孫 婷，張洪濤, ，楊 峰，柴文剛，薛皓陽(yáng)，譚淑引

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系無(wú)機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433；3.倫敦帝國(guó)理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，糖科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，英國(guó) 倫敦 HA13UJ；4.江南大學(xué)化工學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

煙酰胺單核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）是一種自然存在的生物活性核苷酸[1]，它廣泛分布在人體的所有細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞內(nèi)完成生命活動(dòng)必不可少的輔因子[2]。研究發(fā)現(xiàn)NMN在改善衰老血管的血流量[3]、減少腦出血后腦損傷[4]、提高胰島素敏感性、促進(jìn)肌肉重塑[5]等方面發(fā)揮著重要作用，值得一提的是NMN可以通過(guò)減少DNA損傷防治新冠、加速新冠患者的康復(fù)[6-7]。2020年，日本厚生勞動(dòng)省將NMN列入“非醫(yī)療清單”，允許其在食品生產(chǎn)中使用。NMN已成為食品、醫(yī)學(xué)、保健品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8]。

目前，NMN的合成方法主要有化學(xué)合成、酶法合成和生物合成3 種途徑[9]?；瘜W(xué)合成NMN需要先合成煙酰胺核苷，通常從核糖衍生物和煙酸衍生物開始，成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重[10]；酶法合成效率較高，但存在操作復(fù)雜、成本高等缺陷[11]；生物發(fā)酵法是利用細(xì)胞將底物轉(zhuǎn)化為特定產(chǎn)物的過(guò)程[12]，由于減少了傳統(tǒng)酶催化細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)濃縮等步驟[13]，因此具有選擇性高、催化活性強(qiáng)、成本效益高等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[14]。據(jù)2021年研究報(bào)道，以煙酰胺和葡萄糖為底物，發(fā)酵法生產(chǎn)NMN最高產(chǎn)量為6.79 g/L[15]。目前發(fā)酵液中NMN產(chǎn)品濃度較低，嚴(yán)重阻礙了發(fā)酵法合成NMN技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化。因此，亟需開發(fā)一種更高效的NMN生物合成工藝。

細(xì)胞內(nèi)NMN的合成路線主要有兩條途徑：1）以煙酰胺核糖（nicotinamide riboside，NR）為底物，ATP作為輔因子，通過(guò)煙酰胺核苷激酶（nicotinamide riboside kinase，NRK）催化直接實(shí)現(xiàn)NMN合成[16]；2）以核糖和ATP為底物，先在核糖磷酸焦磷酸激酶（phosphoribosylpyro phosphate，PRPP）催化下生成5-磷酸核糖-1α-焦磷酸，后者在煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT）催化下與煙酰胺合成NMN[17]。第2條途徑為多酶催化體系，需要酶的種類較多，中間產(chǎn)物多，總體收率低[18]，而第1條途徑只需要一步酶催化即可完成，且能夠避免使用價(jià)格較高、來(lái)源受限的PRPP[19]。因此，本研究建立以NR和ATP為底物，通過(guò)NRK一步法直接轉(zhuǎn)化為NMN的全細(xì)胞合成體系?？紤]到該反應(yīng)需要由ATP提供一個(gè)磷酸基供體，而單純外源添加造成生產(chǎn)成本高[20-21]，因此構(gòu)建ATP再生系統(tǒng)是提高生物合成反應(yīng)經(jīng)濟(jì)性的一個(gè)有效措施[22]。由于多聚磷酸酶（polyphosphate kinase，PPK）可催化無(wú)機(jī)多聚磷酸鹽（inorganic polyphosphate，Poly-P）和ATP之間的磷酸鹽可逆轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)ATP的循環(huán)再生[23]，故將該系統(tǒng)引入NMN的合成體系，用以實(shí)現(xiàn)ADP到ATP再生。

本研究構(gòu)建基于大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）-pET28a-NRK、E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的全細(xì)胞雙菌耦合發(fā)酵體系（圖1），實(shí)現(xiàn)基于工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的ATP再生系統(tǒng)在E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK合成NMN中的應(yīng)用。構(gòu)建的雙菌耦合發(fā)酵系統(tǒng)可以通過(guò)ATP再生實(shí)現(xiàn)ATP持續(xù)供給，降低整個(gè)發(fā)酵體系的生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)NR到NMN的連續(xù)化合成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

