張 茹 ，杜海濤 ，王曉雪 ，王 儀 ，周 倩 ，劉善新 ，王 平 #（.山東中醫(yī)藥大學藥學院，濟南 50355；.山東省中醫(yī)藥研究院，濟南 5004）

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）屬副黏病毒科，是引起嬰幼兒下呼吸道感染的常見病原體之一[1]。對于RSV 的防治，目前世界范圍內尚無特異性藥物和疫苗。中醫(yī)藥治療病毒感染具有多成分、多途徑、多靶點的獨特優(yōu)勢，其不僅針對某一特定病毒，而且可就病因病機進行辨證論治。RSV 感染屬中醫(yī)“疫病”范疇，有證據表明在寒濕環(huán)境下，機體對RSV 的易感性有所增加[2]。達原飲源自《溫疫論》，由檳榔、厚樸、草果、知母、芍藥、黃芩、甘草7味藥組成，可開達膜原、辟穢化濁，治療瘧疾、瘟疫邪伏膜原等病證?，F(xiàn)代藥理學研究表明，達原飲具有抗病毒、解熱、抗炎等多種藥理作用，可用于治療呼吸道病毒感染導致的肺部損傷[3-5]。

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)藏象學的經典理論之一。臨床調查發(fā)現(xiàn)，呼吸道病毒在引發(fā)肺部損傷的同時，還會導致患者腸道菌群失衡，出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道癥狀[6]。益生菌混合物能通過調節(jié)腸道菌群的組成來調控肺泡巨噬細胞分泌干擾素β，從而有效防治RSV 引起的肺部病變[7]?？梢姡c道菌群的改變對呼吸道病毒感染的發(fā)生、發(fā)展和治療起重要作用。

為了更好地貼合RSV 流行時的氣候條件，符合“寒濕疫”的中醫(yī)證候表現(xiàn)，本研究擬采用“寒濕造模+RSV感染”的方式建立RSV 寒濕郁肺證小鼠模型，同時在前期藥效學實驗的基礎上，通過16S rDNA 技術探索達原飲對模型小鼠腸道菌群的影響，從而闡明其潛在作用機制，為中醫(yī)藥治療RSV感染提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括TC20TM型細胞計數(shù)儀、XJ-023型酶標儀（美國Bio-Rad公司），F(xiàn)ACSAria Ⅲ型流式細胞儀（美國BD 公司），X-30R 型全能高速冷凍離心機（美國Allegra公司），A200型基因擴增儀（杭州朗基科學儀器有限公司），EPS300型電泳儀、Tanon-2500型凝膠成像儀（上海天能生命科學有限公司），NovaSeq 6000系統(tǒng)測序儀（美國Illumina公司），2100型生物分析儀（美國Agilent公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

檳榔、厚樸、草果、知母、白芍、黃芩、甘草飲片均購自山東建聯(lián)盛嘉中藥有限公司，經山東省中醫(yī)藥研究院周倩研究員鑒定，分別為棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子，木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Eils.的干燥干皮、根皮及枝皮，姜科植物草果AmomumtsaokoCrevost et Lemaire 的干燥成熟果實，百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖，毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi 的干燥根，豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。

利巴韋林原料藥（批號J1202A，純度≥99%）購自大連美侖生物技術有限公司；異氟烷（批號20092202）購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；小鼠白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號分別為A21020726、A201B20634）均購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；小鼠胃動素（motilin，MTL）、胃泌素（gastrin，GAS）ELISA 試劑盒（批號分別為20220620、20220612）均購自上海酶聯(lián)生物技術有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色套裝（批號G1003）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；4%多聚甲醛通用性組織固定液、紅細胞裂解液（批號分別為22105339、22118166）均購自北京蘭杰柯科技有限公司；藻紅蛋白標記的抗小鼠CD45R/B220 抗體、別藻青蛋白標記的抗小鼠CD8a 抗體、Alexa Fluor?700 標記的抗小鼠CD3 抗體、異硫氰酸熒光素標記的抗小鼠CD4 抗體、7-氨基放線菌素D 活性檢測染料（批號分別為B357370、B348049、B357069、B356714、B321733）均購自美國Bio-Legend公司。

1.3 病毒毒株與細胞

RSV病毒液由山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所提供，于山東中醫(yī)藥大學BSL-2實驗室傳代，置于-80 ℃冰箱保存，備用。人喉癌細胞HEP-2由山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所提供。

