陳衍銘,莊 濤

(江蘇海洋大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 連云港 222000)

疼痛已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的第三大健康問(wèn)題[1].雖然有很多有效的鎮(zhèn)痛藥,但對(duì)其安全性和不良反應(yīng)的擔(dān)憂日益增加,使得其臨床應(yīng)用存在爭(zhēng)議,特別是阿片類(lèi)藥物[2].雖然對(duì)疼痛的解剖學(xué)和藥理學(xué)的研究取得了顯著的進(jìn)展,但新的無(wú)副作用的有效鎮(zhèn)痛藥還未被開(kāi)發(fā)[3].因此,疼痛的治療仍未滿足臨床需求.

鎮(zhèn)痛可以通過(guò)多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn),藥物療法是疼痛管理的主要手段之一[4].鎮(zhèn)痛機(jī)制復(fù)雜、涉及環(huán)節(jié)多(圖1),迄今還沒(méi)有一種鎮(zhèn)痛藥能符合理想鎮(zhèn)痛藥的全部要求,也尚未發(fā)現(xiàn)有任何一種鎮(zhèn)痛藥能夠?qū)λ蓄?lèi)型的疼痛有鎮(zhèn)痛效果,單一的鎮(zhèn)痛藥無(wú)法滿足理想鎮(zhèn)痛治療的全部要求,因而采用多模式鎮(zhèn)痛是醫(yī)學(xué)發(fā)展的必然結(jié)果[5].多模式鎮(zhèn)痛已經(jīng)成為臨床疼痛管理的主要發(fā)展方向之一,即通過(guò)聯(lián)合不同作用機(jī)制的鎮(zhèn)痛藥物和鎮(zhèn)痛方法,阻斷疼痛病理生理機(jī)制的不同時(shí)相和靶位,減少外周和中樞敏感化,取得最佳鎮(zhèn)痛效果,同時(shí)減少鎮(zhèn)痛藥物劑量,降低藥物不良反應(yīng)[6].因此,臨床采用鎮(zhèn)痛藥聯(lián)合應(yīng)用具有深遠(yuǎn)意義.

圖1 多模式鎮(zhèn)痛示意圖

近幾年來(lái),鉀離子通道被視為鎮(zhèn)痛藥物作用的新靶點(diǎn),臨床開(kāi)發(fā)的藥物也以鉀通道開(kāi)放劑為主[7].氟吡汀(Flupirtine,Flu)是一種Kv7鉀通道開(kāi)放劑,可通過(guò)激活內(nèi)向整流鉀離子通道,同時(shí)調(diào)整鉀離子外流,能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜電位,阻斷疼痛沖動(dòng)的傳導(dǎo)[8].20世紀(jì)80年代氟吡汀在德國(guó)首次獲批,同時(shí)在許多歐洲國(guó)家以及中國(guó)和巴西獲得許可治療各種疼痛,盡管其批準(zhǔn)的適應(yīng)癥在各國(guó)之間有所不同,但它們對(duì)肌肉骨骼疼痛、緊張性頭痛、腫瘤疼痛、痛經(jīng)相關(guān)疼痛、手術(shù)和創(chuàng)傷性疼痛均有效[9-10].此外,有報(bào)道,氟吡汀已進(jìn)入治療神經(jīng)性疼痛的II期臨床試驗(yàn)[11].然而,氟吡汀可引起肝臟損害,因此僅限于短期使用[8].

抗組胺藥物具有直接和輔助鎮(zhèn)痛活性引起廣泛關(guān)注[12].臨床研究表明,異丙嗪(Promethazine,Pro)是臨床上常用的吩噻嗪類(lèi)抗組胺藥,可作為舒馬曲坦的輔助治療劑,能有效減輕偏頭痛[13].自1996年美國(guó)FDA批準(zhǔn)非索非那定(Fexofenadine,Fex)上市以來(lái),年處方量逐年上升,現(xiàn)已高達(dá)每年20多億美元的銷(xiāo)售量,成為美國(guó)最為暢銷(xiāo)的抗過(guò)敏性藥物之一.非索非那定是特非那定的體內(nèi)代謝產(chǎn)物,由于該藥對(duì)心臟沒(méi)有毒副作用,被認(rèn)為是高效、長(zhǎng)效、低毒特點(diǎn)的第三代抗組胺藥物(選擇性組胺H1受體拮抗劑),可緩解紫杉醇引起的人類(lèi)關(guān)節(jié)痛和肌痛[14].臨床上,抗組胺藥與阿片類(lèi)藥物或非甾體抗炎藥聯(lián)合使用.