E.coliBL21（DE3）天根生化科技（北京）有限公司；表達(dá)載體pET28a質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，調(diào)節(jié)pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉2%。將工程菌接種到LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.1.3 試劑

卡那霉素（kanamycin，Kan）、DNA Marker及蛋白Marker 翌圣生物科技（上海）股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Taq酶、T4 DNA連接酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；NMN標(biāo)準(zhǔn)品 海軍軍醫(yī)大學(xué)趙慶杰教授贈(zèng)送；NR、ADP、ATP標(biāo)準(zhǔn)品 杭州鎧朋生物技術(shù)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）北京伊諾凱科技有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicaci，HEPES）北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C1000 TouchTM聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Mini-PROTEAN Tetra蛋白電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司；高效液相色譜儀 日本島津公司；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 賽默飛科技有限公司；超聲波破碎機(jī)寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工程菌株的構(gòu)建

將編碼NRK1基因序列（Gene ID：54981）、NRK2基因序列（Gene ID：6787）、PPK基因序列（Gene ID：VLKR01000001.1）進(jìn)行大腸桿菌偏好性密碼子優(yōu)化，由天霖生物公司合成，獲得重組質(zhì)粒pET28a-NRK1（圖2a）、pET28a-NRK2（圖2b）和pET28a-PPK（圖2c），然后分別轉(zhuǎn)化到E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，并利用Kan選擇性培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，篩選出陽(yáng)性克隆。設(shè)計(jì)引物NRK1-F、NRK1-R，NRK2-F、NRK2-R和PPK-F、PPK-R（表1），挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，由天霖生物公司對(duì)條帶大小正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR in this study

圖2 重組質(zhì)粒構(gòu)建Fig.2 Recombinant plasmid construction

1.3.2 重組蛋白的表達(dá)

分別挑取工程菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2和E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的單菌落接入10 mL含有20 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h。再以2%接種量轉(zhuǎn)接到150 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)至OD600nm約為0.7后加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG，16 ℃、200 r/min條件下過(guò)夜誘導(dǎo)培養(yǎng)后，8 000 r/min離心5 min，收集菌體備用，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.3.3 NMN的生物合成及結(jié)構(gòu)鑒定

NMN合成體系：20 mmol/L HEPES（pH 7.2）、5 mmol/Lβ-巰基乙醇、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、20 mmol/L NR、40 mmol/L ATP、NRK菌體質(zhì)量濃度100 g/L，18 ℃、100 r/min反應(yīng)12 h。

薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）檢測(cè)：展開劑1,4-二氧環(huán)烷∶水∶氨水∶異丙醇=4∶2.5∶3∶2（V/V），254 nm波長(zhǎng)紫外照射顯色。

液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)條件：大氣壓電噴霧電離源H-ESI II probe；色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；液相流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；吸收波長(zhǎng)254 nm。流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%甲酸，程序：0～2 min，0% A、100% B；2～6 min，0%～90% A、100%～10% B；6～7.5 mim，90% A、10% B；7.5～8 min，9 0%～0% A、10%～100% B；8～11 min，0% A、100% B。

1.3.4 NMN的定量分析

配制6 組NMN標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5、6 mg/mL，通過(guò)高效液相色譜對(duì)NMN標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析，以NMN標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫軸，色譜中相應(yīng)的峰面積為縱軸，對(duì)液相色譜結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，繪制NMN的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到相應(yīng)樣品質(zhì)量濃度。

高效液相色譜條件：色譜柱為Unitary C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%高氯酸溶液；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)257 nm；柱溫30 ℃；洗脫時(shí)間20 min。

1.3.5 ATP的生物合成及鑒定

ATP的合成體系：20 mmol/L HEPES（pH 7.2）、5 mmol/Lβ-巰基乙醇、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、20 mmol/L ADP、20 mmol/L Poly-P、PPK菌體質(zhì)量濃度100 g/L，18 ℃、100 r/min反應(yīng)12 h。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)合成的ATP進(jìn)行鑒定：采用反射陰離子模式，2,5-二羥基苯甲酸作為輔助基質(zhì)，掃描分子質(zhì)量范圍為470～600 Da。

1.3.6 單菌合成體系的優(yōu)化

1.3.6.1E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，設(shè)置不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)（8、10、12、14、16、18、20、22、24 h）、誘導(dǎo)溫度（16、20、25、28、30、37 ℃）和誘導(dǎo)劑IPTG終濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1 mmol/L）依次進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)，以期獲得更多的目的蛋白。