1.4 實驗動物

SPF級雌性BALB/c小鼠36只，體重13～15 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2021-0006。所有小鼠均飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學動物實驗中心ABSL-2實驗室。本實驗遵循3R 原則動物福利，實驗方案按山東中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理審查委員會相關規(guī)定執(zhí)行并獲批準（批件號SDUTCM20230510001）。

2 方法

2.1 達原飲制備

取達原飲經方組成中檳榔、厚樸、草果、知母、白芍、黃芩、甘草7味中藥飲片，加10倍量水浸泡30 min后，煎煮1 h，過濾；再加8倍量水煎煮45 min，過濾；合并2次濾液，濃縮至1 g/mL（按生藥總量計），于4 ℃保存，備用。

2.2 RSV擴增

待HEP-2 細胞長成單層后，加入RSV 病毒液200 μL，吸附1 h后，加入2% DMEM維持液培養(yǎng)。當90%以上細胞出現(xiàn)致細胞病變效應后，于-20 ℃與室溫之間反復凍融3 次，以4 000 r/min 離心5 min，取上清液于離心管中，于-80 ℃凍存，備用。

2.3 RSV半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量的測定

將HEP-2細胞按1×108個/L接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h；加入以10倍比稀釋12個滴度梯度的RSV病毒液，每孔100 μL，縱向重復3 孔；同時，設置正常細胞（加入等體積10% DMEM 維持液）作為對照。培養(yǎng)48 h，采用MTT 法以酶標儀于490 nm 波長處測定各孔的光密度（optical density，OD）值，重復測定4 次。根據Reed-Muench 公式[8]計算RSV 半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量（median tissue culture infective dose，TCID50）。

2.4 小鼠分組、給藥與造模

小鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，按體重分為正常組（NC組，生理鹽水）、模型組（MC 組，生理鹽水）、陽性對照組（LBM組，57.59 mg/kg利巴韋林，相當于臨床等效劑量）和達原飲低、中、高劑量組（LDYY、MDYY、HDYY 組，劑量按生藥量計分別為1.67、3.34、6.68 g/kg，相當于臨床等效劑量的0.5、1、2倍），每組6只。根據課題組前期研究方法[9]復制RSV寒濕郁肺證小鼠模型：除NC組外，其余各組小鼠均置于溫度（4±1）℃、相對濕度（90±5）%的人工氣候箱中，每天4 h，連續(xù)5 d，寒濕造模期間禁食、不禁水，刺激4 h后取出。第2次寒濕刺激結束后，除NC 組外的其余各組小鼠均吸入異氟烷麻醉，并鼻腔滴注50倍TCID50的RSV病毒液60 μL，每天1次，連續(xù)3 d；NC組小鼠同法滴鼻等體積生理鹽水。各藥物組小鼠每次滴鼻4 h后灌胃相應藥液，NC組和MC組小鼠同法灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，持續(xù)5 d。

2.5 標本采集與處理

末次給藥后，所有小鼠禁食、不禁水12 h，摘眼球取血并置于乙二胺四乙酸抗凝采血管和普通采血管中。抗凝采血管中的血樣用于流式檢測；普通采血管中的血樣于室溫下靜置2 h后，以3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，于-80 ℃保存，備用。取血后，收集小鼠結腸內容物于無菌凍存管中，于-80 ℃保存，備用。然后，處死小鼠，開胸剖取肺組織，將其左小葉用4%多聚甲醛浸潤、固定；取其右肺最大葉稱重后加入適量磷酸鹽緩沖液，勻漿后以3 000 r/min離心10 min，收集上清液，于-80 ℃保存，備用；其余肺組織于-80 ℃下保存，備用。

2.6 血清中胃腸激素水平和肺組織上清液中炎癥因子水平測定

取“2.5”項下各組小鼠血清和肺組織上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測其血清胃腸激素（MTL、GAS）水平和肺組織上清液中炎癥因子（IL-6、IL-1β）水平。

2.7 外周血淋巴細胞百分比檢測

取“2.5”項下各組小鼠外周血100 μL，加入CD8a、CD3、CD4抗體各1.25 μL，渦旋混勻，于4 ℃下避光染色20 min；加入7-氨基放線菌素D活性檢測染料適量，孵育10 min；加入紅細胞裂解液1 mL，渦旋混勻，于室溫下靜置15 min，以2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；細胞加入磷酸鹽緩沖液2 mL，以2 000 r/min離心5 min，棄取上清液；細胞以磷酸鹽緩沖液200 μL重懸后轉移至流式管中，使用流式細胞儀進行檢測其外周血淋巴細胞百分比。