如圖2所示,越來(lái)越多的研究表明,組胺H1受體與Gq型蛋白偶聯(lián),導(dǎo)致下游磷脂酶C(PLC)的激活,以及磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)的水解,產(chǎn)生肌醇三磷酸(IP3).IP3隨后擴(kuò)散并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上IP3受體結(jié)合,以動(dòng)員存儲(chǔ)的Ca2+.Ca2+濃度的增加激活了蛋白激酶C(PKC)依賴(lài)的磷酸化,并與鈣調(diào)蛋白形成復(fù)合物(Ca2++CaM),這兩種蛋白都抑制了Kv7鉀離子通道,導(dǎo)致去極化和痛覺(jué)的增加[15-16].氟吡汀也通過(guò)激活Kv7鉀離子通道,降低神經(jīng)元的興奮性,減輕疼痛癥狀[17].

圖2 Kv7離子通道和組胺受體的潛在協(xié)同作用機(jī)理示意圖

圖3 福爾馬林實(shí)驗(yàn)示意圖

因此,本研究期望通過(guò)Kv7鉀離子通道開(kāi)放劑(氟吡汀)和抗組胺藥物(異丙嗪、非索非那定)的組合,通過(guò)多種機(jī)制產(chǎn)生協(xié)同鎮(zhèn)痛作用,以獲得更好的鎮(zhèn)痛效果,使副作用降到最低,更好的滿足臨床用藥需求.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠(體重20～30 g,雌雄兼用)購(gòu)自江蘇省邳州市東方養(yǎng)殖有限公司,分組飼養(yǎng),每筐8只小鼠,保持室內(nèi)溫度22±3 ℃,進(jìn)行12小時(shí)的光/暗循環(huán),標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室食物,飲用水可自由獲得.

1.2 藥物

氟吡汀(批號(hào):F878401,純度≥99%)購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司.福爾馬林溶液(批號(hào):20201102,分析純)購(gòu)自北京市通廣精細(xì)化工公司.所有化合物在臨用前均在無(wú)菌生理鹽水中稀釋,以防止化合物降解,給藥體積為0.1 mL/10 g.

1.3 福爾馬林實(shí)驗(yàn)

ICR小鼠隨機(jī)分組:模型組,氟吡汀低、中、高劑量(4.3、13、39 mg/kg)組,異丙嗪低、中、高劑量(1、3、5 mg/kg)組,非索非那定低、中、高劑量(10、15、20 mg/kg)組,氟吡汀-異丙嗪聯(lián)合用藥組(1/8ED50+1/8ED50、1/4ED50+1/4ED50、1/2ED50+1/2ED50),氟吡汀-非索非那定聯(lián)合用藥組(1/8ED50+1/8ED50、1/4ED50+1/4ED50、1/2ED50+1/2ED50).實(shí)驗(yàn)當(dāng)天,ICR小鼠右后爪套一個(gè)小金屬環(huán).測(cè)試前,讓小鼠在觀察室中適應(yīng)至少30分鐘[18].各組在灌胃給藥30 min后,小鼠右后足底皮下注射1%福爾馬林溶液,然后立即將小鼠放入ZH-PAN801自動(dòng)疼痛分析系統(tǒng)中(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司),記錄45分鐘內(nèi)注射福爾馬林爪每分鐘抬腳的次數(shù)[19].福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)的特征是對(duì)疼痛的雙相反應(yīng):I相(0～10 min),II相(10～45 min).鎮(zhèn)痛效果=(模型組小鼠的抬腳次數(shù)-藥物治療組小鼠的抬腳次數(shù))/模型組小鼠的抬腳次數(shù)×100%.

1.4 等輻射分析法

等輻射分析普遍認(rèn)為是臨床前研究中探索藥物間藥理相互作用的“金標(biāo)準(zhǔn)”[20].該方法核心準(zhǔn)則是選擇一個(gè)效應(yīng)水平,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了單獨(dú)使用藥物A、單獨(dú)使用藥物B以及產(chǎn)生這種效果的組合(a,b)的劑量,產(chǎn)生相同效果的劑量所連接的線稱(chēng)為等效線,而聯(lián)合后的藥物作用可以a/A+b/B=γ來(lái)表示,當(dāng)γ=1時(shí),則藥物之間的相互作用是相加;當(dāng)γ<1時(shí),則藥物之間的相互作用是協(xié)同;當(dāng)γ>1時(shí),則藥物之間的相互作用是拮抗.具體地講,ED50 mix=a+b,a=PAED50 mix,b=PBED50 mix,ED50 mix=γA/(PA+RPB),R=A/B,ED50 add=A/(PA+RPB),ED50 mix=γED50 add,所以γ=ED50 mix/ED50 add(ED50 mix,experimental ED50;ED50 add,theoretical ED50).