1.3.6.2E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1生物合成NMN的條件優(yōu)化

對(duì)單一工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1生物合成NMN過(guò)程中的菌體質(zhì)量濃度（25、50、75、100、125、150 g/L）、時(shí)長(zhǎng)（8、10、12、14、16、18、20 h）、溫度（18、30、37 ℃）、底物ATP（20 mmol/L）與NR濃度比（1∶0.5、1∶0.75、1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1∶2）進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.7 雙菌耦合發(fā)酵體系的建立及優(yōu)化

構(gòu)建工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1及工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的全細(xì)胞雙菌耦合發(fā)酵體系：20 mmol/L HEPES（pH 7.2）、5 mmol/Lβ-巰基乙醇、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、30 mmol/L NR、20 mmol/L ATP、40 mmol/L Poly-P、100 g/LE.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、100 g/LE.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK，18 ℃、100 r/min反應(yīng)12 h。

對(duì)雙菌耦合發(fā)酵體系從ATP與NR濃度比（1∶1.5、1∶2.5、1∶3.5、1∶4.5、1∶5.5）、菌體質(zhì)量濃度比（1∶0、1∶2、1∶1、1∶0.67、1∶0.5）及發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)（6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h）進(jìn)行優(yōu)化，獲得耦合發(fā)酵的最適條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-NRK1經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖3a泳道1，得到的片段長(zhǎng)度與目的基因NRK1（610 bp）大小一致；重組質(zhì)粒pET28a-NRK2的PCR驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖3a泳道2，得到的片段長(zhǎng)度與目的基因NRK2（703 bp）大小相同；對(duì)重組質(zhì)粒pET28a-PPK進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如見(jiàn)圖3a泳道3，得到的片段長(zhǎng)度與目的基因PPK（801 bp）大小一致。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確，得到重組質(zhì)粒pET28a-NRK1、pET28a-NRK2和pET28a-PPK。將重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入E.coliBL21（DE3）中，對(duì)得到的工程菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2、E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3b所示，誘導(dǎo)20 h的全細(xì)胞在25～35 kDa均有明顯的表達(dá)條帶，與NRK1目標(biāo)蛋白（26 kDa）[24]、NRK2目標(biāo)蛋白（26 kDa）[24]、PPK目標(biāo)蛋白（29.7 kDa）[25]大小一致，成功構(gòu)建工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2和E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK。

圖3 重組質(zhì)粒電泳圖Fig.3 Electrophoretograms of recombinant plasmids

2.2 單菌法合成產(chǎn)物NMN的鑒定

2.2.1E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK生物合成產(chǎn)物NMN的分析鑒定

人體細(xì)胞內(nèi)的NRK1和NRK2均具有催化NR和ATP合成NMN能力，構(gòu)建了E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1和E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2工程菌株，進(jìn)行NMN的全細(xì)胞合成。用TLC法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4a，發(fā)現(xiàn)樣品中有與NMN標(biāo)準(zhǔn)品相同Rf值的產(chǎn)物生成，初步判斷有產(chǎn)物NMN生成。

圖4 NRK合成NMN的產(chǎn)物分析Fig.4 Product identification of NMN synthesis by NRK

為進(jìn)一步驗(yàn)證產(chǎn)物，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行刮板回收，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析，從圖4c總離子流圖可以看出樣品只有一個(gè)離子化峰，出峰時(shí)間為1.95 min，進(jìn)一步分析該峰顯示m/z334.95，均與NMN標(biāo)準(zhǔn)品相同。通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜分析可以判斷生成的產(chǎn)物為NMN，因此認(rèn)為E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK具有合成NMN的活性。

2.2.2E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK再生產(chǎn)物ATP的分析鑒定

以ADP、Poly-P為底物，在E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的作用下合成ATP，TLC檢測(cè)結(jié)果如圖5a所示，樣品的Rf值與ATP標(biāo)準(zhǔn)品相同。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行刮板回收，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果如圖5b、c所示，生成的ATP樣品與ATP標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量相同，說(shuō)明E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK可以實(shí)現(xiàn)ATP的再生。

圖5 PPK合成ATP的產(chǎn)物分析Fig.5 Product identification of ATP synthesis by PPK

2.3 單菌誘導(dǎo)及生物合成NMN條件優(yōu)化

2.3.1 NMN標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

NMN標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)（圖6），以NMN濃度為橫坐標(biāo)，液相色譜圖中對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制NMN的標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的R2=0.995 4，說(shuō)明NMN濃度和液相色譜圖中的峰面積有良好線性關(guān)系。