2.8 肺組織病理形態(tài)觀察

取“2.5”項下各組小鼠經固定的肺組織，進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，經HE染色后，以中性樹膠封片。使用顯微鏡觀察其肺組織病理形態(tài)變化并拍照。

2.9 小鼠腸道菌群基因測序

以NC 組、MC 組、MDYY 組（前述藥效學實驗結果顯示中劑量達原飲藥效最佳）小鼠的結腸內容物為檢測樣本，采用十六烷基三甲基溴化銨法提取樣本的DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別確定所提取DNA的質量和數(shù)量。以該DNA為模板，對16S rDNA V3～V4 區(qū)進行擴增，引物序列為806R：GACTACHVGGGTATCTAATCC；341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；序列方向長度為806R-341F，產物長度為465 bp[10]。PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并回收目標片段；對純化后的PCR 產物進行評估，將合格的測序文庫梯度稀釋，根據所需測序量按相應比例混合，并經NaOH 變性為單鏈后上機測序。得到原始下機數(shù)據后，利用Overlap軟件將雙端數(shù)據進行拼接，并進行質控、嵌合體過濾。測序數(shù)據經過DADA2 去噪后，利用擴增序列變體（amplicon sequence variants，ASVs）概念構建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）表，獲得最終的ASVs特征表及特征序列并進行菌群α多樣性分析（Shannon、Simpson、Chao1、Goods_coverage 指數(shù)）、腸道結構分析和線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）。

2.10 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。數(shù)據以±s表示，對于符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；對于非正態(tài)分布或者方差不齊的數(shù)據，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 達原飲對小鼠血清胃腸激素水平和肺組織上清液中炎癥因子水平的影響

與NC 組比較，MC 組小鼠血清中MTL 水平和肺組織上清液中IL-6、IL-1β水平均顯著升高，血清中GAS水平顯著降低（P＜0.01）。與MC組比較，各藥物組小鼠血清中MTL水平（HDYY組除外）和肺組織上清液中IL-6、IL-1β 水平均顯著降低，血清中GAS 水平（HDYY 組除外）均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組小鼠血清中胃腸激素水平和肺組織上清液中炎癥因子水平測定結果（±s，n＝6，pg/mL）

表1 各組小鼠血清中胃腸激素水平和肺組織上清液中炎癥因子水平測定結果（±s，n＝6，pg/mL）

a：與NC組比較，P＜0.01；b：與MC組比較P＜0.01；c：與MC組比較，P＜0.05。

IL-1β 102.02±9.30 297.80±12.06a 172.73±9.95b 214.12±7.42b 190.34±4.41b 262.40±9.73c組別NC組MC組LBM組LDYY組MDYY組HDYY組MTL 176.61±6.65 290.32±2.99a 248.81±9.99b 253.48±5.48c 250.91±5.90b 279.71±2.96 GAS 67.79±2.06 51.44±2.01a 60.57±1.99b 57.39±4.14c 59.14±4.67b 56.11±2.71 IL-6 44.63±3.36 97.37±3.72a 75.28±5.80b 89.30±2.81c 75.55±7.40b 88.95±4.62c

3.2 達原飲對小鼠外周血淋巴細胞百分比的影響

與NC 組比較，MC 組小鼠外周血中T、B 淋巴細胞百分比均顯著降低（P＜0.01）；與MC組比較，LBM組小鼠外周血中T、B 淋巴細胞百分比均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），LDYY 組小鼠外周血中T 淋巴細胞百分比和MDYY組小鼠外周血中T、B淋巴細胞百分比均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組小鼠外周血淋巴細胞百分比測定結果（±s，n＝6，%）

表2 各組小鼠外周血淋巴細胞百分比測定結果（±s，n＝6，%）

a：與NC組比較，P＜0.01；b：與MC組比較P＜0.01；c：與MC組比較，P＜0.05。

組別NC組MC組LBM組LDYY組MDYY組HDYY組CD4+ T淋巴細胞46.86±5.05 22.54±8.72a 38.68±4.66b 32.99±9.29c 37.28±5.67b 27.35±5.39 CD8+ T淋巴細胞22.70±6.25 9.88±4.46a 21.27±5.73b 19.35±7.17c 21.02±7.41c 15.94±4.74 B淋巴細胞17.34±2.63 10.76±3.30a 16.13±2.51c 14.01±3.25 16.01±2.62c 13.62±2.16