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以mean±S.E.M.表示,并通過(guò)GraphPad Prism7.0(San Diego,CA,USA)進(jìn)行分析.ED50值是通過(guò)使用線性回歸分析劑量-反應(yīng)曲線來(lái)計(jì)算的.梯形法則被應(yīng)用于計(jì)算時(shí)間過(guò)程曲線下的面積(AUC).多重比較采用單因素或雙因素方差分析(ANOVA),然后采用Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較.

2 結(jié)果

2.1 氟吡汀、抗組胺藥對(duì)福爾馬林致痛的影響

在小鼠福爾馬林試驗(yàn)中,評(píng)估單劑量使用氟吡汀(Flu)、異丙嗪(Pro)、非索非那定(Fex)的鎮(zhèn)痛作用.在Ⅰ相急性疼痛期,氟吡汀低、中劑量組(4.3、13 mg/kg)與模型組相比,福爾馬林Ⅰ相急性疼痛期閾值無(wú)顯著性差異(圖4A).氟吡汀(4.3、13、39 mg/kg)以劑量依賴(lài)性的方式逆轉(zhuǎn)了II相福爾馬林誘發(fā)的疼痛癥狀(圖4A),鎮(zhèn)痛效果分別為13.0%、36.2%、75.5%,氟吡汀的半數(shù)有效量ED50=18.42 mg/kg.

異丙嗪(1、3、5 mg/kg)和非索非那定(10、15、20 mg/kg)以劑量依賴(lài)的方式逆轉(zhuǎn)了II期福爾馬林誘發(fā)的疼痛行為(圖4B-C).此外,非索非那定能抑制福爾馬林誘發(fā)的疼痛的兩個(gè)階段,而異丙嗪僅在福爾馬林試驗(yàn)的第二階段產(chǎn)生顯著的抗痛覺(jué)作用.在異丙嗪組中,低中高三種劑量1、3、5mg/kg的鎮(zhèn)痛效果分別為21.91%、36.29%、55.46%,異丙嗪的半數(shù)有效量ED50=4.49 mg/kg.在非索非那定組中,低中高三種劑量10、15、20 mg/kg的鎮(zhèn)痛效果分別為41.41%、53.82%、65.62%,非索非那定的半數(shù)有效量ED50=12.98 mg/kg.

2.2 氟吡汀-異丙嗪、氟吡汀-非索非那定對(duì)福爾馬林致痛的影響

藥物組合灌胃給藥后30分鐘,小鼠足底皮下注射1%福爾馬林,通過(guò)ZH-PAN801型疼痛自動(dòng)分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè).氟吡汀-異丙嗪和氟吡汀-非索非那定在試驗(yàn)的Ⅰ相和Ⅱ相均發(fā)揮了劑量依賴(lài)性的鎮(zhèn)痛作用(圖5A-B).在氟吡汀-異丙嗪聯(lián)合用藥組中1/2ED50+1/2ED50(Pro 2.24 mg/kg+Flu 9.21 mg/kg),1/4ED50+1/4ED50(Pro 1.12 mg/kg+Flu 4.61 mg/kg),1/8ED50+1/8ED50(Pro 0.56 mg/kg+Flu 2.30 mg/kg)的II相鎮(zhèn)痛效果分別為69.42%、47.13%、22.73%,明顯高于各單獨(dú)用藥組.經(jīng)數(shù)據(jù)分析,ED50 add=11.44 mg/kg,ED50 mix=6.397 mg/kg,γ=ED50 mix/ED50 add=0.56<1,表明氟吡汀和異丙嗪聯(lián)用具有協(xié)同作用,詳見(jiàn)圖5C.在氟吡汀-非索非那定聯(lián)合用藥組中1/2ED50+1/2ED50(Fex 6.49 mg/kg+Flu 9.21 mg/kg),1/4ED50+1/4ED50(Fex3.46 mg/kg+Flu 4.61 mg/kg),1/8ED50+1/8ED50(Fex 1.62 mg/kg+Flu 2.30 mg/kg)的II相鎮(zhèn)痛效果分別為63.46%、48.66%、36.63%,明顯高于各單獨(dú)用藥組.經(jīng)數(shù)據(jù)分析,ED50 add=15.69 mg/kg,ED50 mix=8.032 mg/kg,γ=ED50 mix/ED50 add=0.51<1,表明氟吡汀和非索非那定聯(lián)用具有協(xié)同作用,詳見(jiàn)圖5D.