圖6 NMN標(biāo)準(zhǔn)品液相出峰時(shí)間Fig.6 Chromatographic peak time of NMN standard

2.3.2E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK高活性工程菌株的篩選

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在兩種NRK酶NRK1和NRK2，分別由Nmrk1和Nmrk2兩種基因編碼。NRK亞型的表達(dá)分析表明NRK1無(wú)所不在，而NRK2主要存在于骨骼肌中，兩種酶均具有催化NR反應(yīng)生成NMN的能力。為從兩者中篩選出高產(chǎn)NMN的工程菌株，進(jìn)行3 組NMN的全細(xì)胞合成。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜定量分析，如圖7所示，3 組均可以合成NMN，其中E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1反應(yīng)液中NMN產(chǎn)量最高為5.17 g/L，產(chǎn)率77.4%，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2反應(yīng)液中僅為1.12 g/L，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1與E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2菌株混合反應(yīng)液中產(chǎn)量為4.09 g/L。因此選取工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1為最優(yōu)合成NMN的工程菌株，用于后續(xù)雙菌耦合發(fā)酵系統(tǒng)的構(gòu)建與優(yōu)化探索。

圖7 不同工程菌對(duì)NMN產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of different engineered bacteria on NMN yield

2.3.3E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1誘導(dǎo)表達(dá)NRK1條件優(yōu)化

相同細(xì)胞濃度下工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的生物轉(zhuǎn)化效果明顯優(yōu)于E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2，但蛋白電泳圖比較發(fā)現(xiàn)（圖3），在同等誘導(dǎo)表達(dá)條件下，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的蛋白表達(dá)量明顯少于E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2。因此為提高工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1誘導(dǎo)表達(dá)NRK1酶的蛋白表達(dá)量，從接種量、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度等角度進(jìn)行NRK1誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化。

接種量過(guò)大易產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物，影響產(chǎn)物合成；接種量過(guò)小則會(huì)使細(xì)胞濃度增殖減緩，進(jìn)而造成目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量降低。因此，首先從接種量對(duì)蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行探索，當(dāng)接種量為3%時(shí)，NRK1的蛋白表達(dá)量明顯高于其他條件（圖8a）。為了選擇最佳誘導(dǎo)時(shí)間，研究了8 個(gè)不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)的影響，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白的表達(dá)量逐漸增加，誘導(dǎo)時(shí)間22 h與誘導(dǎo)時(shí)間24 h的蛋白表達(dá)量相當(dāng)，因此選擇22 h作為最佳的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間（圖8b）；由于溫度較高時(shí)會(huì)使表達(dá)蛋白形成包涵體，導(dǎo)致酶活性降低，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16 ℃時(shí)，NRK1蛋白表達(dá)量最高（圖8c）；誘導(dǎo)劑IPTG有細(xì)胞毒性，過(guò)高會(huì)造成細(xì)胞死亡導(dǎo)致酶表達(dá)終止，而IPTG過(guò)低則又會(huì)導(dǎo)致酶的誘導(dǎo)表達(dá)受阻，因此探索了IPTG對(duì)NRK1表達(dá)的影響，當(dāng)IPTG終濃度為0.7 mmol/L時(shí)，NRK1的蛋白表達(dá)量最高（圖8d）。因此，確定E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件為：接種量3%、誘導(dǎo)時(shí)間22 h、誘導(dǎo)溫度16 ℃、IPTG 0.7 mmol/L。

圖8 不同誘導(dǎo)條件對(duì)誘導(dǎo)效果的影響Fig.8 Influence of different induction conditions on protein expression

2.3.4E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1生物轉(zhuǎn)化NMN的條件優(yōu)化

由于E.coli底盤細(xì)胞壁上沒(méi)有NMN由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外分泌的外排蛋白，為使細(xì)胞內(nèi)合成的NMN可以高效外排到細(xì)胞外，探索了細(xì)胞壁通透性處理對(duì)促進(jìn)NMN外排的影響。菌體細(xì)胞在反復(fù)凍融過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)部會(huì)形成冰晶，導(dǎo)致剩余液體中鹽濃度的增高造成細(xì)胞被膜結(jié)構(gòu)的破壞，從而提高細(xì)胞膜通透性[12]。因此，在反應(yīng)前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)凍融處理，NMN細(xì)胞外排結(jié)果如圖9所示，可以看出，未凍融細(xì)胞NMN產(chǎn)量?jī)H為0.79 g/L，與未凍融細(xì)胞相比，經(jīng)反復(fù)凍融的細(xì)胞NMN產(chǎn)量為5.33 g/L，產(chǎn)率80.19%。因此，在后續(xù)合成反應(yīng)中需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)凍融處理，使細(xì)胞膜通透性增加。