3.3 達原飲對小鼠肺組織病理形態(tài)的影響

NC 組小鼠肺部組織結構完整，間質未見明顯的炎癥細胞滲出和淤血等病理變化；MC 組小鼠肺組織有大面積出血片狀紅染，支氣管周圍有炎癥細胞浸潤，肺泡壁明顯增厚。與MC組比較，各給藥組小鼠肺組織病理狀態(tài)均改善，尤以LBM 組和MDYY 組的改善效果更明顯。結果見圖1（LDYY組和HDYY組的圖片略）。

圖1 小鼠肺組織病理形態(tài)觀察的顯微圖（HE染色）

3.4 達原飲對小鼠腸道菌群結構和組成的影響

3.4.1 α多樣性

3組樣本的Goods_coverage指數(shù)均接近1，表明檢測深度已經基本涵蓋了樣品中的所有物種，能夠反映各樣本的微生物群落情況[10]。與NC 組比較，MC 組的Simpson、Shannon、Chao1 指數(shù)均有所增加；與MC 組比較，MDYY組上述指數(shù)均有所降低，提示達原飲干預后腸道菌群多樣性有回調趨勢。結果見表3。

表3 各組小鼠腸道菌群α多樣性分析結果（±s，n＝6）

表3 各組小鼠腸道菌群α多樣性分析結果（±s，n＝6）

組別NC組MC組MDYY組6.26±0.36 6.92±0.19 6.53±0.39 0.95±0.02 0.98±0.01 0.95±0.02 542.05±64.27 595.88±123.09 529.84±75.75 0.99 0.99 0.99 Shannon指數(shù)Simpson指數(shù)Chao1指數(shù)Goods_coverage指數(shù)

3.4.2 門水平下腸道菌群差異及相對豐度

在門水平上，BALB/c 小鼠的優(yōu)勢菌群主要有厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria等，其中厚壁菌門和擬桿菌門占比較大。與NC 組比較，MC 組厚壁菌門（P＜0.01）和變形菌門（P＞0.05）的相對豐度均有所減少，擬桿菌門（P＜0.01）和放線菌門（P＞0.05）的相對豐度均有所增加，MC 組小鼠擬桿菌門/厚壁菌門比值增大。與MC組比較，MDYY組擬桿菌門的相對豐度有所降低，厚壁菌門的相對豐度顯著增加（P＜0.01）；此外，放線菌門和變形菌門水平也有回調趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示達原飲可以改善模型小鼠的腸道菌群失調。結果見圖2。

3.4.3 屬水平下腸道菌群差異及相對豐度

在屬水平上，各組小鼠腸道菌群主要以毛螺菌屬NK4A136 組Lachnospiraceae_NK4A136_group、未分類的Muribaculaceae、另枝菌屬Alistipes、未分類的Clostridiales、未分類梭菌屬UCG-014、擬普雷沃氏菌屬Alloprevotella、絲狀菌屬Kineothrix和擬桿菌屬Bacteroides等為主。與NC 組比較，MC 組小鼠毛螺菌屬NK4A136組、絲狀菌屬和未分類Clostridiales的相對豐度均顯著減少（P＜0.01），擬桿菌屬、另枝菌屬、未分類Muribaculaceae、擬普雷沃氏菌屬的相對豐度雖有所增加，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與MC 組比較，MDYY 組小鼠毛螺菌屬NK4A136組和絲狀菌屬相對豐度均顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），未分類Muribaculaceae的相對豐度顯著降低（P＜0.01），此外未分類的Clostridiales、擬桿菌屬、另枝菌屬、擬普雷沃氏菌屬水平也呈現(xiàn)回調趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見圖3。

圖3 各組小鼠屬水平下腸道菌群結構分析

3.4.4 LEfSe多級物種差異

LEfSe結果顯示，NC組對群落結構影響較大的差異物種有厚壁菌門、梭菌目、毛螺菌科等[線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞4[11]，下同]。MC組中對群落結構影響較大的差異物種有擬桿菌綱、Muribaculaceae、Muribaculum、產酸擬桿菌等。MDYY組中對群落結構影響較大的差異物種有Lachnospiraceae_UCG-006、瘤胃球菌屬Ruminococcus等。結果見圖4。