注：等輻射分析顯示,氟吡汀與異丙嗪或非索非那定之間有協(xié)同鎮(zhèn)痛作用(C-D).在注射1%福爾馬林前30分鐘給藥.

3 討論

臨床上迫切需要安全有效的鎮(zhèn)痛藥,由于不同藥物之間的協(xié)同鎮(zhèn)痛作用,多模式鎮(zhèn)痛提供了一種有效的方法,以獲得更好的鎮(zhèn)痛效果和安全性.本研究探討了氟吡汀和異丙嗪/非索非那定聯(lián)合使用在福爾馬林致痛模型中是否發(fā)揮協(xié)同鎮(zhèn)痛作用.

福爾馬林疼痛模型廣泛用于評(píng)估動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中化合物的鎮(zhèn)痛作用,在實(shí)驗(yàn)小鼠的右后足底皮下注射1%福爾馬林后會(huì)產(chǎn)生雙相疼痛反應(yīng),即Ⅰ相急性疼痛和Ⅱ相炎癥性疼痛[21].I相疼痛反應(yīng)是初級(jí)傷害性傳入感覺(jué)神經(jīng)元被激活的直接結(jié)果,II相反應(yīng)模擬了背角外周炎癥反應(yīng)和中樞敏化的聯(lián)合效應(yīng)[22].行為學(xué)結(jié)果顯示,足底皮下注射1%福爾馬林溶液后小鼠出現(xiàn)明顯的雙相痛,表現(xiàn)為抬腳次數(shù)顯著增加.模型組在足底皮下注射0.9%生理鹽水后小鼠沒(méi)有出現(xiàn)明顯的雙相痛,表現(xiàn)為小鼠的抬腳次數(shù)在I相和II相無(wú)顯著性差異.這與經(jīng)典福爾馬林疼痛結(jié)果相一致,表明模型建立成功.

本實(shí)驗(yàn)中,氟吡汀-異丙嗪組合和氟吡汀-非索非那定組合在I相和II相均有鎮(zhèn)痛作用,而氟吡汀和異丙嗪僅在福爾馬林實(shí)驗(yàn)的第二階段產(chǎn)生顯著的抗痛覺(jué)過(guò)敏作用.II階段被認(rèn)為至少部分參與了中樞敏化過(guò)程,而谷氨酸能傳遞在這一時(shí)期發(fā)揮了重要作用[23].氟吡汀可能通過(guò)增強(qiáng)Kv7/M電流來(lái)抑制II期谷氨酸溢出[24].此外,抗組胺藥可以通過(guò)AMPA受體(α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體)抑制谷氨酸能傳遞[25].與其他疼痛測(cè)試相比,福爾馬林測(cè)試有兩個(gè)優(yōu)勢(shì):1)很少或不需要約束,允許不受阻礙地觀察整個(gè)范圍的行為反應(yīng);2)疼痛刺激是連續(xù)的,而不是短暫的,更接近于大多數(shù)臨床疼痛.

本研究接下來(lái)可以從兩個(gè)方面展開(kāi)研究.1)通過(guò)膜片鉗實(shí)驗(yàn),研究組胺與M電流相互作用關(guān)系,進(jìn)一步探究Kv7通道開(kāi)放劑和抗組胺藥協(xié)同作用機(jī)理;2)復(fù)方片劑具有改善服用藥品依從性、提高藥物療效、減少不良反應(yīng)、降低用藥費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn),在疼痛治療中具有顯著優(yōu)勢(shì).接下來(lái)將繼續(xù)研究氟吡汀和抗組胺藥(異丙嗪、非索非那定)制備成復(fù)方片劑.

綜上所述,本研究的結(jié)果為抗組胺藥在福爾馬林致痛模型中的鎮(zhèn)痛作用提供了參考依據(jù).此外,本研究發(fā)現(xiàn)了氟吡汀和抗組胺藥的協(xié)同作用.氟吡汀與抗組胺藥的協(xié)同作用為臨床多模式鎮(zhèn)痛提供了新的選擇.