圖9 通透性處理對(duì)NMN產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of permeability treatment on NMN yield

為進(jìn)一步探索單菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1合成NMN的最優(yōu)體系，從單細(xì)胞菌體質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)、反應(yīng)溫度和底物ATP與NR比例進(jìn)行探索。由圖10a可知，當(dāng)菌體質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)，NMN產(chǎn)量明顯高于其他菌體質(zhì)量濃度，因此選取菌體質(zhì)量濃度100 g/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最適菌體質(zhì)量濃度；圖10b說(shuō)明，當(dāng)時(shí)長(zhǎng)為10 h時(shí)，NMN產(chǎn)量最高，選取10 h為合成體系的最適時(shí)長(zhǎng)；溫度對(duì)產(chǎn)物得率的影響如圖10c所示，溫度越高，產(chǎn)量明顯減少，當(dāng)溫度為18 ℃時(shí)，NMN產(chǎn)量最高，因此選取18 ℃為最佳的反應(yīng)溫度；在確定最佳菌體質(zhì)量濃度、時(shí)間、溫度的基礎(chǔ)上，研究ATP與NR比例對(duì)產(chǎn)物合成的影響，如圖10d所示，ATP與NR比例為1∶1.5時(shí)（20 mmol/L ATP、30 mmol/L NR），NMN產(chǎn)量最高為5.73 g/L，轉(zhuǎn)化率為85.78%。因此，單菌合成NMN的最優(yōu)體系為菌體質(zhì)量濃度100 g/L、反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)10 h、反應(yīng)溫度18 ℃、ATP與NR比例1∶1.5。

圖10 不同因素對(duì)NMN產(chǎn)量的影響Fig.10 Influence of culture conditions on NMN yield from E.coli BL21 (DE3)-pET28a-NRK1

2.4 雙菌耦合發(fā)酵產(chǎn)NMN體系的建立及優(yōu)化

2.4.1 雙菌耦合發(fā)酵體系的建立

為降低合成NMN的成本，在以NR和ATP為底物，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1單菌合成NMN優(yōu)化體系的基礎(chǔ)上，引入ADP到ATP的循環(huán)再生菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK，用于實(shí)現(xiàn)以NR、ATP和Poly-P為底物，通過(guò)雙工程菌株耦合發(fā)酵來(lái)合成NMN，結(jié)果如圖11所示。雙菌株耦合發(fā)酵體系中當(dāng)ATP添加量為12 mmol/L（單菌體系的60%），NMN產(chǎn)量與單菌體系持平為5.7 g/L。隨著ATP的繼續(xù)添加，NMN的產(chǎn)量也逐漸增加，最終NMN產(chǎn)量為6.45 g/L。這表明，在發(fā)酵體系中添加E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK菌株可以實(shí)現(xiàn)ATP的循環(huán)再生，不僅減少了外源供應(yīng)ATP的需求，而且使NMN的產(chǎn)量增加。

2.4.2 雙菌耦合發(fā)酵體系的優(yōu)化

為進(jìn)一步提高雙菌耦合發(fā)酵生成NMN的產(chǎn)量，從最適ATP與NR濃度比、菌體質(zhì)量濃度比及發(fā)酵時(shí)間角度對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。在耦合發(fā)酵體系中，底物ATP與NR初始濃度比對(duì)NMN合成影響較大，由圖12a可知，在ATP與NR濃度比為1∶3.5時(shí)，NMN的產(chǎn)量最高，因此，選取1∶3.5為耦合發(fā)酵的最佳底物濃度比；在此濃度比的基礎(chǔ)上，研究了菌體質(zhì)量濃度比對(duì)產(chǎn)物合成的影響，控制菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的菌體質(zhì)量濃度為100 g/L，改變E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的菌體質(zhì)量濃度，由圖12b發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌體質(zhì)量濃度比為1∶2時(shí)，NMN的產(chǎn)量最高；在最佳底物濃度比與菌體質(zhì)量濃度比的基礎(chǔ)上，又進(jìn)一步研究耦合發(fā)酵時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響，從圖12c可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，NMN產(chǎn)量逐漸上升，發(fā)酵時(shí)間為16 h，NMN產(chǎn)量最高為11.81 g/L，隨著時(shí)間的繼續(xù)增加，NMN產(chǎn)量逐漸趨于平緩下降，因此選取16 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。綜上可得，雙菌株耦合發(fā)酵合成NMN最佳生產(chǎn)工藝為ATP與NR濃度比1∶3.5、菌體質(zhì)量濃度比1∶2、耦合發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)16 h。