圖4 LEfSe的LDA柱狀圖

4 討論

為了更加貼合RSV 流行時的氣候條件，符合“寒濕疫”的中醫(yī)證候表現(xiàn)，本研究采用了“寒濕造模+RSV 感染”的方式建立RSV 寒濕郁肺證小鼠模型。結果顯示，與NC 組比較，MC 組小鼠肺組織有明顯病變，血清中MTL 水平和肺組織上清液中IL-1β、IL-6 水平均顯著升高，血清中GAS 水平顯著降低。此外，模型小鼠外周血中CD4+、CD8+T淋巴細胞百分比和B淋巴細胞百分比均顯著降低，這些特征與文獻報道的“寒濕疫”動物模型相吻合[12]。

本研究使用不同劑量的達原飲對模型小鼠進行干預，發(fā)現(xiàn)小鼠肺部病理、肺組織炎癥因子水平、血清中胃腸激素水平和T、B淋巴細胞百分比均得到顯著改善，有效緩解了RSV 感染引起的肺部損傷。但達原飲并沒有呈現(xiàn)明顯的量效關系，這可能是由于高劑量達原飲苦味較大，灌胃時小鼠比較抗拒，導致給藥量不達標所致。

腸道菌群可調節(jié)宿主的免疫反應，參與人體各系統(tǒng)重要的生理功能，影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展，被稱為“人類第二基因組”。在正常情況下，宿主與腸道微生物維持著相對動態(tài)平衡；當腸道菌群失衡，會引發(fā)宿主屏障、免疫等功能喪失，從而加重甚至誘發(fā)疾病[13]。本研究運用16S rDNA 技術發(fā)現(xiàn)，與NC 組比較，MC 組小鼠的腸道菌群豐度與多樣性均有所增加。經中劑量達原飲干預后，小鼠腸道菌群的多樣性及豐度均明顯回調，表明該方能改善RSV 寒濕郁肺證小鼠的腸道菌群紊亂。BALB/c 小鼠的腸道菌群主要由四大菌門組成，其中以擬桿菌門和厚壁菌門為主，還包括變形菌門和放線菌門[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，MC 組小鼠腸道菌群的結構及豐度發(fā)生了顯著變化。首先在門水平上，MC 組小鼠擬桿菌門/厚壁菌門比值增大，這與Groves 等[15]報道的RSV 感染小鼠體內擬桿菌門相對豐度增加、厚壁菌門豐度相對減少的結果一致。厚壁門菌屬以抗性淀粉和膳食纖維為底物，產生短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），SCFAs不僅是維持腸道黏膜細胞功能的主要能量來源，對機體免疫系統(tǒng)也具有重要意義[16]。厚壁菌門產生的SCFAs以具有抗炎活性的丁酸鹽為主，從而影響免疫細胞的遷移和黏附、細胞因子表達等信號通路的激活[17]。因此，厚壁菌門豐度降低會造成腸道菌群失衡，影響機體免疫力，造成病原清除障礙，使炎癥持續(xù)存在，從而加重呼吸道病毒疾病的發(fā)展。

在屬水平上，中劑量達原飲能顯著回調有益菌毛螺菌屬NK4A136 組的相對豐度水平。既往研究發(fā)現(xiàn)，毛螺菌屬NK4A136組能夠保護顆粒物或病原微生物引起的肺損傷，其機制可能與調節(jié)免疫、減輕炎癥及氧化反應有關[18]。毛螺菌科是丁酸鹽的主要生成者，丁酸可抑制炎癥反應，保護腸黏膜。毛螺菌屬NK4A136 組的增加與亞精胺介導的腸道屏障功能增強相關[18]，其在MC組小鼠體內呈低豐度表達，可能與模型小鼠的炎癥狀態(tài)有關。本研究認為，毛螺菌屬NK4A136 組可能在減輕RSV引起的肺損傷中發(fā)揮了關鍵作用。

本研究進一步分析了NC 組、MC 組和MDYY 組腸道菌群的多級物種差異，結果發(fā)現(xiàn)，MDYY 組的主要差異物種有Lachnospiraceae_UCG-006和瘤胃球菌屬。有研究報道，Lachnospiraceae_UCG-006相對豐度與肺部疾病密切相關，肺癌患者和小鼠糞便中Lachnospiraceae_UCG-006、瘤胃球菌屬的相對豐度和SCFAs 的含量均明顯減少[19-20]。

綜上所述，達原飲可能通過改善小鼠肺組織損傷、減輕炎癥、調節(jié)胃腸激素水平和淋巴細胞百分比來減輕RSV 感染引起的肺部損傷；同時，達原飲還可能通過優(yōu)化腸道菌群結構、調節(jié)有益菌和有害菌的相對豐度來改善肺部損傷。