制備為新滅漿后的補(bǔ)體C3 的含量有顯著變化,制備前后保存時(shí)間、保存溫度沒有變化,證明制備冷沉淀的制備工藝中存在能顯著改變補(bǔ)體C3 含量的影響因素,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,⑤保存在－60℃的原始新鮮冰凍血漿和4℃保存新滅漿補(bǔ)體C3 的含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,保存時(shí)間沒有變化,制備后的保存溫度有變化,證明制備冷沉淀后的新滅漿的制備工藝,和制備后的保存溫度二者中存在能顯著改變補(bǔ)體C3 含量的影響因素。

2.1.2 不同階段血漿補(bǔ)體C4 含量比較 觀察不同保存溫度和時(shí)間段分組條件下補(bǔ)體含量檢測(cè)結(jié)果,與上述補(bǔ)體C3 含量比較結(jié)論基本一致(表1)。表中可見:②－40℃原始新漿與模擬全血4℃保存7 d 的普滅漿補(bǔ)體C4 含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,保存時(shí)間和制備前保存溫度沒有改變,證明制備滅漿的制備工藝和制備后的保存溫度二者中存在能顯著改變補(bǔ)體C4 含量的影響因素,③保存在－60℃的原始新漿與模擬全血4℃保存7 d 的普滅漿補(bǔ)體C4 含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,保存時(shí)間和制備前保存溫度沒有改變,證明制備普滅漿的制備工藝和制備后的保存溫度二者中存在能顯著改變補(bǔ)體C4 含量的影響因素,④保存在－40℃的原始新漿和－40℃新滅漿補(bǔ)體C4 含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,保存時(shí)間和溫度沒有變化,證明制備病毒滅活血漿的工藝能顯著改變補(bǔ)體C4 含量,⑤保存在－60℃的原始新漿和4℃新滅漿補(bǔ)體C4 含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,保存時(shí)間沒有變化,制備后的保存溫度有變化,證明新滅漿的制備工藝和制備后的保存溫度二者中存在能顯著改變補(bǔ)體C4 含量的影響因素。

2.2 補(bǔ)體C3、C4 之間的相關(guān)性分析 根據(jù)Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示,補(bǔ)體C3 與補(bǔ)體C4 之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05),即在保存溫度、時(shí)間段和制備工藝等變量條件一致情況下補(bǔ)體C3 與C4 的含量變化一致,見表2。

補(bǔ)體C3補(bǔ)體C4補(bǔ)體C31.000 0.894??補(bǔ)體C40.894??1.000

3 討論

現(xiàn)行輸血行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)補(bǔ)體含量沒有明確要求[5]。各補(bǔ)體成分中C3 血清含量最高,在功能上是補(bǔ)體系統(tǒng)的核心分子。補(bǔ)體占血清球蛋白總量的10%,含量相對(duì)穩(wěn)定,與抗原制激無關(guān),故不能隨著機(jī)體特異性免疫的建立和增強(qiáng)而增高,檢測(cè)人血漿補(bǔ)體水平,可作為某些疾病后的輔助診斷證據(jù)了解病情[6-12]。由于臨床治療經(jīng)常需要輸注血液成分制品,而隨之輸入人體的補(bǔ)體成分在宿主體內(nèi)的含量和作用的研究不多見。

補(bǔ)體活性不甚穩(wěn)定,加熱56℃,30min 即可滅活[2]。血液離開人體后,在不同溫度下,隨著保存時(shí)間的變化,其中的補(bǔ)體含量也不同。為真實(shí)反映不同保存和制備工藝條件下補(bǔ)體成分的變化,保證檢測(cè)數(shù)據(jù)的可比性,檢測(cè)標(biāo)本采用同源血漿,從制備、保存各階段留取的標(biāo)本都與該血液成分制品處于相同保存條件。

限于條件,未做血漿補(bǔ)體活性[13]和穩(wěn)定性[14]研究,本次實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)血漿制品在不同保存溫度和制備工藝階段的補(bǔ)體C3、C4 含量,通過對(duì)比發(fā)現(xiàn),原始血漿保存在－40℃與－60℃條件下補(bǔ)體C3、C4 的含量差異均沒有顯著性,保存在－40℃與－60℃的原始血漿與普通滅活漿的補(bǔ)體C3 含量變化不顯著,C4 含量變化顯著,不一致的原因分析或?yàn)闃颖玖坎蛔?或存在4℃保存溫度和病毒滅活工藝對(duì)補(bǔ)體C4 影響?補(bǔ)體C3 的可能,變化趨勢(shì)說明4℃保存溫度和病毒滅活工藝能夠降低補(bǔ)體含量,保存在－40℃的原始血漿與－40℃新滅漿補(bǔ)體C3、C4 的含量均有顯著差異,說明血漿凍融、光照滅活等制備工藝能顯著改變補(bǔ)體C3、C4 含量,保存在－60℃的原始新漿與制備后4℃保存7 d[15]新滅漿的補(bǔ)體C3、C4 的含量均有顯著差異,證明4℃保存7 d 的保存溫度和保存時(shí)間、血漿凍融、光照滅活等制備冷沉淀的工藝能顯著改變補(bǔ)體C3、C4 含量,保存在－40℃、－60℃的原始新漿與－40℃、－60℃冷沉淀補(bǔ)體C3、C4 的含量變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分析為低溫離心導(dǎo)致血漿內(nèi)補(bǔ)體等蛋白濃縮,保存在－60℃的濃縮冷沉淀與22℃保存48 h 模擬濃縮血小板補(bǔ)體C3、C4 含量降低不顯著,且有升高趨勢(shì),分析為22℃震蕩保存過程使原本低溫離心沉淀濃縮的血漿補(bǔ)體又均勻溶解于血漿中。

綜上所述,單純－40℃、－60℃不同溫度保存補(bǔ)體含量變化不顯著,4℃保存7 d 是否能夠顯著降低補(bǔ)體含量,有待增加－60℃新滅漿和4℃保存7d 的新滅漿對(duì)照進(jìn)一步排除制備病毒滅活血漿工藝的影響,22℃室溫保存在48 h 內(nèi)變化沒有顯著性。據(jù)報(bào)道,保存補(bǔ)體以低溫為好[16],上述結(jié)論與報(bào)道結(jié)論相符。冰凍血漿反復(fù)凍融、離心濃縮、光照滅活等因素能夠影響補(bǔ)體含量。補(bǔ)體C3、C4 含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析表明,二者在溫度、制備工藝和保存時(shí)間等相同條件下的變化呈顯著正相關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。