圖12 不同因素對(duì)耦合發(fā)酵產(chǎn)NMN的影響Fig.12 Influence of culture conditions on NMN production by coupled fermentation

3 討論

近年來(lái)，不僅NMN的生理活性及功能受到了廣泛的研究和關(guān)注，NMN的合成工藝也成為了合成生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，NMN雖然可以通過(guò)不同途徑、不同原料轉(zhuǎn)化而成，但其產(chǎn)率和生產(chǎn)成本仍有改善的空間。在生物法合成NMN方面，廖一波等[26]經(jīng)過(guò)同源建模和底物煙酰胺（nicotinamide，NAM）分子對(duì)接等方式評(píng)估后，選擇在E.coli中過(guò)表達(dá)紅色稍棲熱菌（Meiothermus ruber）來(lái)源的Nampt，以PRPP和NAM為底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)10 min，NMN產(chǎn)量可達(dá)34 mg/L，生產(chǎn)效率約為3 mg/（L·min）；吳旻暉等[27]建立了細(xì)胞外酶法合成技術(shù)體系：在E.coli系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了NMN合成途徑酶的分泌表達(dá)，但表達(dá)所得酶量較低，NMN產(chǎn)量為5.50 μmol/L，且合成NMN所需要的ATP完全依賴于外源ATP添加量，使得成本較高。在本研究中，通過(guò)引入基于PPK的ATP再生系統(tǒng)，構(gòu)建了全細(xì)胞雙菌耦合發(fā)酵體系，不僅減少了傳統(tǒng)酶催化過(guò)程破碎、提取、純化等步驟所需要的成本，而且用更便宜的材料Poly-P將ADP磷酸化為ATP，實(shí)現(xiàn)ATP的循環(huán)，減少了對(duì)外源ATP的需求量，使生產(chǎn)成本大大降低，且雙菌株優(yōu)化后的NMN發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)11.81 g/L，這是目前耦合發(fā)酵法合成NMN的最高產(chǎn)量報(bào)道。與2021年日本報(bào)道的6.79 g/L高出了73.93%[15]。

本研究構(gòu)建了基于E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的全細(xì)胞雙菌耦合發(fā)酵體系，不僅具有即插即用的優(yōu)點(diǎn)，而且可以根據(jù)每個(gè)批次全細(xì)胞的酶活性不同，針對(duì)性地對(duì)細(xì)胞添加量進(jìn)行調(diào)整，從而實(shí)現(xiàn)整個(gè)發(fā)酵體系的最優(yōu)，對(duì)NMN的高效、低成本合成具有重要意義。目前雙菌耦合發(fā)酵體系屬于高密度發(fā)酵，與酶法相比，產(chǎn)量仍相對(duì)較低，這可能與產(chǎn)物在細(xì)胞壁的分泌受阻相關(guān)。另外，細(xì)胞內(nèi)NMN的一小部分將被消耗以合成NAD＋用于細(xì)菌生長(zhǎng)，這對(duì)NMN的積累不利[28]。Shoji等[15]發(fā)現(xiàn)pnuC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以有效地將NMN從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外。因此，在后續(xù)完善NMN合成時(shí)將從以下3 個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化：1）從菌株構(gòu)建角度進(jìn)行，通過(guò)引入產(chǎn)物NMN外排出細(xì)胞的“膜蛋白（pnuC）”，構(gòu)建出產(chǎn)物可以快速外排的“細(xì)胞門通道蛋白”工程菌；2）阻斷NMN生成NAD＋的合成通路，實(shí)現(xiàn)NMN的積累[29]；3）從發(fā)酵工藝優(yōu)化角度，探索分批發(fā)酵和連續(xù)流加模式對(duì)NMN產(chǎn)量的影響。